[논문]형질전환 닭에서 GFP 유전자 전이 연구

장예진; 지미란; 전미향; 김점순; 김경운; 한덕우; 정학재; 양병철; 류재규; 박진기; 김태완; 변승준

doi:10.5536/kjps.2012.39.3.241

형질전환 닭에서 GFP 유전자 전이 연구
Analysis of the Foreign Gene Transmission in the GFP Transgenic Chickens 원문보기

한국가금학회지 = Korean journal of poultry science, v.39 no.3, 2012년, pp.241 - 244

장예진 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 지미란 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 전미향 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 김점순 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 김경운 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 한덕우 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 정학재 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 양병철 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 류재규 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 박진기 (국립축산과학원 동물바이오공학과) , 김태완 (대구가톨릭대학교 의과대학) , 변승준 (국립축산과학원 동물바이오공학과)

초록
AI-Helper

본 연구는 형질전환 닭에서 주입한 외래 유전자의 세대간 전이와 발현 양상을 조사하고자 하였다. 외래 유전자 전이 양상 조사는 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉을 최초 부계로 사용하여 최종적으로 제9세대(G8) 형질전환 닭을 연속적으로 생산하면서 GFP 유전자 전이 양상을 조사하였다. 형질전환 병아리 유전 분석은 자외선 램프 아래에서 부화한 병아리들의 날개, 부리와 다리에서 녹색형광단백질을 발현하는 병아리들만을 형질전환으로 선발하였다. 형질전환 닭에서 외래 유전자 전이율은 대략 38~58%이었다. 이는 유전자 전이가 멘델의 유전 법칙을 따르고 있음을 보여주고 있다. 연구 결과는 GFP 유전자가 유전자 침묵 없이 멘델의 유전 법칙에 따라 다음 세대로 계속 전이와 발현된다는 것을 보여 주고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was performed to analyze the generational transmission and the expression of the foreign gene in the GFP transgenic chickens. The transmission rate and the expression of the GFP gene was investigated from the GFP transgenic rooster (G2) as the first founder to the ninth (G8). Analysis of GFP expression in hatched chickens was used the UV lamp. When GFP was expressed in the wings, bill and legs of a chick, the bird only was selected as a transgenic chick. The average transmission rate of the overall transgenic was 38~58%. These results showed that the transmission of the GFP gene in the transgenic chickens in accordance with the laws of Mendel's continues to the next generation without gene silencing.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 2010; Scott and Lois, 2005). 그러나 본 연구는 기존의 연구들보다 훨씬 많은 형질전환 닭 후대 세대들을 생산하였고, 이들에서 주입한 외래 유전자가 안정적으로 후대계로 전달되고 발현되는지를 처음으로 조사하였다. 총 6세대(G3～G9)에서 걸쳐 생산된 형질전환 닭들의 형질전환 비율은 각각의 세대별로 38～58%이었다.
따라서 본 연구는 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 형질전환 닭을 이용하여, 형질전환 닭에 도입된 외래 유전자인 GFP가 닭의 다음 세대로 안정적으로 전이되고, 생산된 후대 형질전환 닭들에서도 정상적으로 단백질을 발현하는지를 조사하고자 하였다.
통계 분석 결과, 전체적인 암 수 비율이 기대 비율인 1:1의 범위를 벗어나지 않는 것으로 나타남에 따라 상대적으로 개체수가 적었던 제4세대(15수)와 제8세대(13수)에서 수컷의 비율이 높은 현상은 세대의 개체수가 많았더라면 일반적인 기대 비율인 1:1에 가깝게 나타나게 될 것으로 사료되어진다. 본 연구는 형질전환 닭에서 인위적으로 주입된 외래 유전자가 닭의 세대간 전이가 명확하게 일어나며, 다음 세대로 전이된 유전자의 지속적으로 안정적인 발현 여부를 GFP 형질전환 닭을 이용하여 조사하고자 하였다. 비록 형질전환 닭에서 주입한 외래 유전자의 후대 병아리로의 전이율을 조사한 연구들은 많이 있었으나, 대부분이 제3세대(G2)까지이며, 많게는 제5세대(G4)까지 후대들을 생산하고 조사한 보고들이 있었다.
본 연구는 형질전환 닭에서 주입한 외래 유전자의 세대간 전이와 발현 양상을 조사하고자 하였다. 외래 유전자 전이 양상 조사는 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉을 최초 부계로 사용하여 최종적으로 제9세대(G8) 형질전환 닭을 연속적으로 생산하면서 GFP 유전자 전이 양상을 조사하였다.

제안 방법

1차 분석은 육안으로 자외선 램프 아래에서 병아리들을 관찰하고, 날개, 부리와 다리에서 녹색형광단백질을 발현하는 병아리들만을 선발하였다. 2차 분석은 선발된 병아리들을 PCR 방법으로 재검증하였다. PCR 유전분석은 육안으로 선발된 병아리들의 날개 정맥에서 혈액 채취, genomic DNA 분리(Genomic DNA purification kit, Promega), PCR의 순서로 실시하였다.
2). PCR 유전 분석 결과는 육안으로 선발된 15수의 병아리들이 모두 PCR 유전 분석에서 형질전환 양성으로 판정됨에 따라 이후부터는 분석의 편의성을 고려하여 육안 분석만으로 형질 전환 여부를 판별하였다.
2차 분석은 선발된 병아리들을 PCR 방법으로 재검증하였다. PCR 유전분석은 육안으로 선발된 병아리들의 날개 정맥에서 혈액 채취, genomic DNA 분리(Genomic DNA purification kit, Promega), PCR의 순서로 실시하였다. PCR은 GFP-F: 5-GACTTCAAGGAGGACGGCAACA-3, GFP-R: 5-TCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAG-3 primer들과 taq-polymerase로 AccuPrime SuperMix II(Invitrogen)를 사용하여 94℃-2분, 94℃-45초, 59℃-30초, 68℃-20초의 조건에서 30회 증폭하는 방법으로 수행하였다.
PCR 유전분석은 육안으로 선발된 병아리들의 날개 정맥에서 혈액 채취, genomic DNA 분리(Genomic DNA purification kit, Promega), PCR의 순서로 실시하였다. PCR은 GFP-F: 5-GACTTCAAGGAGGACGGCAACA-3, GFP-R: 5-TCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAG-3 primer들과 taq-polymerase로 AccuPrime SuperMix II(Invitrogen)를 사용하여 94℃-2분, 94℃-45초, 59℃-30초, 68℃-20초의 조건에서 30회 증폭하는 방법으로 수행하였다.
제9세대(G8) 형질전환 닭들은 이와 같은 방법으로 총 6번의 교배를 통하여 생산되었다. 다음 세대 형질전환 닭에 필요한 부계 닭 선발은 성 성숙이 완전히 이루어진 시점인 생후 8개월 전후에서 생존하고 있는 형질전환 수탉들 가운데 무작위 선택 방법을 이용하였고, 선발된 부계 수탉 1수의 정액만을 정상의 암탉들에 인공수정하는 방법으로 진행하였다. 부화한 병아리들의 유전분석은 genomic PCR과 육안 분석을 병행하였다.
다음 세대 형질전환 닭에 필요한 부계 닭 선발은 성 성숙이 완전히 이루어진 시점인 생후 8개월 전후에서 생존하고 있는 형질전환 수탉들 가운데 무작위 선택 방법을 이용하였고, 선발된 부계 수탉 1수의 정액만을 정상의 암탉들에 인공수정하는 방법으로 진행하였다. 부화한 병아리들의 유전분석은 genomic PCR과 육안 분석을 병행하였다. 1차 분석은 육안으로 자외선 램프 아래에서 병아리들을 관찰하고, 날개, 부리와 다리에서 녹색형광단백질을 발현하는 병아리들만을 선발하였다.
외래 유전자 전이 및 발현 양상 조사는 heterozygote인 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉을 최초 부계로 사용하여 최종적으로 제9세대(G8) 형질전환 닭 생산까지 총 5년에 걸쳐 6세대를 연속적으로 생산하면서 형질전환 닭에서 GFP 유전자 전이 및 발현을 조사하였다. 제4세대(G3) 형질전환 닭은 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉에서 마사지법으로 채취한 정액을 실용계인 하이라인 브라운 암컷들에 인공수정한 후, 생산된 수정란들을 21일 동안 부화기에서 배양하여 병아리를 부화하는 방법으로 생산하였다.
본 연구는 형질전환 닭에서 주입한 외래 유전자의 세대간 전이와 발현 양상을 조사하고자 하였다. 외래 유전자 전이 양상 조사는 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉을 최초 부계로 사용하여 최종적으로 제9세대(G8) 형질전환 닭을 연속적으로 생산하면서 GFP 유전자 전이 양상을 조사하였다. 형질 전환 병아리 유전 분석은 자외선 램프 아래에서 부화한 병아리들의 날개, 부리와 다리에서 녹색형광단백질을 발현하는 병아리들만을 형질전환으로 선발하였다.
1은 선발된 제9세대(G8) 형질전환 병아리들에서 GFP 발현 모습을 보여주고 있다. 처음 제4세대(G3) 형질전환 닭의 유전 분석은 자외선 램프를 이용한 육안 판별과 부화한 병아리들의 혈액에서 추출한 genomic DNA를 이용한 RCR 유전 분석 방법을 병행하였다(Fig. 2). PCR 유전 분석 결과는 육안으로 선발된 15수의 병아리들이 모두 PCR 유전 분석에서 형질전환 양성으로 판정됨에 따라 이후부터는 분석의 편의성을 고려하여 육안 분석만으로 형질 전환 여부를 판별하였다.

대상 데이터

부화한 병아리들의 유전분석은 genomic PCR과 육안 분석을 병행하였다. 1차 분석은 육안으로 자외선 램프 아래에서 병아리들을 관찰하고, 날개, 부리와 다리에서 녹색형광단백질을 발현하는 병아리들만을 선발하였다. 2차 분석은 선발된 병아리들을 PCR 방법으로 재검증하였다.
, 2007). 그리고 후대 형질전환 닭 생산에 필요한 암탉들은 국립축산과학원 동물바이오공학과 계사에 보유하고 있는 실용계인 하이라인 브라운을 사용하였다.
본 연구에 사용한 닭은 2005년 대구가톨릭대학교에서 분양받은 GFP 형질전환 닭이었다. GFP 유전자는 RSV(Rous sarcoma virus) 프로모터에 조절되어 녹색형광단백질을 닭의 모든 조직에서 발현하도록 디자인되었고, 재조합 retrovirus에 의하여 닭 수정란으로 전달된 GFP 유전자는 형질전환 닭의 26번 염색체에 provirus 형태로 존재하였다(Kwon et al.
인공수정 방법으로 생산된 후대병아리들 가운데 형질전환 병아리는 자외선 램프 아래에서 부리, 볏, 다리, 그리고 날개 안쪽 부위에 선명하게 녹색형광단백질이 발현됨을 확인하였고, 이들만을 형질전환 병아리로 선발하였다. Fig.
외래 유전자 전이 및 발현 양상 조사는 heterozygote인 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉을 최초 부계로 사용하여 최종적으로 제9세대(G8) 형질전환 닭 생산까지 총 5년에 걸쳐 6세대를 연속적으로 생산하면서 형질전환 닭에서 GFP 유전자 전이 및 발현을 조사하였다. 제4세대(G3) 형질전환 닭은 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉에서 마사지법으로 채취한 정액을 실용계인 하이라인 브라운 암컷들에 인공수정한 후, 생산된 수정란들을 21일 동안 부화기에서 배양하여 병아리를 부화하는 방법으로 생산하였다. 제9세대(G8) 형질전환 닭들은 이와 같은 방법으로 총 6번의 교배를 통하여 생산되었다.
외래 유전자 전이 양상 조사는 제3세대(G2) GFP 형질전환 수탉을 최초 부계로 사용하여 최종적으로 제9세대(G8) 형질전환 닭을 연속적으로 생산하면서 GFP 유전자 전이 양상을 조사하였다. 형질 전환 병아리 유전 분석은 자외선 램프 아래에서 부화한 병아리들의 날개, 부리와 다리에서 녹색형광단백질을 발현하는 병아리들만을 형질전환으로 선발하였다. 형질전환 닭에서 외래 유전자 전이율은 대략 38～58%이었다.

데이터처리

본 연구를 통해 얻은 결과들은 Chi-square 검정을 이용하여 유의성 검증을 실시하였다.

성능/효과

비록 형질전환 닭에서 주입한 외래 유전자의 후대 병아리로의 전이율을 조사한 연구들은 많이 있었으나, 대부분이 제3세대(G2)까지이며, 많게는 제5세대(G4)까지 후대들을 생산하고 조사한 보고들이 있었다. 그리고 이들 후대계의 형질전환 비율은 부모의 한쪽이 heterozygote이고, 나머지가 wild-type인 경우 44～62%이었다. 이러한 형질전환 비율은 멘델의 유전 법칙을 따르고 있음을 보여주었다.
이러한 유전자 전이 양상은 멘델의 유전 법칙에 따른 결과라 예상되며, GFP 유전자가 안전하게 후대로 전이되고 있음을 보여주고 있다. 본 연구 결과는 형질전환 닭이 가지고 있는 외래 유전자가 세대가 계속 진행되어도 유전자 침묵없이 멘델의 유전 법칙에 따라 다음 세대로 계속 전이됨을 보여주고 있으며, 이러한 연구 결과는 형질전환 닭을 하나의 생체 반응기로서의 활용 가능성을 보여주고 있다.
부화한 병아리들에서 형질전환 병아리 생산 비율은 Chi-square 검정으로 분석한 결과, χ2=2.94 그리고 P-value=0.71을 나타내었고, 이를 유의수준 5% 그리고 자유도 5로 유의성 검정 결과 생산된 닭들의 형질전환 비율은 멘델의 유전 법칙에 따름을 알 수 있었다.
이는 유전자 전이가 멘델의 유전 법칙을 따르고 있음을 보여주고 있다. 연구 결과는 GFP 유전자가 유전자 침묵 없이 멘델의 유전 법칙에 따라 다음 세대로 계속 전이와 발현된다는 것을 보여 주고 있다.
이러한 성비 결과를 Chi-square 검정을 이용 생산된 전체 형질전환 닭들의 암수 성비를 분석한 결과, χ2=5.66 그리고 P-value=0.34를 나타내었고, 이를 유의수준 5% 그리고 자유도 5로 유의성 검정 결과 생산된 형질전환 닭들은 일반적인 암수 생산 비율인 1:1 비율을 따름을 보여 주고 있었다.
제9세대 형질전환 닭의 부화율은 수정란 기준으로 82%(80/98)이었다. 제9세대 형질전환 닭의 부화율은 본 실험실의 일반 닭 부화율(80～85%)과 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 각각의 세대별로 생산된 형질전환 닭들의 성비는 육안으로 암수 구별이 가능한 시기 이전에 폐사 또는 병아리 시기에 도태한 형질전환 병아리들을 제외하고, 성계로 성 성숙이 완료된 형질전환 닭들의 성비는 Table 2와 같았다.
그러나 본 연구는 기존의 연구들보다 훨씬 많은 형질전환 닭 후대 세대들을 생산하였고, 이들에서 주입한 외래 유전자가 안정적으로 후대계로 전달되고 발현되는지를 처음으로 조사하였다. 총 6세대(G3～G9)에서 걸쳐 생산된 형질전환 닭들의 형질전환 비율은 각각의 세대별로 38～58%이었다. 이러한 유전자 전이 양상은 멘델의 유전 법칙에 따른 결과라 예상되며, GFP 유전자가 안전하게 후대로 전이되고 있음을 보여주고 있다.
34를 나타내었고, 이를 유의수준 5% 그리고 자유도 5로 유의성 검정 결과 생산된 형질전환 닭들은 일반적인 암수 생산 비율인 1:1 비율을 따름을 보여 주고 있었다. 통계 분석 결과, 전체적인 암 수 비율이 기대 비율인 1:1의 범위를 벗어나지 않는 것으로 나타남에 따라 상대적으로 개체수가 적었던 제4세대(15수)와 제8세대(13수)에서 수컷의 비율이 높은 현상은 세대의 개체수가 많았더라면 일반적인 기대 비율인 1:1에 가깝게 나타나게 될 것으로 사료되어진다. 본 연구는 형질전환 닭에서 인위적으로 주입된 외래 유전자가 닭의 세대간 전이가 명확하게 일어나며, 다음 세대로 전이된 유전자의 지속적으로 안정적인 발현 여부를 GFP 형질전환 닭을 이용하여 조사하고자 하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	의료용 단백질 생산의 기존 방법은 무엇인가?	최근 의학과 생명공학 기술의 발달은 사람의 질병과 관련된 원인들을 하나씩 규명하게 됨에 따라 사람의 질병 치료 및 예방에 필요한 의료용 단백질의 수요가 폭발적으로 늘어나고 있는 상황이다(Durocher and Butler, 2009). 이러한 환경 변화는 의료용 단백질 생산의 중요성이 크게 부각되는 계기가 되었고, 기존 생산 방법 즉 생체 반응기(bioreactor)에 대장균, 곤충 또는 동물세포를 배양하여 생산하는 방법이 아닌 새로운 생산 방법들을 고려하게 되었다(Harrison and Jar- vis, 2006; O'Callaghan and James, 2008; Ward et al., 2004).
	형질전환 닭을 하나의 생체반응기로 이용하기 위한 조건은 무엇인가?	, 2005). 그러나 형질전환 닭을 하나의 생체반응기로 이용에는 형질전환 닭이 가지는 외래 유전자가 안정적으로 다음 세대에 전달되고, 더불어 전달된 외래 유전자가 침묵 등의 후성학적인 요인들에 의해 유전자 발현이 되지 않는 문제점들이 없어야 한다.
	재조합 단백질 생산에 있어서 닭이 가지는 장점은 무엇인가?	그러나 포유동물은 대량 번식을 위하여 비교적 큰 사육 면적과 상대적으로 긴 성 성숙 기간 등이 필요하다. 이에 반해 닭은 짧은 세대간, 연중 계란 생산 가능, 번식에 필요한 작은 공간, 짧은 시간에 큰 군집으로 형성, 그리고 프리온 단백질 관련 질병이 없는 등 포유류에 비하여 여러 가지 장점들이 있다. 최근 암탉이 생산한 계란의 난백에 사람에게 필요한 의료용 단백질을 분비하는 형질 전환 닭 생산 성공 사례들이 보고되고 있다(Kwon et al.

참고문헌 (11)

Durocher Y, Butler M 2009 Expression systems for therapeutic glycoprotein production. Curr Opin Biotechnol 20:700-707.

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Harrison RL, Jarvis DL 2006 Protein N-glycosylation in the baculovirus-insect cell expression system and engineering of insect cells to produce "mammalianized" recombinant glycoproteins. Adv Virus Res 68:159-191.

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Kwon SC, Choi JW, Jang HJ, Shin SS, Lee SK, Park TS, Choi IY, Lee GS, Song G, Han JY 2010 Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white. Biol Reprod 82:1057-1064.

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Lillico SG, McGrew MJ, Sherman A, Sang HM 2005 Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs. Drug Discov Today 10:191-196.

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O'Callaghan PM, James DC 2008 Systems biotechnology of mammalian cell factories. Brief Funct Genomic Proteomic 7:95-110.

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Ward M, Lin C, Victoria DC, Fox BP, Fox JA, Wong DL, Meerman HJ, Pucci JP, Fong RB, Heng MH, Tsurushita N, Gieswein C, Park M, Wang H 2004 Characterization of humanized antibodies secreted by Aspergillus niger. Appl Environ Microbiol 70:2567-2576.

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Zhu L, van de Lavoir MC, Albanese J, Beenhouwer DO, Cardarelli PM, Cuison S, Deng DF, Deshpande S, Diamond JH, Green L, Halk EL, Heyer BS, Kay RM, Kerchner A, Leighton PA, Mather CM, Morrison SL, Nikolov ZL, Passmore DB, Pradas-Monne A, Preston BT, Rangan VS, Shi M, Srinivasan M, White SG, Winters-Digiacinto P, Wong S, Zhou W, Etches RJ 2005 Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens. Nat Biotechnol 23:1159-1169.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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