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문제 정의
- 구강에서 분리 된 Streptococcus salivarius 119의 특성과 Streptococcus 而血瓜§¥ S. “亿久에 대한 작용을 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 또한 Streptococcus mntansQ\ 치 태형성을 억為하는 Streptococcus sali- varius 119 생성물질을 thin layer chromatography로 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 아동의 구강에서 분以한 Streptococcus sal沁ar- ius 119의 특성과 치아우식증의 발생에 중요한 Streptococcus 의 치 태형성 및 증식 에 미치는 영향을 보았으며 , Streptococcus mutans 증식을 억제하는 세균중 대표적인 세균인 Streptococcus or이is의 증식 에 대한 영향을 보았다. 또한 Streptococcus mntansQ\ 치 태형성을 억為하는 Streptococcus sali- varius 119 생성물질을 thin layer chromatography로 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 대조군에서는 Streptococcus mutans、* 접 종하였다. 37 ℃ 배 양기 에서 회 전시 키면서 15시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다. 동시에 세균배양액을 희석하여 BHI agar 상에 접종하여 37℃ 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- 대조군에서는 Streptococcus mutans、* 접 종하였다. 37 ℃ 배 양기 에서 회 전시 키면서 15시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다. 동시에 세균배양액을 희석하여 BHI agar 상에 접종하여 37℃ 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- 1 M TES buffer를 첨가하고 pH를 7로 조정 하여 Streptococcus salivarius 119를 배 양한다음, 3, 000 xrpm으로 20분간 원심하여 상청액을 얻어 끓는물에 3분간 방치하여 상청액내에 남아 있는 세균을 사멸시켰다 배양 상청액 20ml와 BHIS broth 20ml를 비커에 준비하였다. 여기에 Streptococcus mntans를 2 ><1。8씩 접종하고 0.016 inch 스테인레스스틸 재질의 교정용 wire (Ormco, Glendora, CA, U.S.A.)를 50mg 내외가 되게 준비하여 3개씩 비이커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 대조군에서는;宜砂 mutans만 접종하였다.
- BHIS broth에 TES buffer 농도가 0.1 M이 되도록 조정한 3ml를 일회용 큐벧에 넣고 50问의 Streptococcus salivarius 119 배 양액과 50/4의 Streptococcus mutans 배 양액을 접 종하였다. 대조군에서는 Streptococcus mutans 배양액만 접종하였다.
- 대조군으로 Q 1-4 linkage를 갖는 mal- totriose와 Q 1l6 linkage를 갖는 gentiobiose를 사용하였다. Maltotriosee gentiobiose를 같은 방법으로 methylation시키고 thin-layer chromatography를 실시하였다.
- 1 M이 되도록 조정하였다. 그 3ml를 일회용 큐벧에 넣고 50/4의 Streptococcus 배양액과 50/4 의 Streptococcus mutans 배양액을 접종하였다. 대조군에서는 Streptococcus mutans 배양액만 접종하였다.
- 이것을 배양기안에 수평면에 대하여 30°각도로 설치하고 37t!에서 2일간 배양하였다. 내용물을 제거하고 4ml의 증류수로 세척한 후, 3ml의 증류수를 가하여 분광광도계 550mm 파장에서 흡광도를 측정하여 Streptococcus mutans에、의한 비 수용성 글루캔 형 성 억 제 능이있는 집 락을 선택하였다.
- 이것을 배양기안에 수평면에 대하여 30°각도로 설치하고 37t:에서 1 일간 배양하였다. 내용물을 제거하고 4ml의 증류수로 세척한후, 3ml의 증류수를 가하여 분광광도계 550mm파장에서 흡광도를 측정하였다. 이것을 3회 반복하여 측정한 후 평균을 구하였다.
- 그 3ml를 일회용 큐벧에 넣고 50/4의 Streptococcus 배양액과 50/4 의 Streptococcus mutans 배양액을 접종하였다. 대조군에서는 Streptococcus mutans 배양액만 접종하였다. 이것을 배양기안에 수평면에 대하여 30°각도로 설치하고 37t!에서 2일간 배양하였다.
- 37℃ 배양기에서 회전시키면서 15시간배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다. 동시에 세균배양액을 희석하여 BHI agar상에 접종하여 3T0 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- 검사 방법은 단일 집락만을 증류수에 현탁해서 BHI agar 상에 접종하여 37℃, 24시간 배양하였다. 멸균된 면봉으로 증식된 세균을 취해서 증류수에 현탁하여 Macfarland scale #5로 조정하였는데, 이는 분광 광도계 550 nm에서의 흡광도 1.5와 같았다. 세균의 탁도를 조정한 후 API 20S kit에 세균액을 접종하고 37℃에서 4시간 배양하였다.
- 세균의 탁도를 조정한 후 API 20S kit에 세균액을 접종하고 37℃에서 4시간 배양하였다. 반응액을 첨가해서 기질의 색깔 변화와 당의 산성화를 관찰하였다. 정확한 동정을 위해 24시간 후 재판독하였다.
- 분리균주는 BHI broth에 배 양한 후 glycerol의 최종농도가 20% (w/v) 되도록 첨가하여 -70*0 에 냉동 보관하면서 필요에 따라 재접종, 배양한 후 실험에 사용하였다. 본 실험에서는 API 20S kit (BioMerieux, Marcy I' Eroile, France) 를 사용하여 분리 된세균을 동정하였다. 검사 방법은 단일 집락만을 증류수에 현탁해서 BHI agar 상에 접종하여 37℃, 24시간 배양하였다.
- 1 M TES buffer를 첨가하여 pH를 7로 조정한 다음, 비커에 40ml씩 준비하였다. 여기에 Streptococcus m«tans 와 Streptococcus sal讪arius 119를 각각 2 ><108씩 접 종하고 0.016 inch 스테인레스스틸 재질의 교정용 wire (Ormco, Glendora, CA, U.S.A.)를 50mg 내외가 되게 준비하여 3 개씩 비커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 대조군에서는 Streptococcus mutans、* 접 종하였다.
- 내용물을 제거하고 4ml의 증류수로 세척한후, 3ml의 증류수를 가하여 분광광도계 550mm파장에서 흡광도를 측정하였다. 이것을 3회 반복하여 측정한 후 평균을 구하였다.
- 유치원 아동의 타액으로 부터 분리하였다. 이러한 억제능이 있는 균주를 분리하기 위하여 타액을 1(尸으로 희석하여 5% 자당이 첨가된 BHI agar (BHIS agar) 상에 접종하고 37℃, 24 시간 배양한 후, 글루캔을 만드는 Streptococcus 집락을 선택하였다. BHIS broth에 TES (N-tris(Hydroxy-methyl)- methyl-2-aminoethane- sulfonic acid, Sigma, St.
- 반응액을 첨가해서 기질의 색깔 변화와 당의 산성화를 관찰하였다. 정확한 동정을 위해 24시간 후 재판독하였다. 분리된 Streptococcus salivariuse: Streptococcus salivarius 119로 명 명하였다.
- 20~30분 후 층분리가 확인되면 윗층만 뽑아버리고 다시 3ml 의 증류수로 2차례 주줄하였다. 추출물을 sodium sulfate anhydrous 0.35g을 첨가하여 1시간 방치하고 오일층을 걷어낸후, 55mm 여과지에 여과시켰다. Chloroform층을 공기로 말린 후 증류수 0.
- 같은 조작을 2번 반복하고 원심하여 남은 침전물을 80℃ oven에서 가열하였다. 침전물을 증류수에 녹인 것과 침전물을 1 M HC1 용액을 가하여 121 ℃ oven에서 20분간 방치한 것을 포도당, 과당, 자당과 함께 silica gel에서 thin layer chromatography를 실시하였다. 이때 developer로 85% acetonitrile액을 사용하고발색제로 5% HzSQ와 300mg/L «-naphthol°] 든 methanol 을 사용하여 12L oven에서 10분간 방치하였다.
대상 데이터
- Streptococcus mutans serotype c (Ingbritt strain), Streptococcus oralis (ATCC 35037, Rockville, MA, U.S.A.) 를 공시하였으며, 배양은 동결 건조로 보관중인 세균을 brain heart infusion (BHI, Difco, Detroit, MI, U.S.A.) broth에 접종하여 37℃ 배양기에서 배양하였다.
- )를 50mg 내외가 되게 준비하여 3 개씩 비커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 대조군에서는 Streptococcus mutans、* 접 종하였다. 37 ℃ 배 양기 에서 회 전시 키면서 15시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다.
- )를 50mg 내외가 되게 준비하여 3개씩 비이커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 대조군에서는;宜砂 mutans만 접종하였다. 37℃ 배양기에서 회전시키면서 15시간배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다.
- 이때 전개용매로 3 : 9 : 1의 acetonitrile : chloroform : methanol 액을 사용하였고 발색제로 5% H2SO4와 300mg/L a-naphthol이 든 methanol을 사용하여 121P oven에서 10 분간 방치하였다. 대조군으로 Q 1-4 linkage를 갖는 mal- totriose와 Q 1l6 linkage를 갖는 gentiobiose를 사용하였다. Maltotriosee gentiobiose를 같은 방법으로 methylation시키고 thin-layer chromatography를 실시하였다.
- 본 실험에 사용된 비수용성 글루캔 형성 억제능이 있는 균주는 유치원 아동의 타액으로 부터 분리하였다. 이러한 억제능이 있는 균주를 분리하기 위하여 타액을 1(尸으로 희석하여 5% 자당이 첨가된 BHI agar (BHIS agar) 상에 접종하고 37℃, 24 시간 배양한 후, 글루캔을 만드는 Streptococcus 집락을 선택하였다.
이론/모형
- 비수용성 글루캔 형성 억제능이 있는 분리균주의 형태학적, 생물학적 , 생화학적 성 질 등은 Bergey s manual of systematic bacteriology에 있는 방법叨으로 검사하였다. 분리균주는 BHI broth에 배 양한 후 glycerol의 최종농도가 20% (w/v) 되도록 첨가하여 -70*0 에 냉동 보관하면서 필요에 따라 재접종, 배양한 후 실험에 사용하였다.
성능/효과
- Streptococcus salwarius 119 게"걍 상청 액을 thin layer chro- matography를 실시한 결과, Streptococcus salwarius 119가 형성한 polymei는 글루캔이었다 (Fig. 3).
- 1. Streptococgs musns를 일회용 큐벧에서 배 양시 550nm에서의 흡광도가 0.327이었으나, Streptococcus mutant* Streptococcus salivarius 119의 혼합 배양시에는 0.119로 감소되었다.
- 2 비커 와이어 검사에서 Streptococcus mutans %法犬、형성된인공치태 무게는 84.7mg이었으나, Streptococcus /nutans 와 Streptococcus salivarius 119 혼합 배양시 에는 12.3mg 으로 감소되었다.
- 3. BHI broth에서 배양된 Streptococcus salivarius 119 배양상청액을 가한 비커 와이어 검사에서 형성된 인공치태 무게는 100.5mg인데 반해, 5% 자당이 함유된 BHI broth 에서 배양된 Streptococcus salivarius 119 배양 상청 액을가한 비커 와이어 검사에서는 20.4mg이었다.
- 4. Streptococcus or이祗아 Streptococcus salivarius 119 단독 배양시에는 각각 ml당 4.8x10; 7.5x108이었으나, 혼합배양시에는 Streptococcus or시is는 4.2x10, , Streptococcus salivarius 119는 5.8x 10, 으로 감소하였다.
- 5. Streptococcus salivarius 119 배 양 상청 액을 thin layer chromatography# 실시한 결과, Streptococcus salivarius 119가 형성한 polymer는 글루캔이었다.
- 6. Streptococcus salivarius 119가 만드는 글루캔을 처 리하여 thin layer chromatography를 실시한 결과, 결합이 주된 결합인 수용성 글루캔이었다.
- 9mg이었다. StreptococcMs mutans아 Streptococcus salivarius 119 혼합 배양시에는 12.3mg으로 현저히 감소되었다(Table 4).
- Streptococcus mutans 단독 배 양시 에 비교하여 Streptococcus salivarius 119와의 혼합 배양시에는 일회용 큐벧면에 비수용성글루캔 형성이 감소되었다(Fig. 2). 분광광도계의 파장 550 nm에서 흡광도는 Streptococcus mutans 배양시에는 0.
- 5xl08이었다. Streptococcus omKs와 Streptococcus salwarius 119의 혼합 배 양시에는 Streptococcus or시is는 4.2 X10, 이었으며 , Streptococcus salivarius 119는 5.8x 顶으로 감소하였다 (Table 6).
- Streptococcus salivarius 119가 만드는 글루캔을 처리 하여 thin layer chromatography를 실시한 결과, 1—>6 결합이 주된 결합인 수용성 글루캔이었다 (Fig. 4).
- 3mg으로 현저히 감소되었다. Streptococms s시初qWus \\9叭 으、한 Streptococcus mutans典 인공 치태 형성 억제 기전을 알고자 BHI broth와 BHIS broth에서 배 양한 Streptococcus salivarius 119 배 양 상청 액을 각각 가한 비커 와이 어 검사에서 Streptococcus muta惟의하여 형성된 인공치태 무게는 각각 100.5mg, 20.4mg이었다. 이와 같은 결과는 5% 자당이 함유된BHI broth에서 배양한 Streptococcus salivarius 119 배양 상청액에 함유된 성분에 의한 것으로 사료되 었다.
- 분리균주를 API 20S kit를 사용하여 당발효 검사를 실시한 결과, sorbitol, lactose, raffinose, ami- don/starch* 분해하고 ribose, arabinose, mannitol, trehalose, inulin, glycogene 분해하지 못하였다(Table 1). Voges-Proskauer 검사, /3-glucuronidase 검사, ^-galactosidase 검사, alkaline phosphatase 검사에서 양성을 보였고, hippurate 분해검사, pyrrolidonylarylamidase 검사, galactosidase 검사, ^-glucosidase 검사, leucine arylamidase 검사 및 arginin dehydrolase 검사에는 음성을 보였다 (Table 2). 이러한 당발효 및 생화학적 특성으로 분리균주를 Streptococcus salivarius 119로 명명하였다.
- 이와 같은 결과는 5% 자당이 함유된BHI broth에서 배양한 Streptococcus salivarius 119 배양 상청액에 함유된 성분에 의한 것으로 사료되 었다. 그래서 Streptococcus salivarius 119 배 양 상청 액을 thin layer chromatography를 실시한 결과, Streptococcus salivarius 119가 형성한 polymer는 글루캔이었으며 (Fig. 3), 이 글루캔은 1-6 결합이 주된 결합인 수용성 글루캔이었다는것을 (Fig. 4) 증명하였다. 즉 Streptococcus salivarius 119가형성한 수용성 글루캔에 의하여 Swe供ococchs mutans의、비수용성 글루캔 형성이 억제되는 것으로 사료된다.
- 동시에 생균수 검사를 한 결과, BHI broth에서 배양한 Streptococcus salivarius 119 배양 상청 액을 가한 배지에서 증식한 Streptococcus mutanse: ml당 5.7 x 盼이었고, BHIS broth 에서 배 양한 Streptococcus salwarius 119 배 양 상청 액을 가한배지에서 증식한 Streptococcus mutans는 ml당 2.0xlC)a이었다 (Table 5).
- 즉 Streptococcus salivarius 119가형성한 수용성 글루캔에 의하여 Swe供ococchs mutans의、비수용성 글루캔 형성이 억제되는 것으로 사료된다. 또한 과산화수소를 분비하여 Streptococcus mutcms% 증식을 억제한다고 알려진 구강에서 유익한 세균인 Streptococcus oralis31}<^ 대해서는 Streptococcus salwarius 119가 억제 작용이 없는 것으루 나타났다.
- 배양 후 생균수 검사를 한 결과, 단독 배양시에는 ml당 5.7X IO, 이었고, Streptococcus mutans 119 단독 배양시에는 7.5X IO, 이 었다. Streptococcus mutanse Streptococcus salivarius 119 의 혼합 배양시에는 Streptococcus mutans는 2.
- 본 연구에서는 일회용 큐벧에서의 비수용성 글루캔 형성 억제 실험에서 Streptococcus mutans 단독 배양시의 0.327에 비교하여 Streptococcus mutanse Streptococcus salivarius 119의 흔합 배양시에는 0.119로 감소되었고, 비커 와이어 검사에서 Streptococcus mutans 단독 배양시 형성된 인공치태 무게 84.7 mg에 비교하여 Streptococcus 初〃勿와 Streptococcus salivarius 119 혼합 배양시에는 12.3mg으로 현저히 감소되었다. Streptococms s시初qWus \\9叭 으、한 Streptococcus mutans典 인공 치태 형성 억제 기전을 알고자 BHI broth와 BHIS broth에서 배 양한 Streptococcus salivarius 119 배 양 상청 액을 각각 가한 비커 와이 어 검사에서 Streptococcus muta惟의하여 형성된 인공치태 무게는 각각 100.
- 2). 분광광도계의 파장 550 nm에서 흡광도는 Streptococcus mutans 배양시에는 0.327, Streptococcus salivarius 119 배양시에는 0.034, Streptococcus mMa惟s오t Streptococcus salivarius 119의 혼합 배 양시 에 는 0.119로 되어 (Table 3), 비수용성 글루캔 형성이 억제됨을 알수 있었다.
- 1). 분리균주를 API 20S kit를 사용하여 당발효 검사를 실시한 결과, sorbitol, lactose, raffinose, ami- don/starch* 분해하고 ribose, arabinose, mannitol, trehalose, inulin, glycogene 분해하지 못하였다(Table 1). Voges-Proskauer 검사, /3-glucuronidase 검사, ^-galactosidase 검사, alkaline phosphatase 검사에서 양성을 보였고, hippurate 분해검사, pyrrolidonylarylamidase 검사, galactosidase 검사, ^-glucosidase 검사, leucine arylamidase 검사 및 arginin dehydrolase 검사에는 음성을 보였다 (Table 2).
- Voges-Proskauer 검사, /3-glucuronidase 검사, ^-galactosidase 검사, alkaline phosphatase 검사에서 양성을 보였고, hippurate 분해검사, pyrrolidonylarylamidase 검사, galactosidase 검사, ^-glucosidase 검사, leucine arylamidase 검사 및 arginin dehydrolase 검사에는 음성을 보였다 (Table 2). 이러한 당발효 및 생화학적 특성으로 분리균주를 Streptococcus salivarius 119로 명명하였다.
- 이상의 결과로 볼 때 , Streptococcus salivarius 119는 수용성 글루캔을 생성 하여 Streptococcus mutanse\ 비수용성 글루캔 생성을 저지함으로써 치태 형성을 억제하는 것으로 사료된다. 그러나 구강내 다른 상주균과 Streptococcus salivarius 119의 상호작용에 대한 연구는 앞으로 더 필요한 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 종합하면 구강에서 분리 된 Streptococcus salivarius 119에 安한 &質eptococcus mutans으、인공치 태 형성 억제작용은 수용성 글루캔 형성에 의한 것으로 사료되었다.
- 4) 증명하였다. 즉 Streptococcus salivarius 119가형성한 수용성 글루캔에 의하여 Swe供ococchs mutans의、비수용성 글루캔 형성이 억제되는 것으로 사료된다. 또한 과산화수소를 분비하여 Streptococcus mutcms% 증식을 억제한다고 알려진 구강에서 유익한 세균인 Streptococcus oralis31}<^ 대해서는 Streptococcus salwarius 119가 억제 작용이 없는 것으루 나타났다.
후속연구
- 그러나 구강내 다른 상주균과 Streptococcus salivarius 119의 상호작용에 대한 연구는 앞으로 더 필요한 것으로 생각된다.
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