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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 까치버섯의 항산화 및 항암효과를 살펴보고 자 먼저 까치버섯 추출물과 분획물을 제조하여 in vivo에서 항산화 효과를 조사하였으며, 또한 in vivo에서 발암물질인 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguani-dine)를 투여한 동물의 조직 내의 항산화 효소 활성변화에 미치는 영향과 암억제 유전자인 p53의 발현에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
- 시료 첨가 후 4시간 더 배양하였다. HBS(HEPES buffer saline : NaCl 0.8%, KC1 0.04%, NaHPO4 . 12H2O 0.025%, glucose 0.1%, HEPES 0.59%, pH 7.0)로 세척한 다음, 60 μM의 HQ가 첨가된 HBS를 넣고 30분간 다시 배양한후 10% FBS가 첨가된 MEM을 넣어 5일간 배양하였다. 다시 MEM배지를 제거하고 99% 메탄올을 첨가하여 cell을 고정시킨 다음 Giemsa stain으로 염색하여 세포수를 측정하였다.
- V79 cell의 수를 200개 /dish(60mm)로 조정하여 10% FBS가 첨가된 MEM배지에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 배양 후, 배지를 제거하고 FBS가 없는 MEM 배지에서 시료 첨가 후 4시간 더 배양하였다. HBS(HEPES buffer saline : NaCl 0.
- 제3군은 MNNG를 투여한 후 표준사료만 공급하였고, 제4군은 대조군으로 DMSO를 경구투여한 후 표준사료를 공급하였다. 그리고 동물의 처치는 CO2 마취 시켜 복부 정중선을 따라 개복한 후 간을 적출하였다.
- (Shizuoka, Japan)으로부터 분양받아 사용하였고, 이들 rat는 23±2℃, 상대 습도 55±10%를 유지하고 밤, 낮의 길이를 12시간씩 인공조명으로 조절하였다. 사료(CRF-1, Japan Charles River Co. Japan, Tokyo)와 정제수는 자유로이 공급하였으며, 특히 발암물질로 MNNG를 10% DMSO에 용해한 후 150 ㎎/㎏ b.w. 농도로 I회 경구 투여 한 다음, 투여4시간 후부터 시료가 혼합된 사료를 3일간 공급하였다.
- 세척한membrane을 ECL detection kit(Amersham Co., U.S.A.)의 발색시약혼합액으로 도포한 다음, X-ray 필름에 노출하여 현상한 후 필름상의 띠를 관찰하였다.
- 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물에 ethylacetate와 증류수를 1: 1로 혼합한 용액으로 추출하여 각 층의 여액을 얻어 각각 여과시킨 후 감압농축시킨 다음, 동결건조하여 에틸아세테이트 추출물과 물 추출물을 얻었다.
- 5% 농도로 각각 첨가하여 공급하였다. 제3군은 MNNG를 투여한 후 표준사료만 공급하였고, 제4군은 대조군으로 DMSO를 경구투여한 후 표준사료를 공급하였다. 그리고 동물의 처치는 CO2 마취 시켜 복부 정중선을 따라 개복한 후 간을 적출하였다.
- 즉 실험동물은 각각 10마리씩 네 군으로 나누었으며 제 1군과 2군은 MNNG를 투여한 후 까치버섯 메탄올 추출물과 물추출물을 사료의 0.5% 농도로 각각 첨가하여 공급하였다. 제3군은 MNNG를 투여한 후 표준사료만 공급하였고, 제4군은 대조군으로 DMSO를 경구투여한 후 표준사료를 공급하였다.
대상 데이터
- Inc.(Shizuoka, Japan)으로부터 분양받아 사용하였고, 이들 rat는 23±2℃, 상대 습도 55±10%를 유지하고 밤, 낮의 길이를 12시간씩 인공조명으로 조절하였다. 사료(CRF-1, Japan Charles River Co.
- 원심분리 후 얻은 상등액은 다시 24,000 rpm에서 1시간 동안 초원심 분리하여 cytosol fraction과 microsomal fraction을 얻었다. 간균질액은 glutathione 함량 측정에, cytosol fractione glutathione S-transferase(GST)와 superoxide dismutase(SOD) 활성 측정에 사용하였다. Glutathione 함량은 Ellman(1959)의 방법에 의하여 실험하였으며, glutathione 함량은 간 조직 1 g당 μmole로 나타내었다.
- 강원도 오대산지역에서 자생하는 식용버섯인 까치버섯(Polyozellus multiplex)을 건조하여 분말로 만든 후, 10배의 80% 메탄올을 첨가하여 10시간 동안 3회 반복 추출하여 메탄올 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물에 ethylacetate와 증류수를 1: 1로 혼합한 용액으로 추출하여 각 층의 여액을 얻어 각각 여과시킨 후 감압농축시킨 다음, 동결건조하여 에틸아세테이트 추출물과 물 추출물을 얻었다.
- 실시하였다. 이때 사용된 V79 cell(Chinese hamster lung 5broblast)은 Dr. Tsutomu Nakayama(University of Shizuoka, Japan)로부터 분양받았다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 각 군 간의 통계적 유의성은 SAS program을 이용하여 5% 수준에서 Duncan's multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- 간균질액은 glutathione 함량 측정에, cytosol fractione glutathione S-transferase(GST)와 superoxide dismutase(SOD) 활성 측정에 사용하였다. Glutathione 함량은 Ellman(1959)의 방법에 의하여 실험하였으며, glutathione 함량은 간 조직 1 g당 μmole로 나타내었다. 또한 Habig 등(1974)의 방법에 준하여 GST를 측정하였으며 SOD 활성 측정은 Marklund(1974>의 방법에 준하여 측정하였다.
- 까치버섯 추출물의 항산화능 측정은 Nakayama 등(1991)의 방법에 준하여 colony formation assay를 실시하였다. 이때 사용된 V79 cell(Chinese hamster lung 5broblast)은 Dr.
- Glutathione 함량은 Ellman(1959)의 방법에 의하여 실험하였으며, glutathione 함량은 간 조직 1 g당 μmole로 나타내었다. 또한 Habig 등(1974)의 방법에 준하여 GST를 측정하였으며 SOD 활성 측정은 Marklund(1974>의 방법에 준하여 측정하였다. 또한 단백질의 양은 Lowry(1951)법에 준하여 측정하였다.
- 또한 Habig 등(1974)의 방법에 준하여 GST를 측정하였으며 SOD 활성 측정은 Marklund(1974>의 방법에 준하여 측정하였다. 또한 단백질의 양은 Lowry(1951)법에 준하여 측정하였다.
성능/효과
- GST 활성에 대한 까치버섯물 추출물의 영향을 살펴보면 Fig. 3과 같이 까치버섯 물추출물 0.5%를 투여한 군의 GST 활성이 MNNG 단독 투여군에 비해 26.3% 증가하였다. GST는 독성산화물질을 이utathione의 -SH group과 결합시켜 배설되기 쉬운 형태로 만들어 줌으로써 지질과 산화 반응으로부터 생체를 보호하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다(Burk et al.
- 까치버섯 메탄올 추출물과 물 추출물을 MNNG와 함께 투여하였을 경우 MNNG 단독 투여군에 비해 투여군 모두 4배 정도의 SOD의 활성이 증가하였다(Fig. 4). 이는 남 등(남, 김 등, 1999)의 쑥 추출물에서 얻은 결과와 유사한 것으로 까치버섯이 SOD 활성을 증가시켜 생성된 독성 산소의 제거 효과가 큰 것으로 추측된다.
- 위 결과로 보아 MNNG가 체내로 흡수되면서 조직에 항산화 상태 혹은 산화적 스트레스 환경을 유발하여 이를 해독하기 위한 GSH의 소모로 인해 체내 GSH가 감소하였으며, 0.5%의 까치버섯물 추출물의 투여로 체내의 GSH 소모를 덜어주어 그 함량이 증가된 것으로 추측된다.
- 4%로 약간 높게 나타났다. 이는 천연 항산화제로 알려진 caffeic acid, quercetin, catechin을 동일한 방법으로 처리하여 그 생존율을 살펴본 결과, 각각 55%, 51%, 42%였다는 보고(Nakayama et al., 1991)와 비교할 때 까치버섯 메탄올 추출물의 항산화 효과가 매우 크다는 것을 알 수 있었다.
- 이에 따라 Chinese hamster V79 cell을 이용하여 H2O2로 유도된 세포 독성에 대한 까치버섯 추출물의 억제효과를 colony fonnation assay로서 살펴본 결과, Fig. 1과 같이 H2O2만 처리 시 세포의 생존율은 23.9% 정도인데 비하여 까치버섯 HQz와 메탄올 추출물을 함께 처리하였을 때는 생존율이 2배 정도 증가한 53.5%였고, 물 추출물에서도 29.4%로 약간 높게 나타났다. 이는 천연 항산화제로 알려진 caffeic acid, quercetin, catechin을 동일한 방법으로 처리하여 그 생존율을 살펴본 결과, 각각 55%, 51%, 42%였다는 보고(Nakayama et al.
- 까치버섯을 함께 투여한 경우에 증가하였다. 특히 까치버섯 물 추출물 0.5%를 투여했을 때 p5S의 수준이 현저하게 증가하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 5). 이는 p53 암억제유전자의 발현으로 MNNG에 의해서 손상된 세포의 무절제한증식이 억제되어 종양으로의 발전이 차단된 효과로 생각된다.
- 항산화계 효소 활성 변화 까치버섯물 추출물의 GSH의 함량변화에 대한영향을 MNNG를 투여한 rat을 통하여 살펴본 결과, Fig. 2와 같이 간에서의 GSH 함량을 살펴보면 MNNG 단독 투여로 감소한 GSH 함량이 까치버섯 메탄올 추출물 0.5% 투여군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나 까치버섯물 추출물 0.5% 투여군에서는 GSH 함량이 약 2배 이상으로 증가되었음을 알 수 있었다. GSH는 생체내에서 환원 상태로 존재하며 DNA 합성물질이동, 효소활성의 조절, 활성산소나 free radical에 의한 세포손상 예방등에 직접 또는 간접적으로 관여한다(Lasini et al.
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