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문제 정의
- 본 논문에서는 lipstatin 생산을 위한 S. toxytricini의 주 발효 배지에 다양한 탄소원, 질소원, 지질 및 지방산 등을 첨가하여 배지 성분이 lipstatin 생산에 미치는 영향을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 Streptomyces toxytricini를 대상으로 배지 성분이 2차 대사산물인 lipstatin 생산에 미치는 영향을 조사하였다. Lipstatin은 S.
제안 방법
- 추출한 것을 사용하였다. Lipstatin 활성 측정에는 상기 췌장 lipase 반응액에 33.6 unit/ml의 췌장 lipase액과 0-400 ng/ml의 orlistat의 ethanol액을 첨가하여 반응시키고, lipstatin에 의한 lipase 활성의 억제 정도를 형광분석기로 측정하여 표준 검량곡선을 구하였다. 이 표준검량곡선을 이용하여 S.
- Lipstatin의 생합성 경로 연구에서 linoleic acid 등 불포화지방산을 원료로 하여 생산됨이 보고되었기(4, 5) 때문에, 여러 지방산을 발효 배지에 첨가하고 Hpstatin 생산량의 변화를 조사하였다. 이 때 사용한 지방산은 불포화 지방산인 linoleic acid 및 oleic acid, 포화지방산인 stearic acid 및 palmitic acid 이었다.
- S. toxytricini 배양에서 탄소원이 lipstatin 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해, glucose가 없는 TSB 배지를 기본 배지로 하고 여기에 다당류로 starch, 이당류로 lactose, sucrose, 단당류로 glucose, 당 분해물인 glycerol 등의 여러 탄소원을 2% 씩 첨가한 배지에서 발효를 실시하였다. 그 결과 탄소원을 공급하지 않은 TSB 배지와 비교하여 균체 성장과 lipstatin 생산량이 모두 증가하였다(Table 1).
- S. toxytricini의 Epstatin 발효에 미치는 질소원의 영향을 알아보기 위해 2% lactose와 0.25% K2HPO4, 그리고 0.5% NaCl로 구성된 배지를 기본 배지로 하여, 질소원으로써 casitone, peptone, soytone, tryptone, yeast extract와 같은 복합질소원, urea와 같은 유기 질소원, 그리고, (NH4)2SO4M나 KNO3와 같은 무기질 소원을 배지에 각각 2% (w/v) 씩 첨가하여 발효시켰다. 그 결과 1.
- 건조 균체량은 배양액 5 ml을 원심분리하여 얻은 균체를 증류수로 1회 세척한 후 60℃ 건조기에서 하룻밤 건조시켜 측정하였다. 또한 배양액 3 ml에 3배량의 ethyl acetate를 가하고 5시간 이상 rotator 상에서 교반하여 발효 생산된 lipstatin을 추출한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 ethyl acetate 층을 회수하였다.
- 1A). 따라서, 포화 직전 농도인 2.0 μg/ml의 췌장 lipase를 lipstatin 정량에 사용하기로 하고, lipstatin에 의한 췌장 lipase 효소 활성 저해 정도를 측정하였다. 이 때 lipstatin의 표준품으로 ethanol로 추출한 orlistat(tetrahydrolipstatin)을 6.
- 0, 5 mM EDTA)을 가하여 반응을 종결시켰다. 반응액은 335 nm의 excitation, 445 nm의 emission 파장에서 형광분석기(모델명 RF- 5301PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 형광을 측정하였다.
- 발효배지에 지질을 넣어주었을 때 lipstatin 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해, 2% lactose와 2% TSB로 구성된 배지에 여러 농도의 triolein을 첨가하고, S. toxytricini를 60시간 동안 진탕 배양한 후 생성된 Upstatin 양을 측정하였다(Table 5). 그러나 배양액을 ethyl acetate로 추출할 때 배지에 남아있던 triolein이 함께 추출되어, 췌장 lipase 효소 반응액이 뿌옇게 흐려져서 lipstatin을 정량하기가 어려웠다.
- toxytricini의 glycerol stock을 2% 되게 접종한 후, 281에서 200 rpm으로 교반하면서 3일간 배양하여 종 배양액 (seed culture)을만들었다. 이 종 배양액은 TSB 배지를 기본 배지(basal medium) 로 하여 다양한 탄소원, 질소원, 지질 및 지방산 등을 첨가한 발효 배지에 2%(v/v)씩 접종한 후 동일한 배양 조건에서 60시간 진탕 배양하여 발효를 실시하였다.
- 6 unit/ml의 췌장 lipase액과 0-400 ng/ml의 orlistat의 ethanol액을 첨가하여 반응시키고, lipstatin에 의한 lipase 활성의 억제 정도를 형광분석기로 측정하여 표준 검량곡선을 구하였다. 이 표준검량곡선을 이용하여 S. toxytricini 배양액의 ethyl acetate 추출액 중의 Hpstatin 양을 측정하였으며, 경우에따라 lipstatin의 ethanol 용액을 희석하여 사용하였다.
- 또한 배양액 3 ml에 3배량의 ethyl acetate를 가하고 5시간 이상 rotator 상에서 교반하여 발효 생산된 lipstatin을 추출한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 ethyl acetate 층을 회수하였다. 회수한 ethyl acetate 충은 증발 건조시킨 후 500μl ethanol 에 용해하여 시료를 만든 후, lipase 저해 활성을 측정하여 Upstatin 생산량을 구하였다. 모든 실험 결과는 3회 반복 실험하여 얻어진 결과의 평균치를 구하여 나타내었다.
대상 데이터
- Lipstatin 정량을 위한 표준품으로 orlistat(tetrahydrolipstatin)을 함유하는 Xenical® (Hoffman-La Roche, Switzerland)을 구입하여 ethanol로 추출한 것을 사용하였다. Lipstatin 활성 측정에는 상기 췌장 lipase 반응액에 33.
- 4)인 배지에서 3일 동안 배양한 후 25% glycerol stock을 만들어 -70℃에서 보관하였다. S. toxytricini 배양의 기본 배지로 tryptic soy broth (TSB) (1.7% casitone, 0.3% soytone, 0.5% NaCl, 0.25% KjHPQ)를 사용하였다.
- 본 연구에서 lipstatin 생산 균주로 S. toxytricini NRRL15, 443 을 Nothem Regional Research Laboratory (IL, USA)로부터 분양받아, L 당 soluble starch 10 g, casamino acid 0.3 g, KNO3 2 g, K2HPO4, 0.2 g, MgSO4 · 7H2O 50 mg, CaCO3 20 mg, 10 mg FeSO4 · 7H2O (pH 7.4)인 배지에서 3일 동안 배양한 후 25% glycerol stock을 만들어 -70℃에서 보관하였다. S.
데이터처리
- 회수한 ethyl acetate 충은 증발 건조시킨 후 500μl ethanol 에 용해하여 시료를 만든 후, lipase 저해 활성을 측정하여 Upstatin 생산량을 구하였다. 모든 실험 결과는 3회 반복 실험하여 얻어진 결과의 평균치를 구하여 나타내었다.
이론/모형
- Lipstatin 양을 정량하기 위해서 4-methylumbelliferyl oleate (Sigma-Aldrich, MO, USA)를 기질로 분해 생산되는 4- methylumbelliferori의 형광을 측정함으로써 Hpase 활성을 측정하는 형광분석법(8, 9)을 사용하였다. 이 방법에서는 200μ1 reaction buffer (25 μM 4-methylumbelliferyl oleate, 25 gg/ml bovine serum albumin (BSA), 2.
- 그러나 이 방법은 pH 변화를 측정하는데 상당한 어려움이 있었기 때문에, 유사한 성질을 가진 esterastin 정량에 이용되었던 방법으로 4-methylumbelliferyl oleate를 기질로 하여 생산되는 4-methylumbelliferon의 형광을 측정하는 형광분석법(8, 9) 으로 췌장 Hpase 활성을 측정하기로 하였다. 기질인 4- methylumbelliferyl oleate 농도를 25 μM로 고정시킨 후, 췌장 lipase의 양을 0〜5 μg/ml으로 증가시키면서, 반응액의 형광을 측정하여 가수분해 정도를 관찰한 결과, lipase의 양이 증가함에 따라 형광이 증가하였지만, 2.
성능/효과
- 5% NaCl로 구성된 배지를 기본 배지로 하여, 질소원으로써 casitone, peptone, soytone, tryptone, yeast extract와 같은 복합질소원, urea와 같은 유기 질소원, 그리고, (NH4)2SO4M나 KNO3와 같은 무기질 소원을 배지에 각각 2% (w/v) 씩 첨가하여 발효시켰다. 그 결과 1.7% casitone과 0.3% soytone으로 구성된 TSB 배지에서, lipstatin 생산이 가장 높게 나타났고 yeast extract와 soy tone을 첨가한 배지에서 균체 성장이 가장 좋았다(Table 3). 특히 yeast extract는 균체 성장에는 좋은 질소원이었으나 이를 첨가한 배지에서의 Hpstatin 생산량은 그다지 높지 않았고, urea, (NH4)2SO4, KNO3 등 유기 질소원이나, 무기 질소원을 공급한 배지와-질소원을 전혀 공급하지 않은 배지에서는 미생물이 거의 성장하지 않았다.
- toxytricini 배양에서 탄소원이 lipstatin 생산에 미치는 영향을 조사하기 위해, glucose가 없는 TSB 배지를 기본 배지로 하고 여기에 다당류로 starch, 이당류로 lactose, sucrose, 단당류로 glucose, 당 분해물인 glycerol 등의 여러 탄소원을 2% 씩 첨가한 배지에서 발효를 실시하였다. 그 결과 탄소원을 공급하지 않은 TSB 배지와 비교하여 균체 성장과 lipstatin 생산량이 모두 증가하였다(Table 1). 특히 단당류인 glucose와 당 분해물인 glycerol이 균체 성장에 가장 좋은 탄소원으로 밝혀졌으며, 이당류인 lactose나 sucrose를 공급한 배지에서 균체당 lipstatin 생산량이 가장 높았다.
- 25-400 ng/ml의 농도로 희석하여 1% 용량을 사용하였다. 그 결과, orlistat의 농도가 높아질수록 췌장 lipase에 의한 4-methylumbellifeiyl oleate의 가수분해가 저해되어 형광이 낮아짐을 관찰할 수 있었으며, 췌장 lipase의 활성 저해 정도가 orlistat에 의해 농도 의존적으로 일어남을 확인할 수 있었다(Fig. IB).
- 특히 이러한 현탁정도는 배지에 첨가한 triolein의 농도가 높을수록 더 심해졌다. 그럼에도 불구하고, 배지에 첨가한 triolein의 양이 증가할수록 균체량은 증가하였지만 lipstatin 생산은 억제되는 경향을 관찰할 수 있었다. 이는 아마도 triolein의 첨가로 S.
- 특히 yeast extract는 균체 성장에는 좋은 질소원이었으나 이를 첨가한 배지에서의 Hpstatin 생산량은 그다지 높지 않았고, urea, (NH4)2SO4, KNO3 등 유기 질소원이나, 무기 질소원을 공급한 배지와-질소원을 전혀 공급하지 않은 배지에서는 미생물이 거의 성장하지 않았다. 따라서 TSB를 lipstatin 생산을 위한 최적 질소원으로 선정하고, 이를 구성하고 있는 casitone과 soytone의 농도를 변화시키면서 최적 농도를 조사한 결과, 1.7% casitone과 0.3% soytone 농도에서 lipstatin이 가장 많이 생산되었다(Table 4). 유기 질소원 중 soytone 배지에서의 lipstatin 생산량이 높은 것은 다른 유기질 소원보다 soytone 내에 식물성 지방이 많이 함유되어 있어서 이로부터 분해된 지방산이 Upstatin 생산의 원료로 이용되어지기 때문인 것 같다.
- 특히 lipstatin의 3-hydroxytetradeca-5, 8-dienoic acid 부위가 linoleic acid로부터 합성이 된다는 가설(4)을 바탕으로 linoleic acid나 oleic acid와 같은 불포화지방산이 lipstatin 생산량을 증가시킬 것으로 기대하였지만, 이러한 불포화 지방산을 공급한 배지에서는 균체 성장이 좋지 않았고 Hpstatin 생산량도 비교적 낮게 나타났다. 오히려 포화지방산인 stearic acid를 공급한 배지에서 lipstatin 생산량이 아주 높게 나타남을 확인할 수 있었다(Table 6). 이는 아마도 S.
- 이상의 결과로부터 균체 성장과 lipstatin 생산에 있어 가장 좋은 탄소 원으로 2% lactose를 선정하였다.
- 탄소원으로써 lactose의 최적 농도를 알아보기 위하여, TSB 배지에 여러 농도의 lactose를 첨가하고 배양한 결과, 2% 이상의 농도에서는 균체 성장이 더 이상 증가하지 않았을 뿐만 아니라 lipstatin 생산량이 오히려 감소하는 경향을 보였다(Table 2). 이상의 결과로부터 균체 성장과 lipstatin 생산에 있어 가장 좋은 탄소 원으로 2% lactose를 선정하였다.
- 이 때 사용한 지방산은 불포화 지방산인 linoleic acid 및 oleic acid, 포화지방산인 stearic acid 및 palmitic acid 이었다. 특히 lipstatin의 3-hydroxytetradeca-5, 8-dienoic acid 부위가 linoleic acid로부터 합성이 된다는 가설(4)을 바탕으로 linoleic acid나 oleic acid와 같은 불포화지방산이 lipstatin 생산량을 증가시킬 것으로 기대하였지만, 이러한 불포화 지방산을 공급한 배지에서는 균체 성장이 좋지 않았고 Hpstatin 생산량도 비교적 낮게 나타났다. 오히려 포화지방산인 stearic acid를 공급한 배지에서 lipstatin 생산량이 아주 높게 나타남을 확인할 수 있었다(Table 6).
- 3% soytone으로 구성된 TSB 배지에서, lipstatin 생산이 가장 높게 나타났고 yeast extract와 soy tone을 첨가한 배지에서 균체 성장이 가장 좋았다(Table 3). 특히 yeast extract는 균체 성장에는 좋은 질소원이었으나 이를 첨가한 배지에서의 Hpstatin 생산량은 그다지 높지 않았고, urea, (NH4)2SO4, KNO3 등 유기 질소원이나, 무기 질소원을 공급한 배지와-질소원을 전혀 공급하지 않은 배지에서는 미생물이 거의 성장하지 않았다. 따라서 TSB를 lipstatin 생산을 위한 최적 질소원으로 선정하고, 이를 구성하고 있는 casitone과 soytone의 농도를 변화시키면서 최적 농도를 조사한 결과, 1.
- 그 결과 탄소원을 공급하지 않은 TSB 배지와 비교하여 균체 성장과 lipstatin 생산량이 모두 증가하였다(Table 1). 특히 단당류인 glucose와 당 분해물인 glycerol이 균체 성장에 가장 좋은 탄소원으로 밝혀졌으며, 이당류인 lactose나 sucrose를 공급한 배지에서 균체당 lipstatin 생산량이 가장 높았다. 이러한 결과는 미생물에서의 이차 대사산물 발효에서 성장에 좋은 탄소원이 2차 대사산물 생산을 억제하는 carbon catabolite repression 현상을 잘 보여주고 있다.
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