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문제 정의
- faecalis7* 근관 감염 에 중요한 역할을 하며 , 이것에 감염된 근관은 예후가 불량하다고 하였다心. 그래서 본연구에서는 비병원성 세균으로 분류되는 E. durans를 선택하여 연구하였다. E.
- 본 연구에서는 아동의 구강에서 분리한 장구균의 생화학적인 특성을 검사하여 E. durans를 분리하여 항생제 감수성 검사를 하였고 치아우식증의 발생에 중요한 S 치태형성 및 증식에 미치는 영향을 보았으며, S mutans 증식을 억제하는 세균 중 대표적인 세균인 S. oralis으、생균수에 대한 영향을 보았다. 또한 S.
가설 설정
- 있는데 이를 3가지로 분류할 수 있다. 첫째, 용혈소의 생성이다. 건강한 사람의 대변이나 구강에서 분리되는 세균보다 창상 부위에서 분리되는 세균에서 용혈소를 많이 만든다.
제안 방법
- $ mutanse 억제하는 bacteriocin이 분리균주의 plasmid에의 하는지를 보기 위하여 Wizard™ Plus Minipreps DNA Purification System kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 분리균주로부터 plasmid를 분리하였다. 5 ml의 세균배양액을 10, 000xge 10분간 원심하여 상청액을 버렸다.
- 대조군에서는 $ mm瓜만 접종하였다. 37 ℃ 탄산가스 배양기에서 회전시키면서 15시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다. 동시에 세균배양액을 희석하여 BHI agai■상에 접종하여 37℃ 탄산가스 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- 01 m를 접종하였다. 37℃ 탄산가스 배양기에서 15시간 배양한 후, 세균배양액을 희석하여 B印 agai상에 접종하고 37℃ 탄산가스 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- BHI broth에 0.5% 효모추출액 (yeast extract)과 5% 자당을 첨가한 후 (BHIYS broth), TES (N-tris (Hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane-sulfonic acid; 2-((2-Hydroxy-1, l~bis (hydroxymethyl)ethyl) amino)ethane sulfonic acid, Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.) buffer 농도가 0.1 M이 되도록 조정하였다. 그 3 ml를 일회용 큐벧에 넣고 50 闵의 E.
- Phenol red base broth에 arabinose, glycogen, inulin, lactose, mannitol, melizitose, melibiose, raffinose, rhamnose, ribose, sorbitol, starch 및 trehalose의 최종 농도가 0.5% 되도록 첨가하였다. 이 broth에 균주를 접종한 후 배지의 색깔이 황색으로 변한 것을 양성으로 하였다.
- 37 ℃ 탄산가스 배양기에서 회전시키면서 15시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다. 동시에 세균배양액을 희석하여 BHI agai■상에 접종하여 37℃ 탄산가스 배양기에서 18시간 배양한 후 생균수를 산정하였다.
- oralis으、생균수에 대한 영향을 보았다. 또한 S. mutans을 억제하는 bacteriocin이 plasmid에 의해 생산되는가를 보기 위하여 분리균주에서 plasmid를 관찰하였다.
- 24시간 배양하였다. 멸균된 면봉으로 증식된 세균을 취해서 증류수에 현탁하여 Macfarland scale #5로 조정하였는데, 이는 분광 광도계 550 nm에서의 흡광도 1.5와 같았다. 세균의 탁도를 조정한 후 API 20S kit (BioMerieux, Marcy I' Eroile, France) 에 세균액을 접종하고 37 ℃ 에서 4시간 배양하였다.
- 세균의 탁도를 조정한 후 API 20S kit (BioMerieux, Marcy I' Eroile, France) 에 세균액을 접종하고 37 ℃ 에서 4시간 배양하였다. 반응액을 첨가해서 기질의 색깔 변화와 당의 산성화를 관찰하였다. 정확한 동정을 위해 24시간 후 재판독하였다.
- 1 M TES buffer를 첨가하여 pH를 8로 조정한 다음, 비커에 40 ml씩 준비하였다. 여기에 S. mutans오t E. durans 표준균주 (ATCC 6056, Rockville, MD, U.S.A.) 또는 E. durans 분리균주를 각각 씩 접종하고 Q Q16 inch 스테인레스스틸 재질의 교정용 wire (Ormcof Glendora, CA, U.S.A.)를 50 mg 내외가 되게 준비하여 3 개씩 비커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 대조군에서는 $ mm瓜만 접종하였다.
- 내용물을 제거하고 4 ml의 증류수로 세척한 후, 3 ml의 증류수를 가하여 분광광도계 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이것을 3 회 반복하여 측정한 후 평균을 구하였다.
- 동시에 DNA size marker로서 lambda DNA/Hind HI < 부하하였다. 이를 전기영동을 실시한 다음, UV photographic apparatus (Polaroid, Cambridge, MA, U.S.A.)를 사용하여 쵤영하였다.
- 부터 분리하였다. 장구균을 분리하기 위하여 검체를 6.5% NaCl이 함유된 Brain heart infusion agar (BHI, Difco, Detroit, MI, U.S.A.)에 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 후, 집락을 형성한 균주를 bile-esculin 고체 배지에 도말 접종하였다. 이것을 37P에서 24시간 배양한 후 검정 색소를 생산하는 집락을 선택하였다.
- 반응액을 첨가해서 기질의 색깔 변화와 당의 산성화를 관찰하였다. 정확한 동정을 위해 24시간 후 재판독하였다.
대상 데이터
- gentamicin, kanamycin 및 streptomycin을 사용하였다. 항생제 검사 결과 판정은 미국 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard)의 기준에 준하였다.
- durans 배양액과 50问의 8. mutans (Ingbritt strain) 배양액을 접종하였다. 대조군에서는 S.
- )를 50 mg 내외가 되게 준비하여 3 개씩 비커에 매달아 배지에 잠기도록 하였다. 대조군에서는 $ mm瓜만 접종하였다. 37 ℃ 탄산가스 배양기에서 회전시키면서 15시간 배양한 후, 3개의 wire 상에 형성된 인공 치태의 무게를 평균하였다.
- mutans (Ingbritt strain) 배양액을 접종하였다. 대조군에서는 S. mutans 배양액만 접종하였다. 이것을 탄산가스 배양기안에 수평면에 대하여 30°각도로 설치하고 37℃에서 2일간 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 장구균은 4~6세의 유치원 아동의 타액으로 부터 분리하였다. 장구균을 분리하기 위하여 검체를 6.
이론/모형
- 검체로부터 분리된 세균의 형태학적, 생물학적, 생화학적 성질 등은 Bergey s Manual of Systematic Bacteriology에 있는 방법으로 검사하였다. 이들 균주는 6.
- gentamicin, kanamycin 및 streptomycin을 사용하였다. 항생제 검사 결과 판정은 미국 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard)의 기준에 준하였다.
성능/효과
- 1. 분리균주에 대한 당 발효 검사와 생화학적 검사 결과, 비슷한 양상을 보였다.
- 2. 분리균주 모두 erythromycin, penicillin, tobramycin, ampicillin, teicoplanin, ciprofloxacin, vancomycin, gentamicin, kanamycin 및 streptomycin에 대해 감수성을 보였다.
- 3. S. mutanse 일회용 큐벧에서 단독 배양시 550nm에서의 흡광도가 1.405이었으나, S. mutansS\ 4주의 분리균주 혼합배양 시에는 각각의 흡광도가 0.855, 0.867, 0.797, 1.083 으로 감소되었다.
- 4. 비커 와이어 검사 결과, S mutans 단독 배양시 형성된 인공치태의 평균 무게는 1566±103mg이었다. S mutans斗 4주의 분리균주 혼합 배양시에는 각각 44±5mg, 41±12mg, 34±7mg, 38±12mg으로 현저히 감소되었다.
- 6. 3주의 분리균주로 부터 약 60 kb의 plasmid를 분리할 수 있었다.
- API 20S kit를 사용하여 동정된 E. durans 분리균주 네 주를 각각 E. durans -1, -2, -3, -4로 표기하였으며 , 당 발효 검사를 실시한 결과 (Table 1), 분리균주 모두 lactose, ribose, starch, trehalose를 분해하고 arabinose, glycogen, inulin, mannitol, melezitose, raffinose, rhamnose 및 sorbitole 분해하지 못하였다. Melibiose에 대해서는 E.
- durans를 선택하여 연구하였다. E. dnrans快 항생제 감수성 검사 결과, 검사에 사용된 erythromycin, penicillin, tobramycin, ampicillin, teicoplanin, ciprofloxacin, vancomycin, gentamicin, kanamycin 및 streptomycin에 대해 모두 감수성을 보였다. 이와 같은 결과는 최근 장구균이 항생제에 대한 내성이 증가하고 있다는 보고3°와는 다르다.
- S wiutans으、돌연변이종으로 세포 내 탄수화물 대사에 결함이 있거나 28, lactate dehydrogenase 활성이 부족하여河, 유산을 생성하지 못하는 세균은 치아우식 활성이 낮다는 것이 입증되었고, S. mntansR럼 치면에 집락을 이루고 치태를 형성하나 치아우식증을 일으키지 않는 S salivariuse. 분리되었다冗气 또한 구강 내 Enterococcus faecalis는 항균제 기능을 나타내는 bacteriocin을 생성함으로써 연쇄상구균의 증식을 억제하기 때문에 대치 세균으로의 가능성이 있는 것으로 보고되고 있다狗.
- S. mutans 단독 배양시에는 분광광도계의 파장 550 nm에서 흡광도가 L405이었으나, $ mutanse E. durans 분리 균주의 혼합 배양시에는 각각의 흡광도가 0.855, 0.867, 0.797, 1.083으로 작게 나타나 (Table 4), 비수용성 글루캔 형성이 억제됨을 알 수 있었다.
- S. oralis 단독 배양시에는 ml당 項 乂 顶이었고, £, durans 분리균주 단독 배양시에는 각각 8, 6xl08, 8.8X108, 14.4X 108, 8.0xlC)8이었다. $。質세代아 E.
- durans 분리균주의 혼합 배양시에는 44±5mg, 41±12mg, 34±7mg, 38±12mg으로 현저히 감소되었다 (Table 5). 배양 후 생균수 검사를 한 결과, $ etans 단독 배양시에는 ml당 2.0x109이었고, E. durans 분리균주 단독 배양시에는 각각 2.4X10L 2.8X109, 2.4x109, 3.5>有09이었다. $ nutans 와 E.
- dmns-\을 제외한 세주가 분해하였다. 생화학적 검사를 실시한 결과 (Table 2), Voges-Proskauer 검사, hippurate 분해 검사, /^-glucosidase 검사, pyrrolidonylarylamidase 검사, /^-galactosidase 검사, leucine arylamidase 검사 및 arginin dehydrolase 검사에서 분리균주 모두 양성을 보였고, 片glucuronidase 검사와 alkaline phosphatase 검사에는 모두 음성을 보였다. &-galactosidase 검사에는 E.
- 이상의 결과를 종합하면 구강에서 분리된 E. durans는 S. mu-tansA 증식을 억제하여 인공치태 형성을 저지하였고, S oralis 의 증식은 약간 억제하였다.
- durans-2에서만 양성을 보였다. 이상의 결과에서 분리균주들은 대체적으로 비슷한 양상을 보였다.
- 일회용 큐벧에서의 비수용성 글루캔 형성 억제 실험에서 S. mutans 단독 배양시와 비교하여 S. mutans§* E. durans 혼합배양 시 글루캔 형성이 억제되었고, 비커 와이어 검사에서 S. mutans 단독 배양시 형성된 인공치태의 무게 1566±103mg에 비교하여 S. mutaws§* E. durans 표준균주 혼합 배 양시 323 ±5 mg, S. mutanse- E. durans 분리 균주를 각각 혼합 배 양시 44± 5mg, 41±12mg, 34±7mg, 38±12mg으로 현저히 감소되었다. 이와 같은 결과는 S 次必次의 인공 치태 형성을 £.
후속연구
- wmtans以 증식을 억제함으로 치태 형성에 중요한 글루캔 형성을 감소시켜 치아우식증의 발생을 억제하는 것으로 사료된다. 그러나 E. dnrag* 현저하지는 않지만 S oralis으、증식도 억제하는 만큼 구강에서의 E. durans으、장기적인 효과에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각한다.
- 또한 이 bacteriocine 약 60kb의 plasmid에 의해 만들어진다고 하였다. 본 연구에서도 3주의 분리균주에서 약 6아ib의 plasmid를 볼 수 있었으나 (Fig. 2), E. 泓切zs-2에서는 plasmid를 볼 수 없어 S 에、대한 억제 기전에 대해서는 추후 연구할 필요가 있을 것으로 사료된다. Hillman과 Socranskye E.
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