항경련 활성을 보인 오미자의 열매로부터 활성물질을 분리하기 위하여 MeOH로 추출하고, 추출물을 EtOAc, n-BuOH 및 물로 분배, 추출하였다. 얻어진 각 분획에 대하여 중추 신경계에서 억제성 신경전달물질로 알려진 ${\gamma}-aminobutyric$ acid(GABA)의 대사조절효소들인 succinic semialdehyde reductase (SSAR) 및 succinic semi-aldehyde dehydrogenase(SSADH)의 활성을 측정하였다. 활성 억제효과를 나타낸 EtOAc 분획으로부터 silica gel column comatography를 반복하여 sesquiterpene 및 sterol 배당체 각 1종, lignan화합물 4종을 분리, 정제하였다. 각각의 화학구조는 NMR, MS 등의 스펙트럼 데이터를 해석하여, chamigrenal, daucosterol, gomisin A, gomisin H, gomisin N 및 schizandrin으로 동정하였다. 각 화합물에 대하여 활성을 측정한 결과, schizandrin을 SSADH와 1시간 전처리하였을 때 효소의 활성은 65% 억제되었으며, daucosterol의 경우에는 같은 조건에서 SSAR의 활성을 80% 억제하는 것을 관찰할 수 있었다.
항경련 활성을 보인 오미자의 열매로부터 활성물질을 분리하기 위하여 MeOH로 추출하고, 추출물을 EtOAc, n-BuOH 및 물로 분배, 추출하였다. 얻어진 각 분획에 대하여 중추 신경계에서 억제성 신경전달물질로 알려진 ${\gamma}-aminobutyric$ acid(GABA)의 대사조절효소들인 succinic semialdehyde reductase (SSAR) 및 succinic semi-aldehyde dehydrogenase(SSADH)의 활성을 측정하였다. 활성 억제효과를 나타낸 EtOAc 분획으로부터 silica gel column comatography를 반복하여 sesquiterpene 및 sterol 배당체 각 1종, lignan화합물 4종을 분리, 정제하였다. 각각의 화학구조는 NMR, MS 등의 스펙트럼 데이터를 해석하여, chamigrenal, daucosterol, gomisin A, gomisin H, gomisin N 및 schizandrin으로 동정하였다. 각 화합물에 대하여 활성을 측정한 결과, schizandrin을 SSADH와 1시간 전처리하였을 때 효소의 활성은 65% 억제되었으며, daucosterol의 경우에는 같은 조건에서 SSAR의 활성을 80% 억제하는 것을 관찰할 수 있었다.
The repeated silica gel colum chromatographies of EtOAc fraction, showing anticonvulsant activity, obtained from MeOH extracts of Schizandra chinensis B. fruits led to isolation of a sesquiterpenoid, four lignans and a sterol glycoside. Their chemical structures were determined to be chamigrenal, go...
The repeated silica gel colum chromatographies of EtOAc fraction, showing anticonvulsant activity, obtained from MeOH extracts of Schizandra chinensis B. fruits led to isolation of a sesquiterpenoid, four lignans and a sterol glycoside. Their chemical structures were determined to be chamigrenal, gomisin A, gomisin H, gomisin N. schizandrin and daucosterol. Among them, schizandrin and daucosterol inhibited GABA degrative enzymes, succinic semialdehyde dehydrogenase and succinic semialdehyde reductase, respectively. It is postulated that the schizandrin and daucosterol are able to elevate the neurotransmitter GABA levels in central nervous system by inhibitory action on GABA degrative enzymes and act as anticonvulsant drugs.
The repeated silica gel colum chromatographies of EtOAc fraction, showing anticonvulsant activity, obtained from MeOH extracts of Schizandra chinensis B. fruits led to isolation of a sesquiterpenoid, four lignans and a sterol glycoside. Their chemical structures were determined to be chamigrenal, gomisin A, gomisin H, gomisin N. schizandrin and daucosterol. Among them, schizandrin and daucosterol inhibited GABA degrative enzymes, succinic semialdehyde dehydrogenase and succinic semialdehyde reductase, respectively. It is postulated that the schizandrin and daucosterol are able to elevate the neurotransmitter GABA levels in central nervous system by inhibitory action on GABA degrative enzymes and act as anticonvulsant drugs.
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문제 정의
5) 활성을 나타낸 식물체중에서 천마(Gojmdia elata)로부터 SSADH 활성을 억제하는 gastrodin을 분리, 보고한 바 있다.6) 이번에는 SSADH 및 SSAR 효소의 활성억제를 보인 오미자 (SchizaMra chinensis B.) 의 열매로부터 활성본체를 규명하기로 하였다.
제안 방법
c. (1.3 g, w-hexane-EtOAc = 2 :1)하여 SCE7-1-2-3 (820 mg, gomisin A, 3) 및 SCE-7-1-2-5 (340 mg, schizandrin, 4)를 분리 , 정제하였다.
c. (300 g, n-hexane- EtOAc = 5:1) 하여 SCE-5-1 (1.56 g, gomisin N, 2)을 분리, 정제하였다.
)의 열매 추출물이 GABA 분해효소인 SSAR 및 SSADH의 활성을 감소시킨다는 결과를 얻은바 있다.5)그러므로 본 연구에서는 오미자로부터 SSAR 및 SSADH의 효소 활성을 저해시킴으로써 항경련 효과를 나타내는 단일 성분을 오미자로부터 순수분리 정제한 후 동정하였다.
EtOAc 분획 (SCE, 50 g) 을 silica gel column chromato graphy (c. c.) (300g, n-hexane-EtOAc = 5 : 1→ 1: 1—CHCI3- MeOH = 20:1→10: 1→7 : 1)하여, TLC로 확인하여 유사한 분획끼리 합하고, 농축하여 14개의 소분획 (SCE1~SCE14)을 얻었다. SCE3 분획 (1.
각각의 분획에 대하여 항경련 활성을 측정한 결과 EtOAc 분획에 활성이 있음이 확인되었다. EtOAc 분획을 용매를 달리해가며 column chromatography를 반복하여 6종의 화합물을 분리 정제하였다.
얻었다. Ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH), H2O 를 이용하여 순차적으로 분배, 추출하였고, 각각을 감압 농축하여 3개의 분획 (SCE, SCB, SCW)을 얻었다.
SSADH의 효소 활성도 측정은 최종농도 500 ㎛ NAD+, 50 ㎛ succinic semialdehyde를 포함하는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 8.4)에 효소를 넣어 25℃에서 반응시켜 NADH가 생성되는 양을 340nm에서 측정하였다.
SSAR의 효소 활성 측정은 보조인자인 NADPH가 NADF로 산화되는 것을 340nni에서 흡광도 값의 감소로써 측정하였다. Assay mixture 는 succinic semialdehyde (120p_M) 와 NADPH (5O|1M)를 포함하는 0.
¹H-NMR (400 MHz), 13C-NMR (100 MHz), DEPT spectra는 JEOL JNM-LA 400(Ibkyo, Japan) 으로, IR spectrum은 Perkin-Elmer model 599B(Massachusetts, USA)로 즉정하였으며, 융점은 Fisher melting point apparatus 로 측정하였고 미보정하였다. 흡광스펙트럼은 Kontron UVIKON Model 930을 사용하였으며, column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck)을, TLC는 Kieselgel 60 F254를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약들은 특급시약을 사용하였다.
동정한 화합물의 SSAR과 SSADH에 대한 억제활성 측정은 화합물을 여러가지 농도로 조절한 효소와 상온에서 1시간 동안 전처리 한 후, 앞에서 언급한 방법으로 효소의 활성을 측정하였다. 또한 이 화합물이 효소의 어느 부위에서 반응하는 가를 알아보기 위하여 효소와 화합물을 반응시키기 전에 SSAR 과 SSADH에 대한 각각의 보조인자들 (NADPH, NAD+) AD 이나 이효소들의 기질인 succinic semialdehyde를 효소와 반응시킨 후, 화합물에 대한 효소의 활성을 측정하였다.
또한 이 화합물이 효소의 어느 부위에서 반응하는 가를 알아보기 위하여 효소와 화합물을 반응시키기 전에 SSAR 과 SSADH에 대한 각각의 보조인자들 (NADPH, NAD+) AD 이나 이효소들의 기질인 succinic semialdehyde를 효소와 반응시킨 후, 화합물에 대한 효소의 활성을 측정하였다.
분리한 6개의 화합물에 대하여 항경련 관련 효소들의 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 위의 정제된 순수 화합물들은 모두 GABA transaminase에 대하여 효능을 보이지 않은 반면, schizandrin과 daucosterol 의 경우 succinic semialdehyde dehydrogenase와 succinic semialdehyde reductase에 대해 각각 저해효과를 나타내었다.
오미자 열매를 MeOH로 추출하고, 얻어진 추출물을 용매의 극성에 따라 EtOAc, n-BuOH와 H2O로 분배 추출하였다. 각각의 분획에 대하여 항경련 활성을 측정한 결과 EtOAc 분획에 활성이 있음이 확인되었다.
오미자 열매를 대상으로 활성물질을 추출하고, 용매 분획한 후, 항경련 활성을 측정하였고, 활성을 보인 EtOAc 분획으로부터 silica gel column chromatogmphy 하여 주요성분을 분리, 동정하였으며, 각 성분의 GABA 대사조절효소인 SSAR과 SSADH 효소들에 대한 억제효과를 조사하였다.
02) signal이 관측되었다. 이상의 결과를 바탕으로 문헌17)과 비교하여 화합물 1을 chamigrenal로 동정하였다.
흡광스펙트럼은 Kontron UVIKON Model 930을 사용하였으며, column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, Merck)을, TLC는 Kieselgel 60 F254를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약들은 특급시약을 사용하였다.
대상 데이터
소의 뇌조직은 서울 마장동 도축장에서 구입하였고, 식물시료들은 경동시장에서 구입한 후, 생명공학연구소 이형규 박사에게 의뢰하여 동정하였으며, 식물 표본시료는 경희대학교(수원) 천연물화학실 시료실에 보관되어 있다.
이론/모형
소의 뇌조직으로부터 SSAR 및 SSADH 효소를 정제하기 위하여 ammonium sulfate fractionation, CM-Sephadex, DEAE- Sephadex, Hydroxyapatite, derivatized Sepharose 및 5-AMP- Sepharose 크로마토그래피 방법을 이용하였다.3,4)
성능/효과
88) 및 1개의 triplet methyl signal 이 관측되어 aglcycone은 β-sitoster이로 추정되었다. 13C-NMR spectrum에서의 chemical shifl로부터 aglycone이 β-sitosterol이라는 점과 당은 D-glucopyranose인 점이 확인되었으며, NMR spectrum 에서 anomeric proton signal 의 coupling constant가 7.4 Hz인 점으로부터 당이 P 결합하고 있음이 판명되었다. 따라서 화합물 6은 β-sitosterol의 3번 수산기에 D- glucopyranose가 β 결합한 daucosterol로 동정하였다.
화학적 특성을 나타냈다. NMR spectrum에서 화합물 2 와의 차이점은 산소와 결합된 사급 탄소 (δc 71.70) 및 singlet methyl (δ 1.20, & 15.72) signal이 관측된 점과, methylene의 2개의 proton signal0] geminal coupling만을 갖는 doublet (δ 2.61, 2.34) 으로 각각 관측된 점, 또한 dioxymethylene signal 이 보이지 않고 대신에, 모두 5개의 methoxyl signal (δ 3.85, 3.84, 3.83, 3.53, 3.52, δC 60.78, 60.48, 60.44, 55.83, 55.76) 이 관측된 점이었다. 따라서 화합물 3을 gomisin H로 동정하였다.
3) 이러한 schizandrin과 daucosterol에 의한 GABA 분해효소들의 저해효과는 생체 내에서 신경전달물질인 GABA의 농도를 증가시킴으로서 항경련제로서의 가능성을 시사해주는 중요한 결과이다. Schiizandrin과 daucosterol에 의한 억제활성효과는 succinic semialdehyde dehydrogenase 와 reductase의 보조인자인 NAD+ 와 NADPH를 각각 전처리한 후 활성도 변화를 측정한 결과, 효소 억제활성을 나타내지 않는 것으로 보아 schizandrin과 daucosterol은 이들 효소의 보조 인자 결합 부위에 결합하는 것으로 추측할 수 있다.(Table 3)
각각의 분획에 대하여 항경련 활성을 측정한 결과 EtOAc 분획에 활성이 있음이 확인되었다. EtOAc 분획을 용매를 달리해가며 column chromatography를 반복하여 6종의 화합물을 분리 정제하였다.
미치는 영향을 측정하였다. 위의 정제된 순수 화합물들은 모두 GABA transaminase에 대하여 효능을 보이지 않은 반면, schizandrin과 daucosterol 의 경우 succinic semialdehyde dehydrogenase와 succinic semialdehyde reductase에 대해 각각 저해효과를 나타내었다. Succinic semialdehyde dehydrogenase 의 경우, schizandrin 농도의 증가에 따라 효소 활성이 65% 정도 감소됨을 알 수 있으며 (Fig.
56 (t)]의 존재가 확인되었다. 이상의 결과로부터 화합물 2는 gomisin N으로 동정하였다.
화합물 2~5는 13C-NMR spectra 에서 methoxy 또는 dioxymethylene을 제외하면, 모두 18개의 탄소로 이루어진 화합물로 판명되었으며, 그 중에서 18개는 aromatic 탄소로, 6개는 aliphatic 탄소로 밝혀져 모두 lignan 화합물로 동정되었다.
후속연구
유발한다. 따라서 효과적인 항경련 약제를 효소 수준에서 개발하기 위하여, 체내에서 glutamate로부터 GABA 합성에 관여하는 glutamate decarboxylase (GAD) 효소의 활성을 높여주거나, GABA 분해에 관여하는 GABA transaminase (GABA- T), succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) 및 succinic semialdehyde reductase (SSAR) 효소활성을 억제하는물질탐색을 모색할 수 있다.1-4)
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