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문제 정의
- 본 연구는 전술한 많은 생리기능 개선효과를 가진 오미자에 대한 특히 면역계와 암세포에 미치는 영향을 살펴보고 자림프구의 증식반응, T, B림프구의 아집단 변화, 암세포의 apoptosis유도(sub-G1 peak), 복강대식세포의 탐식능 및 nitric oxide생성능 등에 미치는 영향 등을 검토하였다.
제안 방법
- 비장 및 흉선세포 부유액을 조제하였다. 1X106 cells/ well이 되도록 조정한 다음, 비장세포 부유액에는 lipopolysac-charide(LPS, 1 μg/mL), 흉선세포 부유액에는 concanavalin A(Con A, 0.5 μg/mL)와 각 농도(1, 10 및 100 μg/mL)의 오미자추출물(SZX)을 첨가하여 48시간 동안 37℃의 CO2 배양기(5% CO2, 95% air)내에서 배양하였다. 배양 종료 4시간 전에 5mg/mL농도로 PBS(pH 7.
- BALB/c 마우스 7마리를 1군으로 하여 7일 동안 SZX를 0.1 mg/mL/mouse로 경구 투여한 다음 마우스를 경추 탈골시켜 비장 및 흉선을 적출한 후, 각 세포부유액을 조제하고 1X106 cells/well에 PE/FITC conjugated-anti B220 및 Thyl monoclonal antibody와 PE-anti CD4/FITC-anti CD8 mono clonal antibody로 이중 염색하여 4℃에서 30분간 반응시키고 flow cytometer(excitation: 488 nm, emission: 525 nm-FITC, 575nm-PE)를 이용하여 각각의 세포 중의 림프구의 아집단을 측정하였다(19).
- BALB/c 마우스 7마리를 1군으로 하여 미리 5X106 cells/mL의 L1210세포를 복강 내에 주사한 다음, 0.1 mg/mL/mouse의 SZX를 7 일간 경구 투여한 후, 마우스복강에서 L1210세포를 무균적으로 수집하였다. 세포부유액을 세정(X3회, PBS)한 후, 1X106 cells/well이 되도록 조정, 원심분리(250Xg, 10분)한 세포분획에 PI(10μg/mL)를 20μL/1X106 cells로 염색(4℃, 30분)한 다음 flow cytometer(Coulter, EPICS XL; excitation: 488 nm, emission: 620nm)를 이용해서 DNA단편화(sub-G1 peak)를 정량하였다(20).
- BALB/c 마우스를 경추 탈골시켜 비장 및 흉선을 무균적으로 적출하고 각각의 세포를 세정(X3회, PBS, 1500 rpm, 10분)해서 비장 및 흉선세포 부유액을 조제하였다. 1X106 cells/ well이 되도록 조정한 다음, 비장세포 부유액에는 lipopolysac-charide(LPS, 1 μg/mL), 흉선세포 부유액에는 concanavalin A(Con A, 0.
- BALB/c 마우스의 복강에 3% thioglycollate 2mL를 주사하고 3일 후, 경추 탈골시켜 5mL의 cold-PBS를 복강에 주입하여, 복강삼출세포를 수집하여 원심분리(1,500rpm, 5분)하였다. RPMI1640배지에 부유시켜 CO2 배양기에서 2시간 동안 배양한 다음, petri dish밑면에 부착한 대식세포를 scrapper로 수집하여 원심분리해서, 세포수를 1X107 cells/mL가 되도록 DME(0.
- BALB/c마우스 5마리를 1군으로 하여 3% thioglycollate 2 mL를 복강내 투여하여 3일 후복강삼출세포를 수집하고 원심분리(4℃, 1,500rpm, 10분)하였다. RPMI1640배지로 세척한 다음, petri dish에 부착시켜 부착한 세포만 수집하여 1X106 cells/well로 분주하였다.
- Lucigenin 용액은 10mL의 PBS에 용해한 후, 여과 멸균하여 -20℃에서 보관(stock solution)하면서 사용직전에 DME배지에 1/10로 희석하여 사용하였다. Chemilumines-cence측정은 luminometer를 이용하여 측정용 microplate well(white)에 세포부유액 50μL와 lucigenin 50μL를 주입하고 37℃에서 15분간 전처리한 후, SZX를 1, 10 및 100μL/mL 농도로 50μL씩 넣고 zymosan용액 30μL를 첨가하여 최종량이 200μL가 되도록 한 후, 5분 간격으로 60 분간 chemiluminescence 를 측정하였다(21).
- 세포부유액을 세정(X3회, PBS)한 후, 1X106 cells/well이 되도록 조정, 원심분리(250Xg, 10분)한 세포분획에 PI(10μg/mL)를 20μL/1X106 cells로 염색(4℃, 30분)한 다음 flow cytometer(Coulter, EPICS XL; excitation: 488 nm, emission: 620nm)를 이용해서 DNA단편화(sub-G1 peak)를 정량하였다(20). In vitro 실험은 계대배양한 L1210세포를 1X106 cells/well이 되도록 세포수를 조정한 후, 1, 10 및 100μg/mL농도의 SZX를 첨가해서 24시간 또는 48시간 동안 37℃의 5% CO2 배양기 내에서 배양하고 배양이 종료된 후, 각 세포를 수집하여 상기의 in vivo 실험과 동일한 방법으로 DNA단편화를 측정하였다.
- 5%)을 얻었다. 동물실험에는 생리식염수에 용해시켜 사용하였으며, 세포실험에는 3차 증류수에 용해시켜 사용하였다.
- 1 N HC1에 녹인 10% SDS 100μL로 용해시켜 18시간 동안 은박지로 빛을 차단하였다. 발색된 각 well의 흡광도를 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 측정하고 대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율로 환산하였다(18).
- 각 well에 SZX를 농도별(1, 10 및 100 μg/mL)로 처리하고 LPS 1 μg/mL와 γ-interferon 25 units/mL를 첨가하고 24시간 후에 생성된 nitric oxide양을 Griess법으로 측정하였다(22). 배지100 μL와 Griess reagent(l% sulfanilamide + 0.2% N-naphthylethylenediamine 2HCI + 2.5% H3PO4) 100 μL를 혼합하여 96 well에 넣고 570nm에서 microplate reader로 흡광도를 즉정하여 미리 작성한 NaNO2의 검량선에 의해 NO양을 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 오미자(SZX)는 전북 진안군에서 구입한 오미자열매 2kg을 70% 메탄올로 실온에서 3일간 교반 추출한 다음, 여과지로 여과하고 여액을 회전진공증발기로 40℃에서 농축하였다. 농축액을 하루 냉동시킨 후 동결건조하여 분말 230g(회수율 11.
- 실험동물로서는 생후 8주령된 BALB/c 계통의 웅성마우스를 대한실험동물에서 구입하여 사육하였으며, 온도 22±2℃, 습도 55±10%, ligh/dark 12시간의 사육조건에서 일주일 동안 적응시킨 후 사용하였고 고형사료와 물을 자유로이 섭취시켰다.
- 실험에 사용한 시약은 RPMI1640, fetal bovine serum(FBS), phosphate buffered saline(PBS), propidium iodide(PI), agarose, triton X-100, sodium dodesyl sulfate(SDS), 3-[4-5-dimethylthiazol-2-yl}-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) (이상, Sigma), PE(phycoerythrin)/FITC(fluorescein isothiocyanate) conjugated anti-B220 및 anti-Thyl, anti-CD4, anti-CD8 antibody(Caltag) 등이며, 실험기기는, laser flow cytometer(Coulter, EPICS-XL), inverted microscope(Nikon Co.), microplate reader(Dynatech, MR5000), luminometer(Berthold, 96LP), 전기영동장치(minigel, Mupid-Ⅱ)등을 사용하였다.
데이터처리
- 유의성검정은 student's t-test 방법을 사용하였다.
이론/모형
- RPMI1640배지로 세척한 다음, petri dish에 부착시켜 부착한 세포만 수집하여 1X106 cells/well로 분주하였다. 각 well에 SZX를 농도별(1, 10 및 100 μg/mL)로 처리하고 LPS 1 μg/mL와 γ-interferon 25 units/mL를 첨가하고 24시간 후에 생성된 nitric oxide양을 Griess법으로 측정하였다(22). 배지100 μL와 Griess reagent(l% sulfanilamide + 0.
성능/효과
- 3%로 큰 변화가 없었다(data not shown). 또한 in vitro계에서 L1210세포 배양계에 각 농도의 SZX를 첨가해서 24시간 및 48시간 동안 배양한 결과(Fig. 2), 특히 10μg/mL의 SZX첨가로 L1210세포의 apoptotic cell death가 현저하게 촉진되었다. 이 결과는 SZX가 암세포의 apoptosis를 유도하는 작용을 가지고 있음을 나타내고 있다.
- 마우스로부터 복강 대식세포를 수집하고 1, 10 및 100μg/mL의 SZX를 가하여 hicigenin chemiluminescence측정법을 이 용하여 대식세포의 탐식능을 살펴본 결과(Fig. 3), zymosan만 처리한 대조군에 대하여 SZX첨가군 중 1 및 10μg/mL군에 서 대식세포의 탐식작용이 증가하였다. 대식세포는 생체내에서 T, B림프구와 더불어 항원제공세포, 탐식작용, 불필요하게 된 세포의 제거(27), 림프구의 활성화 등의 중요한 면역력을 발휘하는 세포로 알려져 있는 면역세포로서 SZX가 이러한 대식세포의 활성을 증강시키는 작용을 보유하고 있다는 결과는 SZX의 면역조절제로서의 가능성을 시사한다.
- 마우스백혈병세포주인 L1210세포를 마우스의 복강에 이식하고 SZX를 7일간 경구 투여한 다음 복강에 이식된 L1210 세포를 수집하여 sub-G1 peak를 측정한 결과, 대조군은 7.0±0.5%인데 비해 SZX를 투여한 군에서는 10.2±1.3%로 큰 변화가 없었다(data not shown). 또한 in vitro계에서 L1210세포 배양계에 각 농도의 SZX를 첨가해서 24시간 및 48시간 동안 배양한 결과(Fig.
- 1과 같다. 마우스비장세포에서 대조군인 LPS(1 μg/mL) 단독첨가군에 비하여 특히 SZX 10 μg/mL첨가군에서 비장림프구를 증식시켰으며, 흉선세포배 양계에서는 Con A(0.1 μg/mL) 단독첨가군의 대조군에 비하여 1 및 10 μg/mLSq SZX 첨가군에서 흉선림프구의 증식을 현저하게 촉진시키는 효과를 나타내었다. 이는 오미자가 특히 T 및 B림프구의 증식을 촉진하여 생체의 면역능을 증강시키는 효과를 가지고 있음 을 시사하며 오미자의 자양강장제로서의 기능과 아울러 면역력을 증강시키는 이른바 immuno-potentiator로서의 개발가능성이 기대된다.
- 마우스의 복강대식세포를 수집해서 LPS와 γ-interferon을 첨가, 배양하면서 각 농도의 SZX를 가하여 대식세포가 생성하는 nitric oxide(NO)양을 살펴본 결과(Fig. 4), 대조군(LPS와 γ-interferon만 첨가)에 비하여 1, 10 및 100μg/mL의 SZX첨가에 의해 NO생성이 증가하였다. NO는 생체내에서 vasodilating agent, neurotransmitter로서의 작용 외에 세균이나 암세포에 대한 비특이적 면역반응의 효능물질로 잘 알려져 있으며, 마우스에서는 특히 대식세포와 호중구 등의 탐식작용을 가지는 세포에서 분비하고 있는 것으로 알려져 있다(12,28).
- NO는 생체내에서 vasodilating agent, neurotransmitter로서의 작용 외에 세균이나 암세포에 대한 비특이적 면역반응의 효능물질로 잘 알려져 있으며, 마우스에서는 특히 대식세포와 호중구 등의 탐식작용을 가지는 세포에서 분비하고 있는 것으로 알려져 있다(12,28). 본 실험에서 SZX가 복강대식세포로부터의 NO생성을 촉진한 결과는 NO가 생체 내에서 암세포를 공격해서 상해시키는 면역계의 effector로써의 역할을 하고 있다는 연구보고(29)와 유사한 결과라 할 수 있으며 이렇게 해서 면역조절작용을 하는 것으로 추정된다.
- 7일간 SZX를 경구 투여한 마우스 비장 및 흉선세포의 아집단변화는 Table 1과 같다. 비 장세포는 대조군에서의 B, T 세포에 비하여 SZX투여군에서 B세포 및 T세포의 수가 유의하게 증가하였으며, 비장내 T세포의 TH세포와 Tc/TS세포 중 특히 TH세포가 SZX투여에 의해 유의성있게 증가하였다. 흉 선세포에서도 SZX투여에 의해 TH세포의 수가 증가하였다.
- 또한 in vitm 세포배양계의 결과는 Table 2와 같다. 비장세포는 대조군에 비하여 SZX 첨가군에서 B세포가 현저하게 가하였고 T세포는 1 및 10μg/mg SZX첨가군에서 증가하 였다. 비장내의 T세포 중 TH세포가 특히 1 및 10μg/mL의 SZX첨가에 의해 유의성있게 증가하였으며, 흉선내 TH세포는 SZX 처리군에서 증가하였다.
- 비장내의 T세포 중 TH세포가 특히 1 및 10μg/mL의 SZX첨가에 의해 유의성있게 증가하였으며, 흉선내 TH세포는 SZX 처리군에서 증가하였다. 이상의 결과에서 SZX는 비장 및 흉선 내의 B, T림프구의 수를 증가시켰으며, 특히 T세포 아집단분석 결과 TH세포의 population을 증가시켜 생체면역력을 조절하는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 오미자가 생체의 면역반응을 총괄하고 있는 세포의 활성을 조절하는 효과를 가지고 있다는 점에서 매우 흥미있는 결과라 할 수 있다.
후속연구
- 최근에 사용되고 있는 각종 항암제들은 이러한 암세포의 apoptosis를 유도하는 작용을 보유하는 것으로 알려져 있으며(26) 이러한 암세포의 apoptosis유도를 일으키는 천연물의 동정은 매우 의의있는 일이라 할 수 있다. 또한 본 실험결과에서 in vivo와 in vitro 실험의 결과가 일치하지 않는 것은 각 실험계의 차이에 기인하고 있는 것으로 추정되며 in vivo 실험계를 보다 세밀히 검토할 필요가 있는 것으로 사료된다.
- 1 μg/mL) 단독첨가군의 대조군에 비하여 1 및 10 μg/mLSq SZX 첨가군에서 흉선림프구의 증식을 현저하게 촉진시키는 효과를 나타내었다. 이는 오미자가 특히 T 및 B림프구의 증식을 촉진하여 생체의 면역능을 증강시키는 효과를 가지고 있음 을 시사하며 오미자의 자양강장제로서의 기능과 아울러 면역력을 증강시키는 이른바 immuno-potentiator로서의 개발가능성이 기대된다.
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