식품 중 대두단백질의 분석을 위한 효소면역측정법(ELISA)을 개발하고자 하였다. 대두단백질의 주 구성 성분이며 열에 안정한 glycinin의 acidic subunits(AS)에 대한 특이항체를 생산하였고 이를 이용하여 간접경합 ELISA(ciELISA)를 확립하였다. 시료처리조건은 urea와 DTT로 처리함으로써 용해시킨 다음 $100^{\circ}C$에서 1시간 열처리하였고 cystine을 함유한 용액으로 재생시켰다. 이러한 시료의 처리조건하에서 ISP를 $60-90^{\circ}C$까지 열처리한 시료에 대해서도 분석결과의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 표준곡선 상에서 ISP의 검출한계는 0.3 ${\mu}g/mL$이었다. 항AS 항체의 다른 단백질에 대한 반응성을 검토한 결과, 탈지분유, 카제인, 난백분말, ovalbumin에서 0.1%이하로 미약하게 반응하거나 거의 반응하지 않는 것으로 나타났다. ISP를 0.5-2%첨가한 탈지분유에 대한 ISP 분석 회수율은 평균 76%(C.V., 11.5%)였으며 ISP를 0.5-3% 첨가하여 시험 제조한 소세지의 경우 평균 83%(C.V., 19%)로 나타났고 시판 소세지 6점에 함유된 ISP의 함량은 평균 1.27%로 나타났다.
식품 중 대두단백질의 분석을 위한 효소면역측정법(ELISA)을 개발하고자 하였다. 대두단백질의 주 구성 성분이며 열에 안정한 glycinin의 acidic subunits(AS)에 대한 특이항체를 생산하였고 이를 이용하여 간접경합 ELISA(ciELISA)를 확립하였다. 시료처리조건은 urea와 DTT로 처리함으로써 용해시킨 다음 $100^{\circ}C$에서 1시간 열처리하였고 cystine을 함유한 용액으로 재생시켰다. 이러한 시료의 처리조건하에서 ISP를 $60-90^{\circ}C$까지 열처리한 시료에 대해서도 분석결과의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 표준곡선 상에서 ISP의 검출한계는 0.3 ${\mu}g/mL$이었다. 항AS 항체의 다른 단백질에 대한 반응성을 검토한 결과, 탈지분유, 카제인, 난백분말, ovalbumin에서 0.1%이하로 미약하게 반응하거나 거의 반응하지 않는 것으로 나타났다. ISP를 0.5-2%첨가한 탈지분유에 대한 ISP 분석 회수율은 평균 76%(C.V., 11.5%)였으며 ISP를 0.5-3% 첨가하여 시험 제조한 소세지의 경우 평균 83%(C.V., 19%)로 나타났고 시판 소세지 6점에 함유된 ISP의 함량은 평균 1.27%로 나타났다.
Enzyme-linked immunosorbent assay was developed for the analysis of soy protein in foods. Competitive indirect ELISA (ciELISA) was established by using specific antibodies against the heat-stable acidic subunits (AS) of glycinin. Soy proteins in each sample used in this study were solublized in the ...
Enzyme-linked immunosorbent assay was developed for the analysis of soy protein in foods. Competitive indirect ELISA (ciELISA) was established by using specific antibodies against the heat-stable acidic subunits (AS) of glycinin. Soy proteins in each sample used in this study were solublized in the presence of urea and DTT and boiled at $100^{\circ}C$ for 1hr and then were renatured with a cystine-containing solution. After these treatments, each isolated soy protein (ISP) heated at 60, 70, 80, $90^{\circ}C$ for 10 minutes showed almost the same curve as unheated one in the ciELISA. The detection limit of ISP was 0.3 ${\mu}g/mL$. Anti-AS antibodies have very low reactivities less than 0.1% toward non-meat proteins such as skim milk and casein and did not show any reactivities toward egg white powder and ovalbumin. When laboratory-made sausages containing ISP of $0.5{\sim}3%$ were assayed by ciELISA, the mean recovery was about 83% (C.V., 19%). In addition, the average content of soy protein in commercial sausages was 1.27%.
Enzyme-linked immunosorbent assay was developed for the analysis of soy protein in foods. Competitive indirect ELISA (ciELISA) was established by using specific antibodies against the heat-stable acidic subunits (AS) of glycinin. Soy proteins in each sample used in this study were solublized in the presence of urea and DTT and boiled at $100^{\circ}C$ for 1hr and then were renatured with a cystine-containing solution. After these treatments, each isolated soy protein (ISP) heated at 60, 70, 80, $90^{\circ}C$ for 10 minutes showed almost the same curve as unheated one in the ciELISA. The detection limit of ISP was 0.3 ${\mu}g/mL$. Anti-AS antibodies have very low reactivities less than 0.1% toward non-meat proteins such as skim milk and casein and did not show any reactivities toward egg white powder and ovalbumin. When laboratory-made sausages containing ISP of $0.5{\sim}3%$ were assayed by ciELISA, the mean recovery was about 83% (C.V., 19%). In addition, the average content of soy protein in commercial sausages was 1.27%.
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문제 정의
특히, 여기서 사용된.cystinee 두 가지 목적으로 사용되었는데 하나는 시료 중 과량의 DTK 제거하는 목적으로 나머지 하나는 S-S결합의 재형성에 필수적인 산화조건을 제공하고자 하는 목적이었다.
본 연구에서는 전보에 명기된 바와 같이 생산한 항 AS 항체를 이용하여 개발된 간접경합 ELISA 방법으로 ISP의 열처리에 따른 항체의 반웅성의 변화, 비육류 단백질과의 항체의 반웅성을 조사하였다. 또한 ISP의 첨가량을 달리한 소세지를 제조하여 ISP의 회수율의 확인과 시판 육제품에 대한 정량분석을 실시함으로서 육제품 내의 대두단백질 분석을 위한 면역분석법을 개발하였다.
식품 중 대두단백질의 분석을 위한 효소면역측정법 (ELISA)을 개발하고자 하였다. 대두단백질의 주 구성성분이며 열에 안정한 glycinin의 acidic subunits(AS)에 대한 특이항체를 생산하였고 이를 이용하여 간접경합 ELISA(ciELISA)를 확립하였다.
식품소재로 빈번히 사용되는 여러 종류의 다른 단백질과의 반웅성을 조사하였다. 탈지 분유, 카제인, 난백 분말, ovalbumin 대한 반응성을 ciELISA로 확인한 결과 사용된 단백질에 대한 반웅성이 0.
가설 설정
1)Correction factor converts ppm (μg/mL) to % concentration.
2)Correction factor converts ppm (gg/mL) to % concentration.
제안 방법
ISI를 분말상 식품인 탈지 분유와 소세지에 첨가한 다음 ciELISA를 통하여 회수율을 조사하였다. 탈지분유에 0.
ISP는 60-90℃까지 온도 변화를주어 열처리하였고 이를 위의 전처리과정을 거쳐 간접경합 ELISA (ciELISA)로 분석하였다. 또한 ISP에 대한 표준곡선 또한 동일한 방법으로 실험하였다.
우선 돼지고기 등심을 구입하여 지방등을 제거하였고 식염과 빙수를 첨가하였다. 난백분말은 ISP와의 량을 조절하여 0, 0.5, 1, 2, 2.5, 3%로 가하였고 반대로 ISP의 경우 3, 2.5, 2, 1, 0.5, 0%로 첨가하여 6가지 종류의 소세지를 준비하였다. 소세지 제조를 위해 모든 첨가물을 grinder로 간 다음 충진하고 75℃에서 30분간 가열처리 하였다.
개발하고자 하였다. 대두단백질의 주 구성성분이며 열에 안정한 glycinin의 acidic subunits(AS)에 대한 특이항체를 생산하였고 이를 이용하여 간접경합 ELISA(ciELISA)를 확립하였다. 시료처리조건은 urea와 DIT로 처리함으로써 용해시킨 다음 100-C에서 1시간 열처리하였고 cystine을 함유한 용액으로 재생시켰다.
가용화된 시료 중 전처리시 첨가된 시약을 제거하고 단백질을 재생시키기 위하여 보통 투석과정을 거치나 이는 단시간에 많은 수의 시료를 처리하는데 적합하지 못하다고 판단하였다. 따라서 희석의 방법을 선택하였고 방법은 cystine이 함유된 용액으로 단백질의 S-S 결합을 reformation시킴으로써 분석이 용이하게 하였다. 특히, 여기서 사용된.
또한 ISP의 첨가량을 달리한 소세지를 제조하여 ISP의 회수율의 확인과 시판 육제품에 대한 정량분석을 실시함으로서 육제품 내의 대두단백질 분석을 위한 면역분석법을 개발하였다.
본 연구에서는 이러한 분석의 문제점을 극뷱하고자 첫 번째로 대두 단백질 중에서 열에 안정한 glycinin의 11S acidic subunit 만을 분리, 정제한 후 이를 토끼에 면역하여 특이 항체를 생산하였다. 그리고 생산된 항체를 이용하여 가열처리된 대두 단백질을 분석하였으나 검출감도가 현저하게 낮아서(data 생략) 가열처리를 거친 대두 단백질의 분석을 위해서 두 번째로 불용화된 시료의 가용화 과정이 요구되었다.
5, 0%로 첨가하여 6가지 종류의 소세지를 준비하였다. 소세지 제조를 위해 모든 첨가물을 grinder로 간 다음 충진하고 75℃에서 30분간 가열처리 하였다. 제조된 소세지는 일부를 채취하여 시료처리를 하였고 ciELISA를 통하여 회수율을 조사하였다
대두단백질의 주 구성성분이며 열에 안정한 glycinin의 acidic subunits(AS)에 대한 특이항체를 생산하였고 이를 이용하여 간접경합 ELISA(ciELISA)를 확립하였다. 시료처리조건은 urea와 DIT로 처리함으로써 용해시킨 다음 100-C에서 1시간 열처리하였고 cystine을 함유한 용액으로 재생시켰다. 이러한 시료의 처리조건하에서 isp를 a)>"c까지 열처리한 시료에 대해서도 분석결과의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다.
시중에서 구입한 6종의 육가공제품(목우촌, 김밥햄, 숯불 구이햄, 휠터치, 순돈육시대, 비엔나소세지) 중의 ISP 함량을 측정하기 위해 시료를 채취하여 전처리를 실시하였고 ciELISA를 통하여 분석하였다.
소세지 제조를 위해 모든 첨가물을 grinder로 간 다음 충진하고 75℃에서 30분간 가열처리 하였다. 제조된 소세지는 일부를 채취하여 시료처리를 하였고 ciELISA를 통하여 회수율을 조사하였다
변화가 거의 없음을 확인하였다. 즉, ISP를 60, 70, 80, 90℃까지 열처리하여 본 연구의 전처리방식으로 처리한 다음 항AS 항체를 이용한 ciELISA를 실시하였고 결과는 Fig. 1과 같다. 열처리를 시킨 모든 시료가 열처리 받지 않은 시료(control)와 거의 동일한 곡선을 나타내었고 이는 ISP에 대한 전처리가 아주 효과적임을 확인할 수 있다.
분석치의 비로 회수율을 확인하였다. 즉, 탈지분유에 ISP의 첨가량을 조절하여 0, 1, 2, 3, 5%가 되도록 첨가하고 ISP가 첨가된 탈지 분유에 PBST buffer로 단백질을 용해하여 ciELISA를 실시하였고 그 결과치로부터 회수율을 구하였다.
탈지분유에 ISI를 0-5%까지 첨가하여 첨가량에 대한 분석치의 비로 회수율을 확인하였다. 즉, 탈지분유에 ISP의 첨가량을 조절하여 0, 1, 2, 3, 5%가 되도록 첨가하고 ISP가 첨가된 탈지 분유에 PBST buffer로 단백질을 용해하여 ciELISA를 실시하였고 그 결과치로부터 회수율을 구하였다.
대상 데이터
Trizma pre-set crystals, phosphate buffered saline with IWeen 20, phosphate-citrate buffer tablet, 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine dihydrochloride(TMB), goat anti-rabbit IgG- HRP conjugatee Sigma Chemical Co.(St. Louis, U.S.A.)로부터 구입하였다. Nunc사(Roskilde Denmark) 의 microtiter plate from MaxisorpTM(#446612) 와 Thermomax™ Molecular Devices 사 (Sunnyvale, CA U.
대두분말은 오대산자연식 품으로부터 구입하였고 분리대두단백은 두솔산업사로 부터 구입한 supro 500E(Protein Technologists International Co., Checkerboard Square, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. Trizma pre-set crystals, phosphate buffered saline with IWeen 20, phosphate-citrate buffer tablet, 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine dihydrochloride(TMB), goat anti-rabbit IgG- HRP conjugatee Sigma Chemical Co.
)의 microplate reader를 사용하였다. 시판 소세지는 목우촌, 김밥햄, 숯불 구이햄, 휠터치, 순돈육시대, 비엔나소세지와 돈육 또한 시중에서 구입하였다.
이론/모형
Cortex에서 제공된 방법에 준하여 대두단백의 분석을 위한 전처리를 실시하였다. 간략히 설명하면, 12g 의 시료를 취한 다음 48 g의 0.
성능/효과
1 %이하로 미약하게 반응하거나 거의 반응하지 않는 것으로 나타났다. ISP를 0.5-2% 첨가한 탈지분유에 대한 ISP 분석 회수율은 평균 76%(C.V„ 11.5%)였으며 ISP를 0.5-3% 첨가하여 시험제조한 소세지의 경우 평균 83%(C.V, 19%)로 나타났고 시판 소세지 6점에 함유된 ISP의 함량은 평균 1.27%로 나타났다.
3㎍/mL으로 나타났다. Rittenbuig 둥*은 ISP가 5-50 ㎍/mL까지 첨가될 경우 정량이 가능한 것으로 보고하였는데 이에 비해 검출감도가 월등히 민감하다고 할 수 있었다. 따라서, 본 연구의 시료처리 조건으로 ISP는 7]공처리 과정에 첨가되는 열처리의 유무에 크게 영향받지 않고 분석이 가능한 것으로 나타났다.
Hichicok 등(4)은 비육류 단백질로써 식품의 소재로 사용되는 대두단백, 우우분말, 계란분말, 밀가루 등에 대한 항대두단백 항체의 반웅성을 조사하였다. 그 결과 대두단백에 대한 항체의 반웅성을 100%로 볼 때, 우유분말에 대해서 3.6%, 난백분말에 대해서 2.8%, 밀가루에 대해서 1.1%의 반응성을 보였다. 이는 본 연구의 결과와 비교해 볼 때 반웅성의 양상은 유사하나 항AS 항체가 더욱 특이적으로 대두단백을 인식하는 것으로 밝혀졌다.
52%로 나타나 88%의 회수율을 보였다. 따라서 본 연구에서 개발한 ciELISA는 spike test 및 시료분석의 결과가 양호하여 가공식품 중의 대두단백질 분석에 충분히 적용 가능한 것으로 생각된다.
56%로 나타났다. 따라서 회수율은 각각 112, 68, 80, 70, 85%였고 평균 83%로 나타났으며 분산치는 19%로 나타났다(Bble 2). 한편, 대두를 첨가하지 않고 제소한 소세지의 분석치가 0.
4%로 나타났다(Table 1). 따라서 회수율은 각각 80, 68, 67, 88%였고 평균은 76% 로 나타났으며 분산치는 11.5%으로 양호한 회수율을 보였다.
Rittenbuig 둥*은 ISP가 5-50 ㎍/mL까지 첨가될 경우 정량이 가능한 것으로 보고하였는데 이에 비해 검출감도가 월등히 민감하다고 할 수 있었다. 따라서, 본 연구의 시료처리 조건으로 ISP는 7]공처리 과정에 첨가되는 열처리의 유무에 크게 영향받지 않고 분석이 가능한 것으로 나타났다.
시판 소세지 6종의 분석 결과 ISP 평균 함량은 1.27%(S.D„ 0.26)로 나타났다(Table 3). 특히, ISP의 함량이 1.
1과 같다. 열처리를 시킨 모든 시료가 열처리 받지 않은 시료(control)와 거의 동일한 곡선을 나타내었고 이는 ISP에 대한 전처리가 아주 효과적임을 확인할 수 있다. 김 등은 돈육에 대두단백을 첨가하여 제조한 돈육혼합물을 추출용액으로 추출한 다음 온도별로 열처리하여 ISP의 회수율을 구하였고 그 결과 75P에서 30분간 열처리한 시료의 경우 89.
시료처리조건은 urea와 DIT로 처리함으로써 용해시킨 다음 100-C에서 1시간 열처리하였고 cystine을 함유한 용액으로 재생시켰다. 이러한 시료의 처리조건하에서 isp를 a)>"c까지 열처리한 시료에 대해서도 분석결과의 변화가 거의 없는 것으로 나타났다. 표준곡선 상에서 ISP의 검출한계는 0.
이러한 조건으로 ciELISA의 ISP 분석법에 대한 열 안정성을 조사한 결과, 열처리에 따른 ciELISA 표준곡선의 변화가 거의 없음을 확인하였다. 즉, ISP를 60, 70, 80, 90℃까지 열처리하여 본 연구의 전처리방식으로 처리한 다음 항AS 항체를 이용한 ciELISA를 실시하였고 결과는 Fig.
5%으로 보고하였다. 이에 비하여 본 연구에서 실시한 ciELISA는 60-90℃까지의 열처리에도 거의 안정적인 곡선을 보여준 것으로 나타나 분석의 열 안정성 측면에서 더 효과적인 방법이라 할 수 있었다. ISP의 분석을 위한 ciELISA 표준곡선은 Fig.
그리고 생산된 항체를 이용하여 가열처리된 대두 단백질을 분석하였으나 검출감도가 현저하게 낮아서(data 생략) 가열처리를 거친 대두 단백질의 분석을 위해서 두 번째로 불용화된 시료의 가용화 과정이 요구되었다. 재료 및 방법에서 명기된 바와 같이 시료를 전처리 하여 ciELISA를 실시한 결과 검출감도가 100배정도 향상됨을 알 수 있었다. 전처리 중 가용화 과정 중에 시용되는 mea는 단백질의 소수성 부분을 노출시켜 random coil의 구조로 변화를 주는 역할을, DTT는 대두 단백질 특히, glycinin의 subunit을 연결하고 있는 S-S결합을 환원시켜 각각의 subuni료 분리하는 역할을 한다.
식품소재로 빈번히 사용되는 여러 종류의 다른 단백질과의 반웅성을 조사하였다. 탈지 분유, 카제인, 난백 분말, ovalbumin 대한 반응성을 ciELISA로 확인한 결과 사용된 단백질에 대한 반웅성이 0.1% 이하이거나 거의 없는 것으로 나타났다(Fig. 2). 따라서 식품소재로써 ISP가 다른 소재단백질과 혼입되어 사용되었을 경우에도 ISM] 대해 특이적으로 분석할 수 있을 것으로 생각된다.
3 ag/mL이었다. 항AS 항체의 다른 단백질에 대한 반응성을 검토한 결과, 탈지분유, 카제인, 난백분말, ovalbumin에서 0.1 %이하로 미약하게 반응하거나 거의 반응하지 않는 것으로 나타났다. ISP를 0.
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