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문제 정의
- 이러한 배경에서, 헛개나무의 기능성 해명과 헛개나무에서 유용 기능성 성분을 찾으려는 시도로 헛개나무 물추출물에 함유된 항미생물 및 항산화 활성 물질을 분리하여 활성 본체를 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 2 M HCl, pH 3)으로 수상 획분과 EtOAc 가용 산성 · 중성 획분(EtOAc-sohible acidic , neutral fraction)으로 분획하였다. EtOAc 가용 산성· 중성 획분을 buffer 용액(0.2M Na2HP- O4-0.2 M NaH2PO4, pH 8)으로 분배하여 EtOAc 가용 중성 획분(EtOAc-soluble neutral fraction)과 수상 획분으로 분획하였고, 얻어진 수상 획분에 0.1 M HCl을 가하여 pH 3.0으로 조절한 후 EtOAc로 분배하여 EtOAc 가용 산성 획분 (EtOAc-soluble acidic fraction과 수상획분으로 분획하였다.
- Gas chromatograph-mass spectrometiy(GC-MS) 분석은 GC-MS(Varian SATURN 4D, Walnut Creek, CA, USA) 에 GC(Varian STAR 3400CX, Walnut Creek, CA, USA)에 Rtx-1 cappillary column(0.32 mm X 30 m, Varian Instruments 2700, Walnut Creek, CA, USA)을 장착하고, ion source temperature 200°C, He 의 유속 1 mL/min, ionizing voltage 70 eV 조건으로분석하였다. TrimethylsilyKTMS) 유도체화는 Park 등⑴) 의 방법에 의해 시료 lOjxg에 시 약(pyridine :N, O-bis (trimethylsilyl)acetamide : trimethylchlorosilane, 10 : 5 : 1, v/v) 20uL을 가하여 vortex mixei로 혼합 후 60°C에서 30분 동안 반응시켰다.
- MeOH 추출물은 ethyl acetate(EtOAc)와 buffer 용액 (0.2 M glycine-0.2 M HCl, pH 3)으로 수상 획분과 EtOAc 가용 산성 · 중성 획분(EtOAc-sohible acidic , neutral fraction)으로 분획하였다. EtOAc 가용 산성· 중성 획분을 buffer 용액(0.
- Octadecylsilane(ODS) column chromatography^ 임 등(⑵의 방법으로 ODS(20g, 70-230 mesh, YMC, Kyoto, Japan)을 I^O : MeOH(3 : 7, v/v)로 shiny를 만들어 column에 충진시킨 후, I^O-MeOH 용매계의 MeOH농도를 10%씩(각 단계별 40 mL) 중가시켜 용출 분획하였다.
- Silica gel adsorption column chromatography는 Cho 등(10)의 방법으로 silica gel(86g, 70-230 mesh, column chromatograp- hy용, Merck 사, Darmstadt, Germany)을 EtOAc로 slurry로 만들어 column(2.8X33 cm)에 충진시킨 후, EtOAc-MeOH 용매계를 이동상으로 하여 MeOH 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50%(단계별 860 mL씩)까지 중가시키면서 step-wise 방법으로 용출하였다.
- 즉, DPPH(Sigma, MO, USA) 를 ethanol(EtOH)에 용해하여 제조한 용액(10이1M, 44 mg/L) 900 rL와 시료용액 100|iL을 test tube에 넣고 voltex에서 혼합한 다음 암소에서 10분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며 비교구로 a- tocopheroKSigma, MO, USA)를 사용하였으며, SC (DPPH-radical scavenging concentration)은 Sabchez-Moieno의 방법으로 구하였다. 또한, 정제과정에서 항산화 활성 검정은 시료를 TLC(Merck, siUca gel, 0.2 mm, Germany)로 전개(1-butanol-acetone-water, 91: 7 : 2, v/v)한 다음, 200|N DPPH 용액을 spray하여 탈색이 되면 양성으로 판정하였다.
- 1 mL를 무균적으로 옮겨 잘 혼합한 후 petri dish에 넣고 굳혔다. 여기에 용매에 용해시킨 시료를 적하하여 용매를 제거한 paper disc를 을린 뒤 0.85%의 식염수로 확산시켜 각 균주의적절 온도에서 12시간 배양하여 paper disc 주위의 clear zone의 크기 (mm)로 활성의 정도를 측정하였으며비교구로 benzoic acid(Hayashi Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)를 사용하였다. 정제과정에서는 항미생물 활성 검정균으로 S.
- 85%의 식염수로 확산시켜 각 균주의적절 온도에서 12시간 배양하여 paper disc 주위의 clear zone의 크기 (mm)로 활성의 정도를 측정하였으며비교구로 benzoic acid(Hayashi Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)를 사용하였다. 정제과정에서는 항미생물 활성 검정균으로 S. aureus^- E. coft를 사용하였다.
- 헛개나무 어린 줄기와 잎의 열수추출물에서 얻어진 MeOH 가용 휙분에 항미생물 및 항산화 활성을 보여, 이들 활성 본체를 규명하고자 활성물질을 solves fractionation, silica gel adsorption column chromato graphy, Sephadex LH-20 column chromatography, ODS column chromatography로 순차정제하고, HPLC 등에 의해 두 종의 활성물질을 단리하여 LC-MS, GC- MS 분석에 의해 vanillic acid와 ferulic acid로 각각 동정하였다. 두 활성물질은 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균 그리고 효모 등의 미생물에 항균 활성을 보였다.
- 헛개나무 잎과 줄기 3, 800 g에서 얻어진 분말상의 열수 추출물(494 g)을 MeOH로 용해하여 MeOH 가용 획분과 불용획분으로 분획하였다. 이들 획분을 E.
- 활성물질의 추출은 헛개나무의 어린 줄기가 포함된 잎(3.8 kg)을 위 등⑼의 방법에 따라 열수추출(95C 15분)하여 원심분리(959Xg, 15 min; VS-30000MT, Vision, Seoul, Korea)한 후, 얻어진 상등액을 동결건조(FDU-500, Eyela, Tokyo, Japan)하여 분말화된 물추출물을 얻었다. 이를 methanol(MeOH, 12 L)로 추출하여 여액을 cooling aspirator가 장착된 vacuum evaporator (N-2N, Eyela, Tokyo, Japan)로 에서 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다.
대상 데이터
- 배지는 젖산균은 LactobacilU MRS 배지(Merck, Darmstadt, Germany) 와 E. feacalis, S. pyogenes, S. mutans는 Brain Heart Infusion 배 지 (Difco, Detroit, MI, USA), 그 밖의 세균은 Nutrient 배지 (Merck), 효모는 YM배지(Difc6를 사용하였다. 배양온도는 세균의 경우 37°C 또는 30°C에서 1&시간, 효모는 30P에서 16 시간 동안 3회 반복하여 전배양을 행한 후 접종 균주로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 헛개나무(Hovenia dulcis Thunb)는 전라남도 보성군에서 재배된 식물로, 6월에 어린 줄기를 포함한 잎을 채취하여 음건한 후, homogenizer(BM-2 Nissei bio-mixer, Nihonseiki Kaiseiki LTD, Tokyo, Japan)로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
- 항미생물 활성 측정을 위해 사용한 미생물은 10종의 Gram 양성 세균(Bacillus subtilis ATCC 6633, Enterococcus faecalis KCTC 3195, Lactobacillus brevis KCTC 3102, Lactobacillus plantarum KCTC 3104, Leuconostoc mesenteroides KCTC 3100, Micrococcus luteus ATCC 9341, Pediococcus damnosus KCTC 1628, Staphylococcus aureus KCTC 1927, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus pyogenes KCTC 3096)과 3종의 Gram 음성 세균 (Escherichia coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhi ATCC 19214) 그리고 2종의 효모(Sacc/iammyces cerevisiae IFO 1850, Candida albicans ATCC 10231)을 사용하였다.
이론/모형
- Sephadex LH-20 column chromatography는 Park 등(11)의 방법으로 Sephadex LH-20(70~230 mesh, Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 MeOH-CHCl3(4:1, v/v) 용매계로 상온에서 24시간 팽윤시킨 다음, column (2X86cm, bed volume 250mL와 1.6X60cm, bed volume 125 mL)에 충진하여 동 용매계로 용출 분획하였다.
- 32 mm X 30 m, Varian Instruments 2700, Walnut Creek, CA, USA)을 장착하고, ion source temperature 200°C, He 의 유속 1 mL/min, ionizing voltage 70 eV 조건으로분석하였다. TrimethylsilyKTMS) 유도체화는 Park 등⑴) 의 방법에 의해 시료 lOjxg에 시 약(pyridine :N, O-bis (trimethylsilyl)acetamide : trimethylchlorosilane, 10 : 5 : 1, v/v) 20uL을 가하여 vortex mixei로 혼합 후 60°C에서 30분 동안 반응시켰다.
- 나타냈다. 즉, DPPH(Sigma, MO, USA) 를 ethanol(EtOH)에 용해하여 제조한 용액(10이1M, 44 mg/L) 900 rL와 시료용액 100|iL을 test tube에 넣고 voltex에서 혼합한 다음 암소에서 10분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며 비교구로 a- tocopheroKSigma, MO, USA)를 사용하였으며, SC (DPPH-radical scavenging concentration)은 Sabchez-Moieno의 방법으로 구하였다. 또한, 정제과정에서 항산화 활성 검정은 시료를 TLC(Merck, siUca gel, 0.
- 항미생물 활성의 검정은 Zaika의 paper disc((p 6 mm, Advantec, Tokyo, Japan)방법(13)으로 측정하였다. Davidson과 PaHsh의 방법에 의해 45OC로 조절된 멸균 배지 20mL에 전 배양액 0.
- 헛개나무 잎과 줄기로부터 단리된 vanillic acid와 femlic acid의 항균활성을 14종의 세균과 2종의 효모에 대하여 paper disc method 방법으로 측정하였다. 두 활성 물질은 500 gg 농도에서 대부분의 미생물에 생육을 저해하였나 그람 음성 세균보다 그람 양성 세균에 더 강한 활성을 보였다.
성능/효과
- Snillic acid는 5. aureus, S. epidermidis, B. sutilis, M. luteus, P. damnosus 등의그림양성세균, E. coli, P. aeruginosa, S. typhi 등의 그람 음성 세균에 ferulic acid보다 강한 활성을 보였고, ferulic acid는 L. mesentemides^ 젖산균과 C. albicans 의 효모에 vanillic acid보다 더 강한 활성을 보였다. 그러나, 두 활성물질은 500 gg 농도에서 E.
- paper disc method 방법으로 측정하였다. 두 활성 물질은 500 gg 농도에서 대부분의 미생물에 생육을 저해하였나 그람 음성 세균보다 그람 양성 세균에 더 강한 활성을 보였다. Snillic acid는 5.
- 분석에 의해 vanillic acid와 ferulic acid로 각각 동정하였다. 두 활성물질은 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균 그리고 효모 등의 미생물에 항균 활성을 보였다. 또한, vanillic acid와 ferulic acid의 항산화 활성은 vanillic acid보다 ferulic acid가 강한 활성을 나타내, DPPH 자유리디칼 소거능을 니타내는 농도는 fenilic gid가 14 ug/mL(SC%)을, 그리고 vanillic acid가 8 ug/ mL(SGo)이었다
- 따라서, EtOAc 가용 산성 획분은 항미생물 및 항산화 활성이 모두 나타나 이 획분에 함유된 활성 본체의 단리를 우선 시도하였다.
- aureus^ 대상으로 항미생물 활성을 검정한 결과, MeOH 가용획분에 항미생물 활성이 집중되었다. 또한, DPPH 용액에 의한 라디칼 소거능을 검정한 결과, 헛개나무 잎과 줄기의 MeOH 가용획분에 활성을 나타내 헛개나무 물추출물의 MeOH 가용획분은 항미생물 및 항산화 활성물질을 함유하고 있었다.
- 두 활성물질은 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균 그리고 효모 등의 미생물에 항균 활성을 보였다. 또한, vanillic acid와 ferulic acid의 항산화 활성은 vanillic acid보다 ferulic acid가 강한 활성을 나타내, DPPH 자유리디칼 소거능을 니타내는 농도는 fenilic gid가 14 ug/mL(SC%)을, 그리고 vanillic acid가 8 ug/ mL(SGo)이었다
- aureus6^ 대한 항미생물 활성을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성 획분에 활성이 집중되었다. 또한, 이들 획분을 대상으로 DPPH 자유라디칼 소거능을 검정한 결과, 50%의 DPPH 자유라디칼 소거능(SCg)은 EtOAc 가용 산성 획분이 93 ng/mL, EtOAc 가용 중성 획분이 86gg/mL, 수상 획분이 546ug/ml로 나타나 항산화활성물질은 EtOAc 가용 획분에 집중되었다.
- 분리된 활성물질 1의 물질규명을 위해, LC-MS에 의해 측정된 EI-MS 분석 결과, M*이온이 base peak로서 168에 관찰되었으며, 특이적인 fragment ion으로 m/z 153, 138, 125, 108, 97에 이온이 관측되어, CsHgO, 의분자식 을 갖는 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid (vanilUc acid>의 EI-MS 스펙트럼과 일치하였다. 이를 확인하고자, 활성물질 1의 일부를 TMS유도체로 만든 다음, GC-MS에 의해 EI-MS 분석 결과(Fig.
- 이 활성 획 분(226.7 mg)을 ODS column chromato- graphyf 이용하여 MeOH-HQ의 용매계로 용출획분한 결과, 50% MeOH 용출획분(79.7 mg, 활성물질 1 로 명명 )과 60% MeOH 용출획분(61.5 mg, 활성물질 2로 명명에 활성을 나타내 활성물질이 분리되었다.
- 불용획분으로 분획하였다. 이들 획분을 E. coli와 S. aureus^ 대상으로 항미생물 활성을 검정한 결과, MeOH 가용획분에 항미생물 활성이 집중되었다. 또한, DPPH 용액에 의한 라디칼 소거능을 검정한 결과, 헛개나무 잎과 줄기의 MeOH 가용획분에 활성을 나타내 헛개나무 물추출물의 MeOH 가용획분은 항미생물 및 항산화 활성물질을 함유하고 있었다.
- 이를 확인하고자, 활성물질 1의 일부를 TMS유도체로 만든 다음, GC-MS에 의해 EI-MS 분석 결과(Fig. 1), M*가 312에 그리고 fragment ion이 m/z 297(base peak), 282, 267, 253, 223에 나타나, vanillic acid의 COOH 기와 OH기에 TMS가 도입된 TMS ester TMS ether 구조M+ 312)로 관측될 뿐만 아니라 GC 의 H1L58분) 또한 표품의 tR과 일치하여 활성물질 1 의 구조가 vanillic acid임이 재확인되었다.
- 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid(ferulic acid)의 EI-MS spectra와 일치하였다. 이를 확인하고자, 활성물질 2의 일부를 상기의 방법으로 TMS유도체로 만들고 GC-MS분석하여 얻어진 EI-MS spectrum(Fig. 2)은 M+ 이온이 m/z 338에 base pe아로 괸측되었으며, fragment ion이 m/z 323, 308, 293, 249에 이온을 나타내 feruUc acid의 COOH기와 OH기에 TMS가 도입된 TMS ester 와 TMS ether 구조(#)로 관측될 뿐만 아니라, GC의 “(14.61 분) 또한 표품의 4과 일치하여 활성물질 2의 구조가 ferulic acid임이 재확인되었다. 이상의 LC-MS, GC-MS분석에 의해 헛개나무 잎과 줄기의 물추출물로부터 항미생물 및 항산화 활성 물질로 분리된 활성물질 1과 활성물질 2는 각각 vanilUc acid와 ferulic acid로 동정되었다.
- 61 분) 또한 표품의 4과 일치하여 활성물질 2의 구조가 ferulic acid임이 재확인되었다. 이상의 LC-MS, GC-MS분석에 의해 헛개나무 잎과 줄기의 물추출물로부터 항미생물 및 항산화 활성 물질로 분리된 활성물질 1과 활성물질 2는 각각 vanilUc acid와 ferulic acid로 동정되었다.
- 69 g)을 EtOAc-MeOH 용매계의 siUca gel adsorption column chromatography로 용출분획한 결과, 항산화 및 항미생물 활성은 100% EtOAc 용출획분에서 활성이 나타났다. 이어 이 활성획분(3.15 g)을 Sephadex LH-20 column chromatography(bed volume,250mL)로 분리한 결과, 항미생물 및 항산화 활성은 Vfe/Vt(elution volume/bed volume) 0.96-1.06의 위치에서 용출된 획분에 활성을 나타났다.
- 이어, MeOH 가용휙분을 용매분획하여 얻어진 EtOAc 가용 산성 획분, EtOAc 가용 중성 획분, 0.2 M glycine buffer 획분(수상 획분)을 대상으로 E. coli와 S. aureus6^ 대한 항미생물 활성을 검정한 결과, EtOAc 가용 산성 획분에 활성이 집중되었다. 또한, 이들 획분을 대상으로 DPPH 자유라디칼 소거능을 검정한 결과, 50%의 DPPH 자유라디칼 소거능(SCg)은 EtOAc 가용 산성 획분이 93 ng/mL, EtOAc 가용 중성 획분이 86gg/mL, 수상 획분이 546ug/ml로 나타나 항산화활성물질은 EtOAc 가용 획분에 집중되었다.
- 이어, 활성물질 2의 LC-MS에 의해 측정된 EI-MS 분석치는, M* 이온이 m/z 194에 그리고 base peak로서 관찰되었으며, fragment ion으로 m/z 179, 133, 123, 107, 89에 이온이 관측되어, C10H10O4Sl 분자식을갖는 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid(ferulic acid)의 EI-MS spectra와 일치하였다. 이를 확인하고자, 활성물질 2의 일부를 상기의 방법으로 TMS유도체로 만들고 GC-MS분석하여 얻어진 EI-MS spectrum(Fig.
- 항미생물 및 항산화 활성을 갖는 EtOAc 가용 산성획분(5.69 g)을 EtOAc-MeOH 용매계의 siUca gel adsorption column chromatography로 용출분획한 결과, 항산화 및 항미생물 활성은 100% EtOAc 용출획분에서 활성이 나타났다. 이어 이 활성획분(3.
- 헛개나무 잎과 줄기에서 얻어진 vanillic acid와 feruHc acid를 DPPH 자유라디칼 소거능으로 나타낸 항산화 활성을 검정한 결과, 50%의 DPPH 자유라디칼소거능 (SC50)은 ferulic acid가 14 ug/mL, a-tocopherol 이 8pg/mL로 측정되었으나 vanillic acid는 100ug/mL 에서 SC10정도의 활성을 나타내, ferulic acid은 vanillic acid보다 강한 항산화 활성을 나타냈으며 a- tocopherol보다는 약간 낮은 항산화 활성을 나타냈다(Fig. 3).
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