[국내논문]유전자 재조합 대장균의 세포성장과 Pyruvate Dehydrogenase Complex-E2 특이성 인간 모노클론 항체 생산에 대한 포도당과 초산의 영향 Effects of Glucose and Acetic Acid on the Growth of Recombinant E.coli and the Production of Pyruvate Dehydrogenase Complex-E2 Specific Human Monoclonal Antibody원문보기
유전자 재조합 대장균을 이용하여 pyruvate dehydrogenase complex-E2 특이성 인간 모노클론 항체의 Fab부분이 생산되 었다. 재조합 대장균의 고밀도 배양과 이를 통한 재조합 인 간 항체의 고생산성을 확보하기 위한 최적 전략을 개발하기 위해 포도당과 초산의 영향에 대해 조사하였다. 포도당의 농 도가 높을수록 세포의 성장속도는 빨라지고 포도당의 소모속 도도 빨라짐을 알 수 있었다, 이때 포도당의 소모속도가 빨 라질수록 초산의 대사 부산물로서의 생성속도도 빨라졌다. 그러나 포도당이 고갈되면 일단 축적된 초산은 에너지원으로 소모되기 시작하고 이때의 소모속도는 배지내의 포도당의 농 도에 의존함을 알 수 있었다. 즉 초기 포도당의 농도가 어느 정도 높아 잔존 포도당의 농도가 높은 경우, 초산의 생성 속 도는 높고 에너지원으로 소모되는 속도는 느려져서 초산의 축적현상이 기하급수적으로 증가한다. 이렇게 높은 포도당 농도에 따라 축적된 초산은 항체 생산을 저해하였고, 저해를 위한 임계 초산 농도는$0.6g/\ell$이었다. 발현에 의해 항체를 생산하는 시기에서는, 포도당 농도가 높을수록 세포성장이 증대되나 초산에 의 한 저해 현상 및 catabolic repression의 영 향으로 항체 생산이 감소하였다. 따라서 발현 후 항체의 생산을 증진시키기 위해서는 포도당과 초산의 농도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 중요하다. 그러므로 고말도 배양과 재조합 인간 항체의 높은 생산성을 확보하기 위해서는 배양 액내의 포도당과 초산의 농도를 정밀하게 조절하는 것이 절실히 요구된다.
유전자 재조합 대장균을 이용하여 pyruvate dehydrogenase complex-E2 특이성 인간 모노클론 항체의 Fab부분이 생산되 었다. 재조합 대장균의 고밀도 배양과 이를 통한 재조합 인 간 항체의 고생산성을 확보하기 위한 최적 전략을 개발하기 위해 포도당과 초산의 영향에 대해 조사하였다. 포도당의 농 도가 높을수록 세포의 성장속도는 빨라지고 포도당의 소모속 도도 빨라짐을 알 수 있었다, 이때 포도당의 소모속도가 빨 라질수록 초산의 대사 부산물로서의 생성속도도 빨라졌다. 그러나 포도당이 고갈되면 일단 축적된 초산은 에너지원으로 소모되기 시작하고 이때의 소모속도는 배지내의 포도당의 농 도에 의존함을 알 수 있었다. 즉 초기 포도당의 농도가 어느 정도 높아 잔존 포도당의 농도가 높은 경우, 초산의 생성 속 도는 높고 에너지원으로 소모되는 속도는 느려져서 초산의 축적현상이 기하급수적으로 증가한다. 이렇게 높은 포도당 농도에 따라 축적된 초산은 항체 생산을 저해하였고, 저해를 위한 임계 초산 농도는$0.6g/\ell$이었다. 발현에 의해 항체를 생산하는 시기에서는, 포도당 농도가 높을수록 세포성장이 증대되나 초산에 의 한 저해 현상 및 catabolic repression의 영 향으로 항체 생산이 감소하였다. 따라서 발현 후 항체의 생산을 증진시키기 위해서는 포도당과 초산의 농도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 중요하다. 그러므로 고말도 배양과 재조합 인간 항체의 높은 생산성을 확보하기 위해서는 배양 액내의 포도당과 초산의 농도를 정밀하게 조절하는 것이 절실히 요구된다.
The Fab fraction of PDC-E2 specific human monoclonal antibody was produced using recombinant E. coli, and the effects of glucose and acetate were investigated to develop an optimal strategy for recombinant human antibody production. Higher glucose concentration in the culture media resulted inn high...
The Fab fraction of PDC-E2 specific human monoclonal antibody was produced using recombinant E. coli, and the effects of glucose and acetate were investigated to develop an optimal strategy for recombinant human antibody production. Higher glucose concentration in the culture media resulted inn higher cell growth and glucose consumption rate, which in turn resulted in an increased acetate production rate. When glucose was depleted, cells began to consume acetate as an energy source, and this consumption rate depended on the glucose concentration. When the residual glucose concentration was high, the accumulation of acetate was accelerated due to an increase in the acetate production rate and a decrease in the acetate consumption rate. Futhermore, it was found that a high accumulation of acetate, accompanied by a high glucose concentration, inhibited human antibody formation; the critical acetate concentration was $0.6g/\ell$. During production, a high glucose concentration enhanced cell growth, but inhibited antibody formation due to catabolic repression. Therefore, it is important to keep the concentration of both glucose and acetate as low as possible to increase antibody production after induction. Accordingly, it is important to accurately control the concentration of glucose and acetate in the culture media to obtain high cell densities and high productivity levels of recombinant human antibody.
The Fab fraction of PDC-E2 specific human monoclonal antibody was produced using recombinant E. coli, and the effects of glucose and acetate were investigated to develop an optimal strategy for recombinant human antibody production. Higher glucose concentration in the culture media resulted inn higher cell growth and glucose consumption rate, which in turn resulted in an increased acetate production rate. When glucose was depleted, cells began to consume acetate as an energy source, and this consumption rate depended on the glucose concentration. When the residual glucose concentration was high, the accumulation of acetate was accelerated due to an increase in the acetate production rate and a decrease in the acetate consumption rate. Futhermore, it was found that a high accumulation of acetate, accompanied by a high glucose concentration, inhibited human antibody formation; the critical acetate concentration was $0.6g/\ell$. During production, a high glucose concentration enhanced cell growth, but inhibited antibody formation due to catabolic repression. Therefore, it is important to keep the concentration of both glucose and acetate as low as possible to increase antibody production after induction. Accordingly, it is important to accurately control the concentration of glucose and acetate in the culture media to obtain high cell densities and high productivity levels of recombinant human antibody.
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문제 정의
재조합 대장균의 고밀도 배양과 이를 통한 재조합 인간 항체의 고생산성을 확보하기 위한 최적 전략을 개발하기 위해 포도당과 초산의 영향에 대해 조사하였다. 포도당의 농도가 높을수록 세포의 성장속도는 빨라지고 포도당의 소모속도도 빨라짐을 알 수 있었다.
이때 한 개의 plasmid에 함께 삽입되어진 각각의 heavy와 light chain은 대장균의 세포질에서 생산된 후 pelB leader sequence0]] 의해 periplasmic space로 이동하게 되며, 이곳에서 heavy와 light chain 사이에 disulfide 결합이 형성되어 항원 결합 능력이 있는 Fab 분자가 생성된다. 이러한 인간 모노클론 항체의 대량생산 기술의 실용화를 최종 목표로, 본 연구에서는 재조합 대장균을 이용한 생물반응기에서의 인간 모노클론 항체의 대량 생산을 위한 최적의 전략을 제시하기 위한 기초 연구로 세포 성장과 항체 생산에 미치는 포도당과 초산의 영향에 대해 조사하였다. 왜냐하면, 대장균은 여러 가지 장점으로 인하여 가장 먼저 여러 종류의 재조합 단백질의 산업적 생산을 위한 숙주세포로 널리 사용되어 왔으나 대장균의 세포성장이 배양 중 분비 축적되는 초산 및 에타놀 등에 의해 저해를 받으며, 특히 호기성 조건에서는 초산이 세포 성장 및 유전자 재조합 단백질의 생산성을 저해하는 주된 원인으로 보고되었기 때문이다(12).
따라서 재조합 대장균의 고농도 세포 배양과 생산성 향상을 위해서는 대장균의 대사에서 형성되는 부산물의 하나인 초산의 영향에 대한 이해가 필요하다. 이에 따라 본 연구에서는 미토콘드리아의 내막에 존재하면서 해당작용의 결과물인 pyruvate 를 acetyl CoA로 변환시키는데 촉매 역할을 하는 것으로 알려진 pyruvate dehydrogenase complex-E2 (PDC-E2) 에 특이적으로 반응하는 인간 모노클론 항체(항체의 Fab 부분)를 모델로 하여 유전자 재조합 대장균의 세포성장과 인간 모노 클론 항체 생산에 대한 포도당과 초산의 영향을 조사함으로써 재조합 대장균에 의한 인간 모노클론 항체의 대량생산을 위한 전략 개발에 기초 정보를 제공하고자 한다. 이를 위해 먼.
제안 방법
이에 따라 본 연구에서는 재조합 대장균을 이용한 인간 항체 생산의 한 모델로서 항 pyruvate dehydrogenase complex-E2 인간 모노클론 항체를 람다 바이러스 벡터를 이용해 제작하였으며, plasmid에 삽입되어진 항체 유전자를 대장균 (Topp2) 에서 발현, 생산하였다. 이때 한 개의 plasmid에 함께 삽입되어진 각각의 heavy와 light chain은 대장균의 세포질에서 생산된 후 pelB leader sequence0]] 의해 periplasmic space로 이동하게 되며, 이곳에서 heavy와 light chain 사이에 disulfide 결합이 형성되어 항원 결합 능력이 있는 Fab 분자가 생성된다.
이를 위해 먼. 저포도당이 세포성장에 미치는 영향과 이로 인해 축적된 초산이 항체 생성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 후에 인위적으로 첨가된 초산에 의하여 세포성장과 항체 생성에 미치는 영향을 조사하였다.
Fab를 발현하는 플라스미드 DNA에는 inducer 로 IPTG (isopropyl g-D-thiogalactopyranoside) 를 사용하는 lac promoter가 쓰였으며 ampicillin에 저항성을 갖는다. 한 개의 플라스미드에 함께 삽입되어진 각각의 heavy와 light chain은 대장균의 세포질에서 생산된 후 pelB leader sequence에 의해 periplasmic space로 이동하게 되며, 이 periplasm에서 heavy와 light chain 사이에 disulfide 결합이 형성되어 항원 결합 능력이 있는 Fab 분자가 생성되도록 하였다.
p-7032) 로서 carbonate-coating buffer와 함께 최종농도가 10 您/m H 가 되도록 하여 4°C에서 하룻밤동안 coating하였다. 여기에 분리한 상등액을 적절히 희석하여 37°C에서 1시간동안 반응시킨 후 이차 항체인 alkaline phosphatase conjugated goat anti-human IgGfFab specific) 을 반응시켰다. 그 후 p-nitrophenyl phosphatate (Sigma, No.
여기에 분리한 상등액을 적절히 희석하여 37°C에서 1시간동안 반응시킨 후 이차 항체인 alkaline phosphatase conjugated goat anti-human IgGfFab specific) 을 반응시켰다. 그 후 p-nitrophenyl phosphatate (Sigma, No. N9389)를 기질로 사용하는 alkaline phosphatase-nitrophenyl phosphatate 방법을 이용하여 밝은 노란색으로 발색시켜 ELISA reader로 분석하였다.
재조합 대장균에 탄소원으로서 포도당이 배양초기에 첨가되었을 경우 (growth phase)와 발현을 유도할 때 첨가된 경우 (production phase) 에, 포도당 및 포도당을 대사하는 과정에서 우회하여 생성되는 초산이 세포성장 및 Fab 항체 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 한편 인위적으로 여러 농도의 초산을 배양초기에 .
한편 인위적으로 여러 농도의 초산을 배양초기에 .첨가하거나 (growth phase), 발현을 유도할 때 첨가하여 (production phase) 세포성장과 Fab 생성에 미치는 초산의 저해 효과를 조사하였다.
여러 농도의 포도당을 배양초기에 첨가해줌으로써 이에 따른 세포 성장, 포도당 소모 kinetics, 축적된 초산 농도와 항체 생산성을 비교 검토하였다. Figure 1에서는 포도당의 농도가 높을수록 세포 성장 속도가 빨라지는 것을 알 수 있었으며, 포도당의 농도가 낮을수록 빠른 시간 내에 영양분 고갈현상이 일어났다.
항체 발현을 유도할 때에 포도당을 첨가한 경우의 세포 성장, 포도당 소모 kinetics, 초산 생성 및 항체 생산 kinetics에 대해 조사하였다. 이 실험은 lac promoter에서 발생할 수 있는 catabolic repression에 대한 확인 실험이라고 볼 수 있다.
생성에 중요한 영향을 미친다. 이를 실험적으로 증명하기 위해 인위적으로 여러 농도의 초산을 배양초기 (growth phase)에 첨가하거나, 발현을 유도할 때 (production phase) 첨가함으로써 그 저해 효과를 확인하였다. Figure 5a와 Figure 6a 은 growth phase 및 production phase에서의 세포 성장을 비교한 것으로 포도당을 첨가했을 때 보다 세포 성장이 2.
대상 데이터
Pyruvate dehydrogenase complex-E2(PDC-E2)에 특이적으로 반응하는 인간 모노클론 항체의 Fab 부분을 생산하는 균주인 Topp2 세포를 강원대학교 식품생명공학부의 차상훈 교수로부터 제공받았다. Fab를 발현하는 플라스미드 DNA에는 inducer 로 IPTG (isopropyl g-D-thiogalactopyranoside) 를 사용하는 lac promoter가 쓰였으며 ampicillin에 저항성을 갖는다.
이론/모형
인간 모노클론 항체 Fab의 농도는 enzyme-linked immunoassay (ELISA) 방법을 이용하여 405 nm 에서 측정하였다. Fab 발현유도가 끝난 후 배양액을 20분 동안 14, 000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 시료로 얻었다.
성능/효과
Figure 4b 에서 보이듯이 항체 생산은 포도당의 소모에 따른 세포 성장증가와는 거의 반비례하여 포도당이 첨가되지 않은 경우가 가장 항체 생산이 높았다. 이러한 결과로 볼 때 growth phase 에서는 초산의 농도가 낮을수록, 그리고 production phase에서는 잔여 포도당 농도가 낮을수록 항체 생산에 더 기여하는 것을 확인할 수 있었다. 그 이유로서는 물론 포도당 농도가 감소함에 따른 초산 저해현상의 감소가 직접적인 영향이 되겠지만 본 연구에서 사용한 세포가 lac promoter를 사용하기 때문에 inducer인 IPTG의 작용을 포도당이 repression하는 catabolic repression0] 발생한 것도 다른 이유로 추측할 수 있다.
Figure 5b와 Figure 6b은 항체 생산성을 보여주고 있는데 포도당을 첨가했을 때보다 항체의 생산성이 약 7배 이상 저하되었다. 이로써 초산이 세포 성장뿐만 아니라 항체 생산성에도 치명적인 저해현상을 초래함을 확인하였다.
그외에 metabolic engineering(15)을 통하여 초산 생성을 감소시키는 방법 등 여러 가지 다양한 방법들이 개발되고 있다. 따라서 유전자 재조합 대장균을 이용하여 pyruvate dehy drogenase complex-E2 특이성 인간 모노클론 항체의 Fab 부분을 생산할 경우 초산 농도의 조절은 생산성 향상을 위해 매우 중요하며, 대량 생산에서는 위에 언급된 초산의 형성을 줄이기 위한 전략이 적어도 하나 이상이 결합되어야 경제성 있는 생산이 보장될 것이다.
재조합 대장균의 고밀도 배양과 이를 통한 재조합 인간 항체의 고생산성을 확보하기 위한 최적 전략을 개발하기 위해 포도당과 초산의 영향에 대해 조사하였다. 포도당의 농도가 높을수록 세포의 성장속도는 빨라지고 포도당의 소모속도도 빨라짐을 알 수 있었다. 이때 포도당의 소모속도가 빨라질수록 초산의 대사 부산물로서의 생성속도도 빨라졌다.
후속연구
매우 유리한 장점을 지니고 있다. 따라서 이 기술은 앞으로 인체의 in vivo 상태에서 사용되어질 항체 진단제 또는 치료제의 개발에 관한 응용 가능성이 매우 크기 때문에 장래가 유망하며 이에 따라 이의 실용화를 위한 체계적인 연구가 시급한 실정이다.
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