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문제 정의
- 대표적인 암 예방 효소로 알려진 quinone reductase의 유 도 활성을 알아보기 위하여 HepG2세포주를 사용하여 당 근 추출물로부터 quinone reductase를 유도하는 물질을 탐 색하여 암예방 물질의 개발에 응용하고자 하였다. 당근 추 출물 무처리구를 1로 하였을 때, 당근뿌리의 ethyl acetate 층에서는 QR유도활성효과는 약 2.
- 또 당근에 많이 든 pro vitamin A인 g-carotenee 나빠진 눈을 밝게 하고, 질 좋은 칼슘을 얻을 수 있는 채소로서 이와 뼈를 튼튼히 만들 어 주는 작용이 뛰어나다고 알려져 있으며, 점막의 저항력 을 길러 천식과 위궤양을 미리 막아 주고, 몸을 따뜻하게 하여 혈액순환이 잘 이루어지도록 하므로 냉증과 동상에도 좋다고 하였다 29 . 본 연구는, 색상식품으로 식탁에서 인 기가 있고 우리들의 식생활에서 늘 애용되고 있는 당근 추 출 성분 중 암세포를 퇴치 할 수 있는 생리활성 물질을 추 적하기 위하여 간암 세포주 HepG2에 대한 당근 추출 성분 이 quinone reductase(QR)유도 효과에 미치는 영향을 검토 하였다.
제안 방법
- 5。를 가해 각각 3회 씩 추출 하여 회전식 진공농축기로 농축한 후 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다. Methanol 추출물은 Scheme 1과 같이 mhexane, methanol, ethylacetate, butanol 및 HQ 가용부로 각 과정을 거쳐 분배한 후 취하고, 각 분배층은 농축하여 건조시킨 뒤 분말로 만들어 사용하였다
- Quinone reductase 유도 물질 탐색은 인체 암세포 중 유 일하게 quinone reductase# 가지고 있는 HepG2세포주를 사용하여 당근 뿌리와 씨앗의 methanol 추출물과 각각 4가지 분배층에서의 QR유도 활성을 측정한 결과는 Fig. 1 및 2와 같다. HepG 2 암세포에 당근 뿌리와 씨앗의 각 용 매 추출물 및 분배층을 50, 100, 150 및 200 ug/ml씩 첨가하였을 때 첨가물의 농도가 증가함에 따라 QR활성이 증가 하였고, 당근 뿌리에서는 DCRMEA와 DCRMH에서 QR유 도 활성이 있었고, 당근 씨앗에서는 DCSMB에서 괄목할만 하게 그 유도효과가 컸다.
- Quinone reductase 유도활성은 Prochaska 등의 microtitier method# 일부 변형하여 측정하였다[18,21]. 우선 24-well plate의 각 well에 lxlO, cells/되도록 HepG2 세포주를 분주하여, 24시간 배양한 후, 대상 시료를 첨가하고 다시 24시간 배양한 다음 배지를 제거하였으며, 무처리구인 대조 세포군(control)이 균일하게 한 켜의 세포로 덮히는 상태에 도달했을 때 각 24 well plate에 250 ul의 lysis buffer(10 mM Tris-Cb pH 8.
- 0으로 조절하여 전체량을 1P 로 하였다. 그리고, 1% Penicillin-streptomycin/ 10% fetal bovine serum(FBS)을 첨가한 후 세균 여과기로 여과하여 사용하였다.
- 잘 건조된 당근 씨 앗의 경우 975g에 methanol 1.5。를 가해 각각 3회 씩 추출 하여 회전식 진공농축기로 농축한 후 동결 건조하여 methanol 추출물로 사용하였다. Methanol 추출물은 Scheme 1과 같이 mhexane, methanol, ethylacetate, butanol 및 HQ 가용부로 각 과정을 거쳐 분배한 후 취하고, 각 분배층은 농축하여 건조시킨 뒤 분말로 만들어 사용하였다
- 본 실험에서 사용한 당근 중에는 일반적으로 항산화제로 널리 알려져 있는 & -carotene0] 함유되어 있으므로 본 실험 결과에서 나타난 여러 용매 추출 물질의 효과와 시판 6-carotene의 효과를 비교하기 위해 QR유도활성효과를 측정하여 Fig. 3에 나타내었다.
- )의 뿌리와 씨앗 은 98년에 수확한 것으로서 뿌리는 양산임기 당근 밭에서, 씨앗은 동부 한농 종묘에서 구입하였다. 이 시료들을 추 출 • 분획하여 각 암세포주에 의한 세포독성효과(cytotoxicity)와 quinone reductase(QR) 유도 활성 물질의 탐색에 사용하였다. 추가 비교 실험을 위해 Sigma(USA)사로부터 6-carotene을 구입하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 이 연구에 도입된 quinone reductse가 phase II 무독화 효소 중 암 예방 물질 탐색의 지표가 되는 대표적인 효소로 선정된 이유는 quinone류 자체에 대한 보호 효과가 있고 [25,28], 다른 암 예방 효소계와 함께 공통적으로 유도되며, 항암 작용이 있는 많은 화합물에 의해 유도되어지기 때문이다. Quinone reductase의 측정을 보다 신속, 간단하고 정확 하게 하기 위해 여러 종류의 동물세포를 이용할 수 있는데 본 실험에서는 HepG2를 도입하여 본 실험에 사용하였다
- 본 실험에 사용한 당근 (Daucus carota L.)의 뿌리와 씨앗 은 98년에 수확한 것으로서 뿌리는 양산임기 당근 밭에서, 씨앗은 동부 한농 종묘에서 구입하였다. 이 시료들을 추 출 • 분획하여 각 암세포주에 의한 세포독성효과(cytotoxicity)와 quinone reductase(QR) 유도 활성 물질의 탐색에 사용하였다.
- 세포실험에 사용한 시약은 bovine serum albumin(BSA), dicumarol, flavin adenine dinucleotide(FAD) 및 gluose-6- phosphate dehydrogenase들로서 Amresco 사(USA)로부터 구입하여 사용하였고, NP-40, Bvarotenee Sigma chemical company(USA)에서, minimum essential media(MEM medium), RPMI 1640 medium, phosphate buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco-BRL(USA)에서 구입하여 사용하였으며, 기타 시약 및 용매는 특급 또는 일급을 사용하였다.
- 실험에 사용한 기기는 CO2 incubator(Forma Scientific 3546, USA), Clean bench (Vision Scientific Co, LTD. VS1400LS), Deep freezer(Ilsin Enginering Co, DF 9071), Rotary evapolator(Tokyo rikakikai Co, LTD, NN10522423, Japan), Freeze dryer (IL SHIN Lab Co, LTD FD5525-01, Korea)/ Microscopy (Leica Mikroskopie & systeme Gmbh Wetzlas 520802z Germany) 및 UV - spectrophotometer (Pharmacia Biotech 80-2105-20) 등을 사용하였다.
- 인체의 간암 세포주인 HepG2 celle 주 2회 계대 배양하였다. 배양액은 3차 증류수에 minimum essential medium (MEM medium) 1봉지, NaHCO3 2.
- 이 시료들을 추 출 • 분획하여 각 암세포주에 의한 세포독성효과(cytotoxicity)와 quinone reductase(QR) 유도 활성 물질의 탐색에 사용하였다. 추가 비교 실험을 위해 Sigma(USA)사로부터 6-carotene을 구입하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 4)으로 효소 반응을 정지시킨 다음, UV-visible spectrophotometer (Pharmacia Biotech 80-2105-20)를 이용하여 610 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 단백질량은 동일한 s아의 well plate에 대한 crystal violet 염색 방법으로 정량하였다. Quinone reductase 활성 측정 (nmol/min/mg protein)은 다음과 같이 하였다.
성능/효과
- 1 및 2와 같다. HepG 2 암세포에 당근 뿌리와 씨앗의 각 용 매 추출물 및 분배층을 50, 100, 150 및 200 ug/ml씩 첨가하였을 때 첨가물의 농도가 증가함에 따라 QR활성이 증가 하였고, 당근 뿌리에서는 DCRMEA와 DCRMH에서 QR유 도 활성이 있었고, 당근 씨앗에서는 DCSMB에서 괄목할만 하게 그 유도효과가 컸다. 이 결과를 종합해 보면 시료 무 처리구인 대조군을 1로 보았을 때 당근 첨가물의 양을 200 ug/ml로 고정시킨 경우 당근 뿌리의 경우 DCRMEA는 2.
- HepG2 세포주에 6-carotene을 200 fig/tai 첨가한 후 대 조군을 1로 하였을 때 약 1.56배의 QR유도 활성효과를 보 였으며, 이 결과는 당근뿌리의 경우「ethyl acetate 분배층에서 2.1배를 보인 결과에 비해서 그 효과가 미약했으나, hexane 분배층과는 거의 비슷하였다. 또한 당근 씨앗의 경우, butanol 분배층에서 약 3.
- 본 실험 결과에서와 같이 당근 뿌리와 씨앗의 추출 성분 중 ethyl acetate층과 씨앗의 butanol층에서는 이미 항산화 제로 널리 알려져 있고 항암 효과도 있다고 하는 8-carotene외에 새로운 암 예방 효과를 가지고 있는 QR유도활 성을 가진 물질이 존배하고 있음을 본 연구응 통해 확인할 수 있었다.
- 1배로 감소하였고 DCSMEA의 경우에서도 이와 유사한 경향이었다. 본 연구 결과 HepG2에 대한 암 예방 효소인 QR유도활성 효과는 당근 뿌리의 경우 DCRMEA가 다른 용매 분배층 DCRM 및 DCRMB에 비해 제일 높은 효과를 나타내었고 hexane층인 DCRMH는 DCRMEA보다는 낮은 수준이 었지 만 유의적으로 QR효소 활성을 증가시키는 것으로 나타났고, 당 근 씨 앗의 DCSMB에서는 높은 QR유도 효과를 나타내었다.
- HepG 2 암세포에 당근 뿌리와 씨앗의 각 용 매 추출물 및 분배층을 50, 100, 150 및 200 ug/ml씩 첨가하였을 때 첨가물의 농도가 증가함에 따라 QR활성이 증가 하였고, 당근 뿌리에서는 DCRMEA와 DCRMH에서 QR유 도 활성이 있었고, 당근 씨앗에서는 DCSMB에서 괄목할만 하게 그 유도효과가 컸다. 이 결과를 종합해 보면 시료 무 처리구인 대조군을 1로 보았을 때 당근 첨가물의 양을 200 ug/ml로 고정시킨 경우 당근 뿌리의 경우 DCRMEA는 2.1 배, DCRMH는 1.6배의 QR유도 효과를 나타내었으며, 씨 앗의 경우 DCSMB에서는 3.0배로 아주 현저한 QR유도 효과를 나타내었으며, 전반적으로 당근 씨앗의 butanol분배 층이 당근 뿌리에서보다 상대적으로 매우 높은 QR유도활 성 효과를 나타내었다. 반면 당근 씨앗의 DCSM의 경우에는 첨가물의 농도를 100 ug/ml 가했을 때 2.
- 이상의 결과에서 당근 뿌리의 DCRMEA와 DCRMH, 당 근 씨앗의 DCSMB에서 대조군 보다 높은 QR유도 활성을 보였으므로 이들 분배층에서 인체 암 예방 효소계인 quinone reductase의 inducer가 존재하는 것으로 본 실험을 통하여 추정 할 수 있었다.
- 0배로 당근 뿌리의 경우보다 높은 QR유도 활성효과를 나타내었다. 즉 당근의 뿌리와 씨앗에는 인체 암예방 효소계 인 quinone reructase의 inducer가 존재함으로써 암 예방에 좋은 효과를 가진 물질이 존재하는 것을 추정할 수 있었다. 항 산화제로 널리 알려진 6-carotene을 대조군으로 하여 QR유도 활성효과를 비교 실험한 결과 당근 뿌리와 씨앗에 서의 결과에 비해 8-carotene의 효과는 아주 미약하였다.
- 즉 당근의 뿌리와 씨앗에는 인체 암예방 효소계 인 quinone reructase의 inducer가 존재함으로써 암 예방에 좋은 효과를 가진 물질이 존재하는 것을 추정할 수 있었다. 항 산화제로 널리 알려진 6-carotene을 대조군으로 하여 QR유도 활성효과를 비교 실험한 결과 당근 뿌리와 씨앗에 서의 결과에 비해 8-carotene의 효과는 아주 미약하였다.
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