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문제 정의
- 이 들은 대부분의 식 물에 존재 하는데 polyphenol, flavonoid 및 그 유도체가 강한 항산화 작용이 있는 것으로 알려져 있다(14, 15). 따라서 본 연구에서는 음양곽의 기능성 연구 일환으로 페놀성 화합물과 항산화활성 중 DPPH 에 의한 수소공여능, linoleic acid의 산화방지활성 및 LDL에 의한 항산화활성 중심으로 연구한 결과를 밝혀 기능성 식품소재 제조에 필요한 기초자료를 얻고자 하였다.
- 본 연구의 목적은 음양곽의 기능성 연구의 일환으로 페놀성 화합물의 추출방법 과 DPPH에 의한 수소공여능, linoleic acid의 산화방지 활성 및 LDL에 의한 항산화 활성 등을 중심으로 연구한 결과이다. 음양곽에 60% ethanol 를 첨가하여 추출회수별 페놀성 화합물을 조사한 결과 3회까지 추출했을 때 약 96%가 추출되 었기 때문에 추출 횟수는 3회가 적당한 것으로 판단되었다.
제안 방법
- T Baker, USA) 에 통과시 키고, 증류수로세 척 하여 최 종적 으로 2 n止로 정 용하였다. 20 UL를 취 하여 RP-HPLC를 이용하여 2-hydroxypyrimidine으로서 MDA를 정량 분석하였다. 이때 HPLC의 조건은 C18 column(uBondapak 18, 0.
- 즉, 1차로 10℃에서 30 분간 원심 분리 (26, 000X W하여 잔여 혈구와 chylomicron 을 제거하였다. 2차로는 KBr을 첨가하여 밀도를 조정한 후 초고속원심 분리 기 (Beckman, USA)로 10℃에서 24시간 원심 분리(360, 000Xg, d=].210)하여 lipoprotein을 분리하고 이를 density gradient 초고속원심분리 (110, 000 xg, d=1.250, 1.225, 1.100, 1.000)로 10℃에서 24시간 실시하여 최종 LDL을 분리하였다. 분리된 LDLe phosphate gradient 용액(pH 7.
- 의한 산화과정을 유도하였다. 60% ethanol로 추출하여 동결 건조한 음양곽 추출물을 농도별 (200 ppm -1, 500 ppm)로 첨가하고 37℃에서 16시 간동안 반응시 킨 후 HPLC 방법으로 생성된 MDA의 양을 무첨가군과 비교하여 측정한 결과는 Fig. 2와 같으며 , 이 때의 산화저 해율은 [(무첨가군의 MDA 생성량-첨가군의 MDA 생성량)/무첨가 군의 MDA 생성량]X1000으로 계산하였다. 산화 저 해율은 200 ppm 농도에서 약 80%, 500 ppm에서 91%, 700 ppm에서 95%, 1,000 ppm에서 94%, 1,500 ppm 에서 90%로 나타났다.
- 553 nm에서 측정하였다. Conjugated diene의 측정은 LDL (0.25mg protein/mL) 반응액 에 음양곽을 0~ 100ppm 농도로 가하고, 40 UM FeCl2 와 20 11M H2O2를 가하여 37℃에서 1시간 진탕하며 반응 시 킨 후 234 nm에서 의 흡광도가 0.2 ~ 0.8 사이에 오도록 희석하여 측정 비교하였다(22).
- Linoleic acid를 기질로 하여 FeCl2(400 UM)와 H2O2 (200 (1M)를 가하여 생성 되는 active oxygen인 hydroxyl radical에 의한 산화과정을 유도하였다. 60% ethanol로 추출하여 동결 건조한 음양곽 추출물을 농도별 (200 ppm -1, 500 ppm)로 첨가하고 37℃에서 16시 간동안 반응시 킨 후 HPLC 방법으로 생성된 MDA의 양을 무첨가군과 비교하여 측정한 결과는 Fig.
- 2 mg BHT를 가하여 산화반응을 종결시켰다(18). 산화된 시료 중에 생성된 MDA(malondiadehyde)의 양은 Osawa 와 Shibamoto의 방법 (20)을 일부 변경하여 다음과 같이 HPLC(Waters, USA)로 분석 측정하였다. 즉, 산화된 시료 1 mg] 0.
- 5 g에 추출용매를 25 mL를 가하여 80℃에서 1 시간 추출한 뒤 여 과하고 5배 희 석 하여 분석 시 료로 사용하였다. 시료 1 mL와 folin 시약 1 mL을 혼합하여 실온에서 3분간 정 치 한 뒤 10% NazCQj용액 1 mL를 가하여 혼합하여 실온에서 1시간 정치한 후 700 nm에서 흡광도를 조사하였다.
- 음양곽에 15배으} 60% ethanol-l- 가하여 80℃에서 1시간씩 3 ~5회 까지 추출한 후 추출횟수에 따른 페 놀성 화합물 및 수율을 조사하였고, 추출용매에 따른 페놀성 화합물을 조사하기 위해서는 각각 15배의 물, 60% ethanol 및 60% ethanol 추출하고 농축하여 물로 재환원하여 페놀성 화합물 함량을 조사하는데 사용하였다.
- 음양곽을 대상으로 하여 페놀성 화합물을 비 색정 량 하고자 Folin-Denis법을 일부 변경하여 사용하였다(16). 음양곽 약 0.
- 즉, 음양곽의 60% ethanol 추출물을 냉동 건조한 후 0.003% 수용액 1 mL DPPH 용액 (DPPH 12 mg을 100 mL ethanol 에 완전히 용해 시 킨 후 100 mL 증류수를 가한 액 ) 4.0 血 가하여 10초 동안 진탕한 후 517 nm에서 10분간 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 항산화능은 DPPH에 대한 수소공여 능(hydrogen donating ability, EDA)을 517 nm에서 측정하였다(17). 즉, 음양곽의 60% ethanol 추출물을 냉동 건조한 후 0.
- 항산화물질의 가장 특징적 인 역 할이 oxidative free radical 반응을 이용하여 환원성 물질의 분석 시약인 DPPH 방법 에 따라 시간 경과에 따른 음양곽의 60% ethanol 추출물의 수소공여능을 조사한 결과는 Fig. 1과 같다. 반응 초기 에 약하게 항산화 활성을 나타났으며 , 시간이 경 과함에 따라 항산화 활성은 완만하게 증가하였다.
대상 데이터
- a-Tocopherol, caffeic acid, 1, 1, 3, 3-tetraethoxypripane (TEP), 2-hydroxypyrimidine, linoleic acid, polyethyleneglycol 및 sodium dodecyl sulfate(SDS) 등은 Sigma 사(USA)제품을 구입하여 사용하였고, LDL 분리용 신선 혈장(human fresh plasma)은 적십자혈액원의 협조로 연구용으로 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- Terpstra 등의 방법에 따라 신선혈장을 사용하여 LDL 을 다음과 같이 분리하였다(18, 20). 즉, 1차로 10℃에서 30 분간 원심 분리 (26, 000X W하여 잔여 혈구와 chylomicron 을 제거하였다.
성능/효과
- 항산화활성 조사에서 DPPH에 의한 수소공여 활성 은 반응초기에 높게 나타났으며 반응시간이 경 과함에 따라 완만하게 증가하였다. Linoliec acid 산화에 대한 산화방지 효과는 700 ppm 농도에서 약 95% 산화저해율을 나타났으며, LDL에 대한 산화 방지 효과는 500 ppm 농도에서 산화저 해율이 약 70% 로 나타났다.
- 시료농도 200 ppm에서 60%, 500 ppm에서 70%, 700 ppm에서 68%, 1,000 ppm에서 64%로 나타났다. 그 결과 500 ppm 농도로 첨 가시 산화저 해율은 약 70%로 가장 우수한 것으로 나타났으며, 그 이상의 첨가 구에서는 산화방지 효과는 완만하게 감소되는 것으로 나타났다. Lee와 Park(24) 이 연구한 홍미삼 추출물의 LDL에 대한 산화방지효과 실험 결과를 보면 200 ppm 첨 가시 25%로 가장 높은 산화 방지 효과가 있었으며, 음양곽의 추출물은 같은 농도에서 홍미 삼 추출물보다 약 35% 정도 더 높은 산화 방지 효과가 나타났다.
- 1과 같다. 반응 초기 에 약하게 항산화 활성을 나타났으며 , 시간이 경 과함에 따라 항산화 활성은 완만하게 증가하였다. 이러한 결과는 음양곽에 함유되어 있는 페놀성 화합물 및 flavonoids 류가 항산화 활성을 나타내는 물질로 추정된다(23).
- 중심으로 연구한 결과이다. 음양곽에 60% ethanol 를 첨가하여 추출회수별 페놀성 화합물을 조사한 결과 3회까지 추출했을 때 약 96%가 추출되 었기 때문에 추출 횟수는 3회가 적당한 것으로 판단되었다. 60% ethanol 추출물의 수율은 3회까지 추출했을 때 약 22%이었다.
- 60% ethanol 추출물의 수율은 3회까지 추출했을 때 약 22%이었다. 추출 용매에 따른 페놀성 화합물의 추출 효율은 물 추출구를 100%로 했을 때, 60% ethanol 추출구는 140%, 그리고 60% ethanol용액으로 추출한 뒤 농축하여 물로 부피를 재조정한 구는 133%로 조사되었다. 항산화활성 조사에서 DPPH에 의한 수소공여 활성 은 반응초기에 높게 나타났으며 반응시간이 경 과함에 따라 완만하게 증가하였다.
- 추출 용매에 따른 페놀성 화합물의 추출 효율은 물 추출구를 100%로 했을 때, 60% ethanol 추출구는 140%, 그리고 60% ethanol용액으로 추출한 뒤 농축하여 물로 부피를 재조정한 구는 133%로 조사되었다. 항산화활성 조사에서 DPPH에 의한 수소공여 활성 은 반응초기에 높게 나타났으며 반응시간이 경 과함에 따라 완만하게 증가하였다. Linoliec acid 산화에 대한 산화방지 효과는 700 ppm 농도에서 약 95% 산화저해율을 나타났으며, LDL에 대한 산화 방지 효과는 500 ppm 농도에서 산화저 해율이 약 70% 로 나타났다.
후속연구
- 그리고 Sparrow와 Olszewski(28) 및 Rankin 등(29)에 의하면 LDL의 산화는 세포내의 lipoxygenase 활성에 의하여 일어나며 페놀성 화합물이 lipoxygenas의활성을 억제한다고 하였다. 따라서 본 연구에 사용된 음양곽 60% ethanol 추출물에 함유되어 있는 페놀성 화합물은 다양한 항산화 활성 시스템에서 활성이 있는 것으로 조사되었으며, 이들 물질들을 기능성 신소재로서 활용 가 차가 높을 것으로 판단되며, 차후 음양곽에 함유되어 있는 페놀성 화합물의 물질들을 분리 및 정제 연구를 진행하고자 한다.
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