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문제 정의
- 본언구에서는 구내에서 서식하고 있는 곤충병원성 선충 중 Stemernema ct叩oc叩sae종으로부터 분리된 공생박테리아인 Xenorhabdus nemmophiMs가 생성하는 exotoxin 및 그 최적배양조건을 조사하였다
제안 방법
- 2 g/L MgSQ - 7H:O, 5 g/L NaCI을 기본 베지로 yeast cwact의 농도를 5, 10, 30. 50, 70 g/L로 증가시켜 배지를 조제하였다. 二런디음 XR-PC를 접종하여 시간에 따른 。。와 pH의 변화를 조사하였다.
- S cg/丿霓叩歐记로부터 분리한 공생박테리아, XR-PC가 꿀벌부치명나방 유충에 구강 독성(瑚 toxic网)을 가지는지를 조사하기 위해서 공기가 봉히는 petri dish에 쌀겨와 밀을 주성분으로 사굥히는 유충 사료 20 g을 채웠다. 공생박테리아 접종농도의 영향을 조사하기 위해 서 비〕양된 곰생빅-테리아 pellet을 전조 중량 23, 46, 230 mg으로 달리 하이 각각의 petii disb 에 넣고 유춤 사료 20 g과 싞었다 Cbngl은 증류수 1 mL에 유충 사료 20 g을 첨가한 petri dish를 시용하였다 체중이 약 63±3 mg 정도인 2령 단계의 꿀벌부체명 나방 유충을 각각 외 petri dish 당 10마리씩 첚가하고 25°C incubator에서 증식하면서 유충의 증식을 고사하였으며, 체중 변화와 함께 유충의 번데기, 나방 단계로의 생활사번화도 함께 조사하였다.
- 이때. 파! 는조절하지 않_ 고 배양을 실시하였다 균주가 f!a외:와 fenrentor에서 각각 배양함 경우 발생하는 상변화의 정도를 조사하기 위해서 배양액을 NBTA에 plate out하여 28°C에서 3-5일 배양한 후 콜로니의 색을 확인하였다. 이때 phae I은 BTBfbromot- hymol blue)를 흡수하여 푸른색 혹은 녹색인 반면, phase II는 붉은색을 보였다.
- 또한 5. carpocapsae 신충으로부터순수분리된 공생박테리아는 Biol%동정시스템을 이용하여 동정하였다(10
- 사굥히는 유충 사료 20 g을 채웠다. 공생박테리아 접종농도의 영향을 조사하기 위해 서 비〕양된 곰생빅-테리아 pellet을 전조 중량 23, 46, 230 mg으로 달리 하이 각각의 petii disb 에 넣고 유춤 사료 20 g과 싞었다 Cbngl은 증류수 1 mL에 유충 사료 20 g을 첨가한 petri dish를 시용하였다 체중이 약 63±3 mg 정도인 2령 단계의 꿀벌부체명 나방 유충을 각각 외 petri dish 당 10마리씩 첚가하고 25°C incubator에서 증식하면서 유충의 증식을 고사하였으며, 체중 변화와 함께 유충의 번데기, 나방 단계로의 생활사번화도 함께 조사하였다.
- 2, 4, 8베로 회석한다. 그리고 각각의 희석된 시료를 micrcKydnge를 이용하이3령 단계의 꿀벌 부채명나방 유중의 hemo顷nph에 邛L씩 조]종한 후, 접종된 꿀벌 부체명나방 유 춤은 25 °C imubacor에서 보관하딘서사멸시간을 조사하였다.
- 대상으로 최적배지조성과 배양조전, 상변화 특성 및 곤충 독성물질 역 기릍 조사하였다. 균주의 최직 배지 조성은 50-70 g/L yeast exrract, 3 g/L K^HPO4f 1 g/L NH4H2PCU, 2 g/L MgSO, ; .
- 여 콜로니를 분리하였다. 둘째, 꿀벌무채 멍나방 유충의 hemok ymph액읖 iiLilrieiic agar에 무균적으로 몇 방을 떨어트린 다음 표면 살균된 선충을 그 위에 미쟝 떨어트려 酮 시간 배양한 후선충이 hemolymph액에 분비한 공생박테리아이] 의 헤 생성된 콜로니를 분리하였다. 셋째, 선충올 꿀벌 부채명나방 유 춤에 접종한 지 花시간 후유춤 사체를 무균적으로 해부하여 사체 내 부액을 plate Qul하여 콜로니를 분리하였다 위의 방咽으로최퐁적으로 분리된 박데리아는 분리 메 이용한 곤충병원 성 션충과 공 배양 가능성을 조사하였다.
- 둘째, 꿀벌무채 멍나방 유충의 hemok ymph액읖 iiLilrieiic agar에 무균적으로 몇 방을 떨어트린 다음 표면 살균된 선충을 그 위에 미쟝 떨어트려 酮 시간 배양한 후선충이 hemolymph액에 분비한 공생박테리아이] 의 헤 생성된 콜로니를 분리하였다. 셋째, 선충올 꿀벌 부채명나방 유 춤에 접종한 지 花시간 후유춤 사체를 무균적으로 해부하여 사체 내 부액을 plate Qul하여 콜로니를 분리하였다 위의 방咽으로최퐁적으로 분리된 박데리아는 분리 메 이용한 곤충병원 성 션충과 공 배양 가능성을 조사하였다. 곰매양 가능성은 공생박데리이롤 NBTA에 plale oui하여 3-5일간 증식한 colony에 곤충병원성 선 층을 접중하여 정싱.
- 가%Q 5 g/L NaCI, 50 잉L yeast extract를 기뽄배지로 히.이 각가 10, 30, 50, 100 g/L로 달리 첨가 하이 베지를 조지] 한 후균주를 접좀하여 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 시용된 곤총병원 싱 선층인 Steiiiernenia aupocc- psw종으로부터 공생 박테리아의 분리를 위히 -여 다음의 세가 지방 법을 사용하였다. 첫찌L표면살균된 선츰을 YS 배지가 처가 된 튜므에 담아 vortex하여 선충을 파괴시킨 후 28rC shaking meubator에서 48시간 배양한 후 배잉:액을 nuiiient agar broino thymol blue tripliaiylleti-azolnim chloride (NBTA)이 plaie out히.
성능/효과
- 7H:O, 10 g/L NaCl이였으뎌, yeast extract의 농도가 균주성장 제한인 자로 작용하였다. Yeast extracl 놈도에 대한 비성장속도의 의존도를 Monod equation을 가징하이 비교해 본 결괴、최대 비성장 속도는 0.13 "'이고 Monocl 상수값은 20 g/L였다 배양 배지의 pH는 초刃 6-7에 관계없이 성장이 진행됨에 따라서 약 8S-9.5까지 증가하였으며, 7L 花rmcntoi 베양에서는 균주의 비성장 속도가 약 0 18 或로 Hasl베양it다 1.4베더 증가하였다. 상 변화의 경우 정지기에서도 fennentor배양과 flask내양 모두 약 90% 이상 phase I이 유지되었다.
- 이러한 문제점을 해결하기 위헤 세계 각국은 환경 친화적인 해충 방제의 필요성을 인식하고 이와 관뎐된 신기술기]발에 많은 노력을 집중하고 있다. 특히 지난 수년간 UNCED는 1999년까지 각국의 기존 화학농약 사용량의 25%를 줄이거나 대체하도록 가국에 권고하고 있으며, 우리나라도 국가행동 게획으로 2004년까지 현재 사용되고 있는 비료와 화학농약의 사용량을 5。%까지 줄이기나 대체하는 것으로 추진계획을 발표하였다. 이와 관련하여 지금까지 무공해 생물농약으로 뛰어난 살충효과가 뛰어난 미생물인 Bacillus thurm- 歩绷祝Bt)는 지난 30년 동안 수억달러 규모의 생물학적 살총제 시장에서 거의 독보적인 위치를 차지해 왔으나, 최근 한정된 방제해충의 범위와 BI독소에 저항성을 나타내는 곤충들이 출현하기 시작하면서 새로운 생물살충제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
- 2 g/L MgSQi - 7H:O, 5 g/L NaCl, 10 입L yeast extract를 침가한베지에 무기염 K2HPO% NH4H2PO4, MgSQ - 7H2O, NaCl을 각각 다른 농도로 첨가하여 베양했을 때의 최대 세포농도를 나타닌 것이다. K2HPO4와 NH4H2PS를 0-5 g/L 빔 위 내에서 농도를 달리하여 배양한 결과 큰 차이는 없었지만, k2hpo4 는 3 g/L에서, NUHPd는 1 g/L에서 최적 성장을 노였다, 또한 MgSO^THK)의 경우에도 성장에 큰 영향을 미치지 않은 반면 10 g/L NaCl 이상의 농도에서는 증식이 억제되었다.
- Steinerneina carpocapsae 선충으로부터 공생박테리아를 분리하기 위한 세 가지 방법에서 모두 동일한 균주가 분리되었으며, 生한 순수 분리된 간주를 YS 배양액에서 in vitro 베양헤본 결과 동일균주가 두 가지 상태로 민화되는 동질미형화현상(ditnerpbisni)이 밭견되었다. 분리된 균주는 95기 탄소 원을 이용하는 Biolog 동정시스템을 사용하여 내장된 566 종/속의 그람 음성균 data base 와 비교한 결괴-, 유사도 Q543 로 Xetiorhabdus nematophilus 종의 균주로 동정 결과를 보였으며, phase I과 II 모두 nutrient agar에서는 연한 노란색을.
- 보여준다. Yeast extract 농도에 따른 비성장 속도의 의존도를 Monod equation을 가정하여 비교해본 결과, 최대 비성장속도는 0.13 이고 Monod 상수값은 20 g/L였다. 이 결과를 Slemernema glasen 선충종으로부터 분리된 Xenorhabdus nematophilus (XR-DR)의 경우와 비교해 노면 최대 비성장속도는 0.
- 밭견되었다. 분리된 균주는 95기 탄소 원을 이용하는 Biolog 동정시스템을 사용하여 내장된 566 종/속의 그람 음성균 data base 와 비교한 결괴-, 유사도 Q543 로 Xetiorhabdus nematophilus 종의 균주로 동정 결과를 보였으며, phase I과 II 모두 nutrient agar에서는 연한 노란색을. Mac Conkey agar에서는 적갈색, 그리고 NBTA에서는 phase 7은 푸른색 혹은 녹색을 臣 있으나 phase II는 붉은색을 보였고 moTphology는 간 균(rod)의 형태를 보였다 (W).
- 배양시간에 따른 상등액의 독성 정도를 비교하기 위해서상등액을 원액, 2, 4, 8 베로 희식히.여 접종한 결과 배양 하루째가 가장 독성이 강하였는데, 베양시 긴이 경과함에 따라 오히려 독성이 조금씩 약화됨을 보여준다. 따라서 XR-PC의 경우 지수 성장기 초기에 가장 강한 독섬물질을 생산하는 것으로 사료되이현개 이들 독성물질을 분리하여 그 구■조를 규명하는 연구가 진헹되고있斗
- 13 이고 Monod 상수값은 20 g/L였다. 이 결과를 Slemernema glasen 선충종으로부터 분리된 Xenorhabdus nematophilus (XR-DR)의 경우와 비교해 노면 최대 비성장속도는 0.13 hr』 로 동일한 깂을 보였으나 Monod 상수값은 25 gL로 익: 간 차이를 보볐디-(17).
- 상 변화의 경우 정지기에서도 fennentor배양과 flask내양 모두 약 90% 이상 phase I이 유지되었다. 한편 꿀벌부채명나방에 대한구강독성을 시험해본 결과, X. Jieinatophilus 균주를 유충 사료에 첨가하면 꿀벌부채 명나방 유충의 정싱-적인 성장을 저해하였으며, 20여일 경과 후 완전히 유충을 사멸시키는 것 읖 확인하였다. 배양상등액을 유충에 직접 주사하였을 때 배양 24시한인 지수성장 기 초기에 가장 독성이 강하였으미, 배양시간이 경과함에 따라 독성이 점차 감소하였다.
후속연구
- 매우 흥미로운 결과로 pH 감소의 영향과 관련이 있을 것으로주정된다 그러나 정확한 원인은 앞으로 대사 산물의 분석 등을 통하여 보다 구체적으로 규명되어져야 할 것이다.
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