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문제 정의
- 5) 활성을 나타낸 식물체중에서 천마(Gojmdia elata)로부터 SSADH 활성을 억제하는 gastrodin을 분리, 보고한 바 있다.6) 이번에는 SSADH 및 SSAR 효소의 활성억제를 보인 오미자 (SchizaMra chinensis B.) 의 열매로부터 활성본체를 규명하기로 하였다.
제안 방법
- c. (1.3 g, w-hexane-EtOAc = 2 :1)하여 SCE7-1-2-3 (820 mg, gomisin A, 3) 및 SCE-7-1-2-5 (340 mg, schizandrin, 4)를 분리 , 정제하였다.
- c. (300 g, n-hexane- EtOAc = 5:1) 하여 SCE-5-1 (1.56 g, gomisin N, 2)을 분리, 정제하였다.
- )의 열매 추출물이 GABA 분해효소인 SSAR 및 SSADH의 활성을 감소시킨다는 결과를 얻은바 있다.5)그러므로 본 연구에서는 오미자로부터 SSAR 및 SSADH의 효소 활성을 저해시킴으로써 항경련 효과를 나타내는 단일 성분을 오미자로부터 순수분리 정제한 후 동정하였다.
- EtOAc 분획 (SCE, 50 g) 을 silica gel column chromato graphy (c. c.) (300g, n-hexane-EtOAc = 5 : 1→ 1: 1—CHCI3- MeOH = 20:1→10: 1→7 : 1)하여, TLC로 확인하여 유사한 분획끼리 합하고, 농축하여 14개의 소분획 (SCE1~SCE14)을 얻었다. SCE3 분획 (1.
- 각각의 분획에 대하여 항경련 활성을 측정한 결과 EtOAc 분획에 활성이 있음이 확인되었다. EtOAc 분획을 용매를 달리해가며 column chromatography를 반복하여 6종의 화합물을 분리 정제하였다.
- 얻었다. Ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), H2O 를 이용하여 순차적으로 분배, 추출하였고, 각각을 감압 농축하여 3개의 분획 (SCE, SCB, SCW)을 얻었다.
- SSADH의 효소 활성도 측정은 최종농도 500 ㎛ NAD+, 50 ㎛ succinic semialdehyde를 포함하는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 8.4)에 효소를 넣어 25℃에서 반응시켜 NADH가 생성되는 양을 340nm에서 측정하였다.
- SSAR의 효소 활성 측정은 보조인자인 NADPH가 NADF로 산화되는 것을 340nni에서 흡광도 값의 감소로써 측정하였다. Assay mixture 는 succinic semialdehyde (120p_M) 와 NADPH (5O|1M)를 포함하는 0.
- ¹H-NMR (400 MHz), 13C-NMR (100 MHz), DEPT spectra는 JEOL JNM-LA 400(Ibkyo, Japan) 으로, IR spectrum은 Perkin-Elmer model 599B(Massachusetts, USA)로 즉정하였으며, 융점은 Fisher melting point apparatus 로 측정하였고 미보정하였다. 흡광스펙트럼은 Kontron UVIKON Model 930을 사용하였으며, column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck)을, TLC는 Kieselgel 60 F254를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약들은 특급시약을 사용하였다.
- 동정한 화합물의 SSAR과 SSADH에 대한 억제활성 측정은 화합물을 여러가지 농도로 조절한 효소와 상온에서 1시간 동안 전처리 한 후, 앞에서 언급한 방법으로 효소의 활성을 측정하였다. 또한 이 화합물이 효소의 어느 부위에서 반응하는 가를 알아보기 위하여 효소와 화합물을 반응시키기 전에 SSAR 과 SSADH에 대한 각각의 보조인자들 (NADPH, NAD+) AD 이나 이효소들의 기질인 succinic semialdehyde를 효소와 반응시킨 후, 화합물에 대한 효소의 활성을 측정하였다.
- 또한 이 화합물이 효소의 어느 부위에서 반응하는 가를 알아보기 위하여 효소와 화합물을 반응시키기 전에 SSAR 과 SSADH에 대한 각각의 보조인자들 (NADPH, NAD+) AD 이나 이효소들의 기질인 succinic semialdehyde를 효소와 반응시킨 후, 화합물에 대한 효소의 활성을 측정하였다.
- 분리한 6개의 화합물에 대하여 항경련 관련 효소들의 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 위의 정제된 순수 화합물들은 모두 GABA transaminase에 대하여 효능을 보이지 않은 반면, schizandrin과 daucosterol 의 경우 succinic semialdehyde dehydrogenase와 succinic semialdehyde reductase에 대해 각각 저해효과를 나타내었다.
- 오미자 열매를 MeOH로 추출하고, 얻어진 추출물을 용매의 극성에 따라 EtOAc, n-BuOH와 H2O로 분배 추출하였다. 각각의 분획에 대하여 항경련 활성을 측정한 결과 EtOAc 분획에 활성이 있음이 확인되었다.
- 오미자 열매를 대상으로 활성물질을 추출하고, 용매 분획한 후, 항경련 활성을 측정하였고, 활성을 보인 EtOAc 분획으로부터 silica gel column chromatogmphy 하여 주요성분을 분리, 동정하였으며, 각 성분의 GABA 대사조절효소인 SSAR과 SSADH 효소들에 대한 억제효과를 조사하였다.
- 02) signal이 관측되었다. 이상의 결과를 바탕으로 문헌17)과 비교하여 화합물 1을 chamigrenal로 동정하였다.
- 흡광스펙트럼은 Kontron UVIKON Model 930을 사용하였으며, column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck)을, TLC는 Kieselgel 60 F254를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약들은 특급시약을 사용하였다.
대상 데이터
- 소의 뇌조직은 서울 마장동 도축장에서 구입하였고, 식물시료들은 경동시장에서 구입한 후, 생명공학연구소 이형규 박사에게 의뢰하여 동정하였으며, 식물 표본시료는 경희대학교(수원) 천연물화학실 시료실에 보관되어 있다.
이론/모형
- 소의 뇌조직으로부터 SSAR 및 SSADH 효소를 정제하기 위하여 ammonium sulfate fractionation, CM-Sephadex, DEAE- Sephadex, Hydroxyapatite, derivatized Sepharose 및 5-AMP- Sepharose 크로마토그래피 방법을 이용하였다.3,4)
성능/효과
- 88) 및 1개의 triplet methyl signal 이 관측되어 aglcycone은 β-sitoster이로 추정되었다. 13C-NMR spectrum에서의 chemical shifl로부터 aglycone이 β-sitosterol이라는 점과 당은 D-glucopyranose인 점이 확인되었으며, NMR spectrum 에서 anomeric proton signal 의 coupling constant가 7.4 Hz인 점으로부터 당이 P 결합하고 있음이 판명되었다. 따라서 화합물 6은 β-sitosterol의 3번 수산기에 D- glucopyranose가 β 결합한 daucosterol로 동정하였다.
- 화학적 특성을 나타냈다. NMR spectrum에서 화합물 2 와의 차이점은 산소와 결합된 사급 탄소 (δc 71.70) 및 singlet methyl (δ 1.20, & 15.72) signal이 관측된 점과, methylene의 2개의 proton signal0] geminal coupling만을 갖는 doublet (δ 2.61, 2.34) 으로 각각 관측된 점, 또한 dioxymethylene signal 이 보이지 않고 대신에, 모두 5개의 methoxyl signal (δ 3.85, 3.84, 3.83, 3.53, 3.52, δC 60.78, 60.48, 60.44, 55.83, 55.76) 이 관측된 점이었다. 따라서 화합물 3을 gomisin H로 동정하였다.
- 3) 이러한 schizandrin과 daucosterol에 의한 GABA 분해효소들의 저해효과는 생체 내에서 신경전달물질인 GABA의 농도를 증가시킴으로서 항경련제로서의 가능성을 시사해주는 중요한 결과이다. Schiizandrin과 daucosterol에 의한 억제활성효과는 succinic semialdehyde dehydrogenase 와 reductase의 보조인자인 NAD+ 와 NADPH를 각각 전처리한 후 활성도 변화를 측정한 결과, 효소 억제활성을 나타내지 않는 것으로 보아 schizandrin과 daucosterol은 이들 효소의 보조 인자 결합 부위에 결합하는 것으로 추측할 수 있다.(Table 3)
- 각각의 분획에 대하여 항경련 활성을 측정한 결과 EtOAc 분획에 활성이 있음이 확인되었다. EtOAc 분획을 용매를 달리해가며 column chromatography를 반복하여 6종의 화합물을 분리 정제하였다.
- 미치는 영향을 측정하였다. 위의 정제된 순수 화합물들은 모두 GABA transaminase에 대하여 효능을 보이지 않은 반면, schizandrin과 daucosterol 의 경우 succinic semialdehyde dehydrogenase와 succinic semialdehyde reductase에 대해 각각 저해효과를 나타내었다. Succinic semialdehyde dehydrogenase 의 경우, schizandrin 농도의 증가에 따라 효소 활성이 65% 정도 감소됨을 알 수 있으며 (Fig.
- 56 (t)]의 존재가 확인되었다. 이상의 결과로부터 화합물 2는 gomisin N으로 동정하였다.
- 화합물 2~5는 13C-NMR spectra 에서 methoxy 또는 dioxymethylene을 제외하면, 모두 18개의 탄소로 이루어진 화합물로 판명되었으며, 그 중에서 18개는 aromatic 탄소로, 6개는 aliphatic 탄소로 밝혀져 모두 lignan 화합물로 동정되었다.
후속연구
- 유발한다. 따라서 효과적인 항경련 약제를 효소 수준에서 개발하기 위하여, 체내에서 glutamate로부터 GABA 합성에 관여하는 glutamate decarboxylase (GAD) 효소의 활성을 높여주거나, GABA 분해에 관여하는 GABA transaminase (GABA- T), succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) 및 succinic semialdehyde reductase (SSAR) 효소활성을 억제하는물질탐색을 모색할 수 있다.1-4)
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