Steinernema carpocapsae로부터 분리된 Xenorhabdus nematophilus에 의한 살충물질 생산을 위한 최적 배양조건 Optimal Cultur Conditions for the Production of Insecticidal Toxin by Xenorhabdus nematophilus Isolated from Steinernema carpocapsae원문보기
국내에서 서식하고 있는 곤충병원성 선충 Stemernema Carpocapsae로 부터 분리$\cdot$동정된 Xenorhabdus nematophilus를 대상으로 최적배지조성과 배양조건, 상변화 특성 및 곤충 독성물질 역기를 조사하였다. 균주의 최적배치 조성은 50-70g/L yeast extract, 3 g/L $K_{2}HPO_{4}$, 1g/L $NH_{4}H_{2}PO_{4}$, 2g/L ${MgSO}_4$$\cdot$${7H}_{2}O$,10g/L NaCl 이였으며, yeast extract의 농도가 균주성장 제한인자로 작용하였다. Yeast extract 농도에 대한 비성장속도의 의존도를 Monod equation을 가정하여 비교해 본 결과, 최대 비성장속도는 0.13 $ht^{-1}$이고 Monod 상수값은 20 g/L였다. 배양 배치의 pH는 초기 6-7에 관계없이 성장이 진행됨에 따라서 약 8.5-9.5까지 증가하였으며, 7L fermentor배양에서는 균주의 비성장속도가 약 0.18 $ht^{-1}$로 flask배양보다 1.4배 더 증가하였다. 상변화의 경우 정지기에서도 fermentor배양과 flask배양 모두 약 90% 이상 phase I이 유지되었다. 한편 꿀벌부채명 나방에 대한 구강독성을 시험해 본 결과, X. nematophilus 균주를 유충사료에 첨가하면 꿀벌부채명나방 유충의 정상적인 성장을 저해하였으며, 20여일 경과 후 완전히 유충을 사멸시키는 것을 확인하였다. 배양 상등액을 유충에 직접 주사하였을 때 배양 24 시간인 지수성장기 초기에 가장 독성이 강하였으며, 배양시간이 경과함에 따라 독성이 점차 감소하였다.
국내에서 서식하고 있는 곤충병원성 선충 Stemernema Carpocapsae로 부터 분리$\cdot$동정된 Xenorhabdus nematophilus를 대상으로 최적배지조성과 배양조건, 상변화 특성 및 곤충 독성물질 역기를 조사하였다. 균주의 최적배치 조성은 50-70g/L yeast extract, 3 g/L $K_{2}HPO_{4}$, 1g/L $NH_{4}H_{2}PO_{4}$, 2g/L ${MgSO}_4$$\cdot$${7H}_{2}O$,10g/L NaCl 이였으며, yeast extract의 농도가 균주성장 제한인자로 작용하였다. Yeast extract 농도에 대한 비성장속도의 의존도를 Monod equation을 가정하여 비교해 본 결과, 최대 비성장속도는 0.13 $ht^{-1}$이고 Monod 상수값은 20 g/L였다. 배양 배치의 pH는 초기 6-7에 관계없이 성장이 진행됨에 따라서 약 8.5-9.5까지 증가하였으며, 7L fermentor배양에서는 균주의 비성장속도가 약 0.18 $ht^{-1}$로 flask배양보다 1.4배 더 증가하였다. 상변화의 경우 정지기에서도 fermentor배양과 flask배양 모두 약 90% 이상 phase I이 유지되었다. 한편 꿀벌부채명 나방에 대한 구강독성을 시험해 본 결과, X. nematophilus 균주를 유충사료에 첨가하면 꿀벌부채명나방 유충의 정상적인 성장을 저해하였으며, 20여일 경과 후 완전히 유충을 사멸시키는 것을 확인하였다. 배양 상등액을 유충에 직접 주사하였을 때 배양 24 시간인 지수성장기 초기에 가장 독성이 강하였으며, 배양시간이 경과함에 따라 독성이 점차 감소하였다.
Optimal medium composition, culture conditions, characteristics of phase variation and activity of insecticidal toxin by Xenorhabdus nematophilus isolated and identified from Korean entomopathogenic nematode Steinernema carpocapsae were examined. Optimal medium composition of this strain was 50-70 g...
Optimal medium composition, culture conditions, characteristics of phase variation and activity of insecticidal toxin by Xenorhabdus nematophilus isolated and identified from Korean entomopathogenic nematode Steinernema carpocapsae were examined. Optimal medium composition of this strain was 50-70 g/L yeast extract, 3 g/L $K_{2}HPO_{4}$, 1g/L $NH_{4}H_{2}PO_{4}$, 2g/L ${MgSO}_4$$\cdot$${7H}_{2}O$, 10g/L NaCl and, these, yeast extract was found as a limiting nutrient for cell growth. When Monod equation was applied, maxmum specific growth rate and Monod constant were estimated as 0.13 $hr^{-1}$ and 20g/L, respectively. The pH of culture medium increased up to 8.5-9.5 regardless of initial pH 6-7 as the cells continued to grow. The specific growth rate in a 7 L fermentor was 0.18 $hr^{-1}$, which was enhancement 1.4 fold compared to a flask culture. In case of phase variation, phase I fraction was maintained above 90% at the stationary phase for both flask and fermentor cultures. According to oral toxicity test of Gallena mellonella by Xenorhabdus nematophilus, the addition of cell pellets into feed inhibited normal growth of insect larvae and killed completely then after 20 days cultivation. When culture supernatant of this strain was injected into hemolymph of insect larva, the toxicity was strongest at 24hr cultivation in the early exponential phase and gradually decreased as the culture time proceeded.
Optimal medium composition, culture conditions, characteristics of phase variation and activity of insecticidal toxin by Xenorhabdus nematophilus isolated and identified from Korean entomopathogenic nematode Steinernema carpocapsae were examined. Optimal medium composition of this strain was 50-70 g/L yeast extract, 3 g/L $K_{2}HPO_{4}$, 1g/L $NH_{4}H_{2}PO_{4}$, 2g/L ${MgSO}_4$$\cdot$${7H}_{2}O$, 10g/L NaCl and, these, yeast extract was found as a limiting nutrient for cell growth. When Monod equation was applied, maxmum specific growth rate and Monod constant were estimated as 0.13 $hr^{-1}$ and 20g/L, respectively. The pH of culture medium increased up to 8.5-9.5 regardless of initial pH 6-7 as the cells continued to grow. The specific growth rate in a 7 L fermentor was 0.18 $hr^{-1}$, which was enhancement 1.4 fold compared to a flask culture. In case of phase variation, phase I fraction was maintained above 90% at the stationary phase for both flask and fermentor cultures. According to oral toxicity test of Gallena mellonella by Xenorhabdus nematophilus, the addition of cell pellets into feed inhibited normal growth of insect larvae and killed completely then after 20 days cultivation. When culture supernatant of this strain was injected into hemolymph of insect larva, the toxicity was strongest at 24hr cultivation in the early exponential phase and gradually decreased as the culture time proceeded.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본언구에서는 구내에서 서식하고 있는 곤충병원성 선충 중 Stemernema ct叩oc叩sae종으로부터 분리된 공생박테리아인 Xenorhabdus nemmophiMs가 생성하는 exotoxin 및 그 최적배양조건을 조사하였다
제안 방법
2 g/L MgSQ - 7H:O, 5 g/L NaCI을 기본 베지로 yeast cwact의 농도를 5, 10, 30. 50, 70 g/L로 증가시켜 배지를 조제하였다. 二런디음 XR-PC를 접종하여 시간에 따른 。。와 pH의 변화를 조사하였다.
S cg/丿霓叩歐记로부터 분리한 공생박테리아, XR-PC가 꿀벌부치명나방 유충에 구강 독성(瑚 toxic网)을 가지는지를 조사하기 위해서 공기가 봉히는 petri dish에 쌀겨와 밀을 주성분으로 사굥히는 유충 사료 20 g을 채웠다. 공생박테리아 접종농도의 영향을 조사하기 위해 서 비〕양된 곰생빅-테리아 pellet을 전조 중량 23, 46, 230 mg으로 달리 하이 각각의 petii disb 에 넣고 유춤 사료 20 g과 싞었다 Cbngl은 증류수 1 mL에 유충 사료 20 g을 첨가한 petri dish를 시용하였다 체중이 약 63±3 mg 정도인 2령 단계의 꿀벌부체명 나방 유충을 각각 외 petri dish 당 10마리씩 첚가하고 25°C incubator에서 증식하면서 유충의 증식을 고사하였으며, 체중 변화와 함께 유충의 번데기, 나방 단계로의 생활사번화도 함께 조사하였다.
이때. 파! 는조절하지 않_ 고 배양을 실시하였다 균주가 f!a외:와 fenrentor에서 각각 배양함 경우 발생하는 상변화의 정도를 조사하기 위해서 배양액을 NBTA에 plate out하여 28°C에서 3-5일 배양한 후 콜로니의 색을 확인하였다. 이때 phae I은 BTBfbromot- hymol blue)를 흡수하여 푸른색 혹은 녹색인 반면, phase II는 붉은색을 보였다.
또한 5. carpocapsae 신충으로부터순수분리된 공생박테리아는 Biol%동정시스템을 이용하여 동정하였다(10
사굥히는 유충 사료 20 g을 채웠다. 공생박테리아 접종농도의 영향을 조사하기 위해 서 비〕양된 곰생빅-테리아 pellet을 전조 중량 23, 46, 230 mg으로 달리 하이 각각의 petii disb 에 넣고 유춤 사료 20 g과 싞었다 Cbngl은 증류수 1 mL에 유충 사료 20 g을 첨가한 petri dish를 시용하였다 체중이 약 63±3 mg 정도인 2령 단계의 꿀벌부체명 나방 유충을 각각 외 petri dish 당 10마리씩 첚가하고 25°C incubator에서 증식하면서 유충의 증식을 고사하였으며, 체중 변화와 함께 유충의 번데기, 나방 단계로의 생활사번화도 함께 조사하였다.
2, 4, 8베로 회석한다. 그리고 각각의 희석된 시료를 micrcKydnge를 이용하이3령 단계의 꿀벌 부채명나방 유중의 hemo顷nph에 邛L씩 조]종한 후, 접종된 꿀벌 부체명나방 유 춤은 25 °C imubacor에서 보관하딘서사멸시간을 조사하였다.
대상으로 최적배지조성과 배양조전, 상변화 특성 및 곤충 독성물질 역 기릍 조사하였다. 균주의 최직 배지 조성은 50-70 g/L yeast exrract, 3 g/L K^HPO4f 1 g/L NH4H2PCU, 2 g/L MgSO, ; .
여 콜로니를 분리하였다. 둘째, 꿀벌무채 멍나방 유충의 hemok ymph액읖 iiLilrieiic agar에 무균적으로 몇 방을 떨어트린 다음 표면 살균된 선충을 그 위에 미쟝 떨어트려 酮 시간 배양한 후선충이 hemolymph액에 분비한 공생박테리아이] 의 헤 생성된 콜로니를 분리하였다. 셋째, 선충올 꿀벌 부채명나방 유 춤에 접종한 지 花시간 후유춤 사체를 무균적으로 해부하여 사체 내 부액을 plate Qul하여 콜로니를 분리하였다 위의 방咽으로최퐁적으로 분리된 박데리아는 분리 메 이용한 곤충병원 성 션충과 공 배양 가능성을 조사하였다.
둘째, 꿀벌무채 멍나방 유충의 hemok ymph액읖 iiLilrieiic agar에 무균적으로 몇 방을 떨어트린 다음 표면 살균된 선충을 그 위에 미쟝 떨어트려 酮 시간 배양한 후선충이 hemolymph액에 분비한 공생박테리아이] 의 헤 생성된 콜로니를 분리하였다. 셋째, 선충올 꿀벌 부채명나방 유 춤에 접종한 지 花시간 후유춤 사체를 무균적으로 해부하여 사체 내 부액을 plate Qul하여 콜로니를 분리하였다 위의 방咽으로최퐁적으로 분리된 박데리아는 분리 메 이용한 곤충병원 성 션충과 공 배양 가능성을 조사하였다. 곰매양 가능성은 공생박데리이롤 NBTA에 plale oui하여 3-5일간 증식한 colony에 곤충병원성 선 층을 접중하여 정싱.
가%Q 5 g/L NaCI, 50 잉L yeast extract를 기뽄배지로 히.이 각가 10, 30, 50, 100 g/L로 달리 첨가 하이 베지를 조지] 한 후균주를 접좀하여 배양하였다.
대상 데이터
본 실험에 시용된 곤총병원 싱 선층인 Steiiiernenia aupocc- psw종으로부터 공생 박테리아의 분리를 위히 -여 다음의 세가 지방 법을 사용하였다. 첫찌L표면살균된 선츰을 YS 배지가 처가 된 튜므에 담아 vortex하여 선충을 파괴시킨 후 28rC shaking meubator에서 48시간 배양한 후 배잉:액을 nuiiient agar broino thymol blue tripliaiylleti-azolnim chloride (NBTA)이 plaie out히.
성능/효과
7H:O, 10 g/L NaCl이였으뎌, yeast extract의 농도가 균주성장 제한인 자로 작용하였다. Yeast extracl 놈도에 대한 비성장속도의 의존도를 Monod equation을 가징하이 비교해 본 결괴、최대 비성장 속도는 0.13 "'이고 Monocl 상수값은 20 g/L였다 배양 배지의 pH는 초刃 6-7에 관계없이 성장이 진행됨에 따라서 약 8S-9.5까지 증가하였으며, 7L 花rmcntoi 베양에서는 균주의 비성장 속도가 약 0 18 或로 Hasl베양it다 1.4베더 증가하였다. 상 변화의 경우 정지기에서도 fennentor배양과 flask내양 모두 약 90% 이상 phase I이 유지되었다.
이러한 문제점을 해결하기 위헤 세계 각국은 환경 친화적인 해충 방제의 필요성을 인식하고 이와 관뎐된 신기술기]발에 많은 노력을 집중하고 있다. 특히 지난 수년간 UNCED는 1999년까지 각국의 기존 화학농약 사용량의 25%를 줄이거나 대체하도록 가국에 권고하고 있으며, 우리나라도 국가행동 게획으로 2004년까지 현재 사용되고 있는 비료와 화학농약의 사용량을 5。%까지 줄이기나 대체하는 것으로 추진계획을 발표하였다. 이와 관련하여 지금까지 무공해 생물농약으로 뛰어난 살충효과가 뛰어난 미생물인 Bacillus thurm- 歩绷祝Bt)는 지난 30년 동안 수억달러 규모의 생물학적 살총제 시장에서 거의 독보적인 위치를 차지해 왔으나, 최근 한정된 방제해충의 범위와 BI독소에 저항성을 나타내는 곤충들이 출현하기 시작하면서 새로운 생물살충제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
2 g/L MgSQi - 7H:O, 5 g/L NaCl, 10 입L yeast extract를 침가한베지에 무기염 K2HPO% NH4H2PO4, MgSQ - 7H2O, NaCl을 각각 다른 농도로 첨가하여 베양했을 때의 최대 세포농도를 나타닌 것이다. K2HPO4와 NH4H2PS를 0-5 g/L 빔 위 내에서 농도를 달리하여 배양한 결과 큰 차이는 없었지만, k2hpo4 는 3 g/L에서, NUHPd는 1 g/L에서 최적 성장을 노였다, 또한 MgSO^THK)의 경우에도 성장에 큰 영향을 미치지 않은 반면 10 g/L NaCl 이상의 농도에서는 증식이 억제되었다.
Steinerneina carpocapsae 선충으로부터 공생박테리아를 분리하기 위한 세 가지 방법에서 모두 동일한 균주가 분리되었으며, 生한 순수 분리된 간주를 YS 배양액에서 in vitro 베양헤본 결과 동일균주가 두 가지 상태로 민화되는 동질미형화현상(ditnerpbisni)이 밭견되었다. 분리된 균주는 95기 탄소 원을 이용하는 Biolog 동정시스템을 사용하여 내장된 566 종/속의 그람 음성균 data base 와 비교한 결괴-, 유사도 Q543 로 Xetiorhabdus nematophilus 종의 균주로 동정 결과를 보였으며, phase I과 II 모두 nutrient agar에서는 연한 노란색을.
보여준다. Yeast extract 농도에 따른 비성장 속도의 의존도를 Monod equation을 가정하여 비교해본 결과, 최대 비성장속도는 0.13 이고 Monod 상수값은 20 g/L였다. 이 결과를 Slemernema glasen 선충종으로부터 분리된 Xenorhabdus nematophilus (XR-DR)의 경우와 비교해 노면 최대 비성장속도는 0.
밭견되었다. 분리된 균주는 95기 탄소 원을 이용하는 Biolog 동정시스템을 사용하여 내장된 566 종/속의 그람 음성균 data base 와 비교한 결괴-, 유사도 Q543 로 Xetiorhabdus nematophilus 종의 균주로 동정 결과를 보였으며, phase I과 II 모두 nutrient agar에서는 연한 노란색을. Mac Conkey agar에서는 적갈색, 그리고 NBTA에서는 phase 7은 푸른색 혹은 녹색을 臣 있으나 phase II는 붉은색을 보였고 moTphology는 간 균(rod)의 형태를 보였다 (W).
배양시간에 따른 상등액의 독성 정도를 비교하기 위해서상등액을 원액, 2, 4, 8 베로 희식히.여 접종한 결과 배양 하루째가 가장 독성이 강하였는데, 베양시 긴이 경과함에 따라 오히려 독성이 조금씩 약화됨을 보여준다. 따라서 XR-PC의 경우 지수 성장기 초기에 가장 강한 독섬물질을 생산하는 것으로 사료되이현개 이들 독성물질을 분리하여 그 구■조를 규명하는 연구가 진헹되고있斗
13 이고 Monod 상수값은 20 g/L였다. 이 결과를 Slemernema glasen 선충종으로부터 분리된 Xenorhabdus nematophilus (XR-DR)의 경우와 비교해 노면 최대 비성장속도는 0.13 hr』 로 동일한 깂을 보였으나 Monod 상수값은 25 gL로 익: 간 차이를 보볐디-(17).
상 변화의 경우 정지기에서도 fennentor배양과 flask내양 모두 약 90% 이상 phase I이 유지되었다. 한편 꿀벌부채명나방에 대한구강독성을 시험해본 결과, X. Jieinatophilus 균주를 유충 사료에 첨가하면 꿀벌부채 명나방 유충의 정싱-적인 성장을 저해하였으며, 20여일 경과 후 완전히 유충을 사멸시키는 것 읖 확인하였다. 배양상등액을 유충에 직접 주사하였을 때 배양 24시한인 지수성장 기 초기에 가장 독성이 강하였으미, 배양시간이 경과함에 따라 독성이 점차 감소하였다.
후속연구
매우 흥미로운 결과로 pH 감소의 영향과 관련이 있을 것으로주정된다 그러나 정확한 원인은 앞으로 대사 산물의 분석 등을 통하여 보다 구체적으로 규명되어져야 할 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.