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문제 정의
- 13) 또 한편 GFP를 model 항원으로 사용하여 경구용 백신 수송체를 개발하고자 하는 연구는 아직 없었다. 그러므로 이 연구에서는 경구용 백신 수송체를 개발하기 위한 연구의 일환으로 GFP를 model 항원으로 하여 입자 크기가 10pin 이하인 경구용 microsphere의 제조 가능성을 알아보고자 여러 가지 제조 조건을 달리하여 제조된 mirosphere의 크기, 모양 및 봉입효율을 평가하였다.
제안 방법
- 이러한 제조방법은 염화칼슘 용액 중의 Ca2+와 alginate 분자 간의 상호작용으로 alginate 분자들이 가교되어 hydrogel을 형성하는 원리를 이용하였다.3) 또한, 10 μm 이하의 microsphere형 백신 수송체의 제조 최적 조건을 얻기 위해서 microsphere의 특성에 영향을 줄 것으로 예상되는 조건들을 변화시키면서 아래와 같은 실험을 행하였다.
- 4mg/mZ) 1 mZ와 혼합한 용액을 spray상으로 하였다. 500 m/ beakeH 5% 염화칼슘 용액 80ml를 가하고 동시에 자석교반기로 일정한 속도로 교반하면서 spray 상을 spray 하여 microsphere를 제조하였다. 제조된 microsphere를 에탄올로 세척한 후 상온에서 건조하였다.
- CaCl2의 농도-Nozzle pressure 3kgf/㎠와 nozzzle opening 각도를 135도로 고정시킨 조건에서 염화칼슘 용액의 농도를 각각 3%, 5% 및 7%로 변화시키면서 microsphere를 제조하였다.
- GFP 함유 microspheres의 morphology - 1% 알진산나트륨을 사용하여 제조된 GFP 함유 microspheres를 주사형 전자 현미경으로 관찰하였다. Figure 7의 상단 사진은 3000배로 확대한 사진인데 형태는 약간 구형이고 입자 크기는 약 10 Jim로 크기가 큰 microspheres의 사진이다.
- Nozzle opening 각도 - Nozzle pressure를 3kgf/㎠로 고정시킨 조건에서 spray 하는 nozzle의 opening 각도를 각각 90, 135 및 180도로 변화시키면서 microsphere를 제조하였으며, 제조 조건을 Table Ⅰ에 나타내었다.
- Nozzle의 g력 -Nozzzle opening 각도를 135도로 고정시킨 조건에서 nozzle의 분사압력을 각각 1, 2, 3 및 4kgf/㎠로 변화시키면서 microsphere를 제조하였다.
- Spray method를 이용한 알진산나트륨 microspheres 제조의 최적 조건을 얻기 위해서 본 연구에서는 nozzle의 압력, 염화칼슘의 농도 그리고 nozzle opening 각도를 변화시키면서 실험을 하였다. 그 중에서 최적 조건을 선택하여 GFP 함유된 microsphere를 제조하여 그에 대한 입자 크기와 봉입율을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 개발하기 위해 spray 방법을 사용하였다. Spray 방법은 1% 알진산나트륨 용액 19ml를 자석 교반기로 일정한 속도로 교반 중인 염화칼슘 용액 80mZ에 spray하여 microsphere를 제조하였다. 제조된 microsphere를 분리한 다음 에탄올로 세척하여 상온에서 건조하였다.
- 실험을 하였다. 그 중에서 최적 조건을 선택하여 GFP 함유된 microsphere를 제조하여 그에 대한 입자 크기와 봉입율을 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 따라서 본 실험조건에서는 nozzle의 압력은 3 kgf/㎠, 염화칼슘의 농도는 5%로 그리고 nozzle opening 각도는 90도를 최적의 제조조건으로 선택하여 GFP 함유 microspheres를 제조하였다.
- 시료를 금 증칙기(IB-3 ion coater)에 넣고 진공도 0.15 torr 및 고전압(800-1500V 8mM)하에서 5분간 순금으로 입자 표면을 피복하여 촬영용 시료로 하였다. 이후 시료를 주사형 전자 현미경 본체 내에 고정시키고 15kV에서 적당한 배율로 입자 표면을 관찰하였다.
- 앞의 실험을 통하여 최적의 nozzle 압력(kgf/㎠), 염화칼슘 농도 그리고 nozzle opening 각도를 각각 찾아내고 GFP를 model 항원으로 사용하여 알진산나트륨 농도를 변화시키면서 Table II와 같은 제조조건으로 microsphere를 제조하였다. 제조방법은 1% 알진산나트륨 용액 19ml를 취하여 GFP (3.
- 이 연구에서는 microsphere 크기를 최소로 하는 제조 조건을 얻기 위해서 nozzle pressure, 염화칼슘 농도 그리고 nozzle opening 각도를 각각 변화시키면서 micro spheres를 제조하였다. 제조된 microspheres는 particle size analyser를이용하여 입자 크기를 분석하고 그래프로 나타내어 필요한 크기의 microspheres의 제조조건을 얻어냈다.
- 제조된 microsphere를 분리한 다음 에탄올로 세척하여 상온에서 건조하였다. 이러한 제조방법은 염화칼슘 용액 중의 Ca2+와 alginate 분자 간의 상호작용으로 alginate 분자들이 가교되어 hydrogel을 형성하는 원리를 이용하였다.3) 또한, 10 μm 이하의 microsphere형 백신 수송체의 제조 최적 조건을 얻기 위해서 microsphere의 특성에 영향을 줄 것으로 예상되는 조건들을 변화시키면서 아래와 같은 실험을 행하였다.
- 15 torr 및 고전압(800-1500V 8mM)하에서 5분간 순금으로 입자 표면을 피복하여 촬영용 시료로 하였다. 이후 시료를 주사형 전자 현미경 본체 내에 고정시키고 15kV에서 적당한 배율로 입자 표면을 관찰하였다.
- 입자의 morphology와 표면 구조를 검토하기 위하여 제조된 GFP 함유 microsphere를 주사형 전자현미경으로 관찰하였다. 시료를 금 증칙기(IB-3 ion coater)에 넣고 진공도 0.
- 제조된 GFP 함유 microsphere를 5% 염화칼슘 용액 일정량에 현탁시켜 particle size analyser를 이용하여 입자 크기를 분석하였다. 분석 결과는 number mean diameter(NMD)와 표준편차로 나타내었다.
- 제조된 GFP 함유 microsphere의 현탁액을 3500rpm에서 약 15 min 간 윈심 분리하여 상층용액을 형광광도기로 excitation 파장 488 nm, emission 파장 510nm에서 intensity를 측정하였다. 봉입 효율(A)의 계산방법은 아래 식으로 계산한다.
- 제조된 microspheres는 particle size analyser를이용하여 입자 크기를 분석하고 그래프로 나타내어 필요한 크기의 microspheres의 제조조건을 얻어냈다.
- spray 방법을 이용하여 제조하였다. 제조된 tni-crospheres의 현탁액을 일정량을 취하여 particle size analyser이용하여 입자 크기를 분석하였다. 알진산나트륨의 농도를 각각 0.
대상 데이터
- 사용된 시약은 알진산나트륨(Junsei Chemical Co. Ltd., Japan), 무수염화칼슘(Duksan Pure Chemical Co. Ltd. Korea), GFP(충남대학교 자연과학대학 미생물학과에서 공급받음)을 사용하였다.
- 실험에 사용된 주된 기기로는 HS spray system (Koran), scanning electron microscope (1S1-SX-40, 주식회사 명석 제작소, Japan), particle size analyser (Microtrac-X100, Microtrac®, Honeywell, USA), small high speed refrigerated centrifuge (Mega 17R, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Korean), fluorescent photometer (Jasco FP-750, Japan)를 사용하였다.
- 제조방법은 1% 알진산나트륨 용액 19ml를 취하여 GFP (3.4mg/mZ) 1 mZ와 혼합한 용액을 spray상으로 하였다. 500 m/ beakeH 5% 염화칼슘 용액 80ml를 가하고 동시에 자석교반기로 일정한 속도로 교반하면서 spray 상을 spray 하여 microsphere를 제조하였다.
데이터처리
- 분석하였다. 분석 결과는 number mean diameter(NMD)와 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- GFP 함유 microspheres의 크기 - GFP 함유 micro-spheres는 spray 방법을 이용하여 제조하였다. 제조된 tni-crospheres의 현탁액을 일정량을 취하여 particle size analyser이용하여 입자 크기를 분석하였다.
- 제조 과정 중에 항체에 손상을 줄 수 있는 유기용매나 열을 사용하지 않고 봉입 효율이 높으면서 Peyer's patch에 잘 uptake될 수 있는 10 μm 이하의 microspheres형 백신 수송체를 개발하기 위해 spray 방법을 사용하였다. Spray 방법은 1% 알진산나트륨 용액 19ml를 자석 교반기로 일정한 속도로 교반 중인 염화칼슘 용액 80mZ에 spray하여 microsphere를 제조하였다.
성능/효과
- 1. 경구용 백신 수송체용 microspheres의 제조에 있어서 본 연구에서 사용한 spray method를 이용하면 유기용매를 사용하지 않고 microspheres를 제조할 수 있다
- 2. 알진산나트륨 농도를 1%(w/v)로 하였을 때 입자의 모양은 구형이었으며 입자 크기의 범위는 3-10㎛이었고, 봉입 효율이 70% 이상으로 비교적 양호하였다.
- 3. 이 연구에서 사용한 방법은 GFP와 같은 단백질의 microsphere 제조용으로 안정한 방법이라 사료된다.
- 따라서 본 실험에서 제조한 microspheres의 크기 범위는 약 3㎛~10㎛ 정도이었다. 결과적으로 이러한 spraying 방법을 이용하면 입자 크기가 작고 봉입율이 높은 균일한 구형의 rWcrespheres를 제조할 수 있다고 생각한다.
- 0pm로 가장 작다. 따라서 본 실험에서 제조한 microspheres의 크기 범위는 약 3㎛~10㎛ 정도이었다. 결과적으로 이러한 spraying 방법을 이용하면 입자 크기가 작고 봉입율이 높은 균일한 구형의 rWcrespheres를 제조할 수 있다고 생각한다.
- 여기서 입자 분포곡선이 binodal 형태를 나타내는 것으로도 확인할 수 있었다. 또한 제조과정 중에 사용되는 3, 5 및 7% 염화칼슘 용액에 GFP를 용해시켜 형광광도기로 emission 스펙트럼을 확인해 본 결과 스펙트럼의 피이크(510nm)가 변하지 않는 것으로 보아 이 조건에서 GFP가 변성되지 않음을 알 수 있었다.
- 5% 증가할 때마다 GFP의 봉입 효율은 약 10%씩 증가하는 양상을 나타내었다. 또한, 건조된 microsphere 5 mg을 10 mM 구연산나트륨 용액 100 ml에 가하여 1시간 동안 교반하여 microsphere를 녹인 다음 형광광도기로 스펙트럼을 관찰한 결과 피이크(510 nm)의 모양이 변하지 않음을 확인할 수 있었으므로, 이 제조방법은 GFP가 변성되지 않는 안정한 방법이라고 생각된다.
- Figure 3에서는 8% 염화칼슘의 농도 이용하여 제조된 입자 분포를 나타냈다. 이러한 결과를 보면 염화칼슘의 농도가 증가할수록 입자 크기가 감소했지만 염화칼슘의 농도가 7% 이상에서는 응집된 microspheres가 많이 존재하였다. 여기서 입자 분포곡선이 binodal 형태를 나타내는 것으로도 확인할 수 있었다.
- 356㎛로 나타났다(Figure 5). 즉, 알진산나트륨의 농도가 증가할수록 입자 크기가 증가했지만 알진산나트륨의 농도가 1.5% 이상이면 알진산나트륨 용액의 점도가 높아서 spray하기가 어렵고 입자 크기는 10㎛보다 큰 입자도 상당수 있음을 알 수 있었다.
- 653㎛로 나타났다. 즉, 압력이 3 kgf/㎠일 때 입자 크기가 가장 작았으며, 압력이 증가할수록 입자 크기가 작아졌지만 3 kgf/cm2 부터 매 1 kgf/㎠씩 증가시켰을 때 입자 크기가 더 이상 작아지지 않고 거의 일정하였다.
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