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제안 방법
- 4회 methanol 추출 후 추출액의 농축은 rotary evaporator0]]^ 수행되었으며 농축조건은 635 mmHg, 40℃ 에서 이루어 졌다. Methanol 추출액을 농축하고 (1/5-1/8) 농축액에 methylene chlo-Hde를 첨가하여 (methanokmethylene 아iloride=5:l) 액/액 추출을 실시하여 methanol 농축액에 존재하는 극성불순물 (polar impurity)을 먼저 제거하였다. 액/액 추출은 회분식으로 3회에 걸쳐 실시하였으며 액/액 추출을 통하여 극성불순물이 제거된 methylene chloride 용액을 rotary evaporator (450 mmHg, 30°0에서 농축하고 건조하여 사용하였다 건조물에 포함되어있는 타르성분은 흡착제 (active clay)를 이용하여 제거하고, hexane 침전과 분별침전 공정으로 각각 비극성불순물과 극성불순물들을 제거하여 순도 70% crude paclitax이을 HPLC 정제 공정에 이용하였다<8).
- 추출하였다. Methanol과 biomass 혼합비는 1:1(1 kg biomass/ 1 L methanol)로 하였으며 반응시간은 1회 10분으로 하였다. 4회 methanol 추출 후 추출액의 농축은 rotary evaporator0]]^ 수행되었으며 농축조건은 635 mmHg, 40℃ 에서 이루어 졌다.
- Methanol을 이용하여 biomass내 paclitaxel을 4회 회분식으로 추출하였다. Methanol과 biomass 혼합비는 1:1(1 kg biomass/ 1 L methanol)로 하였으며 반응시간은 1회 10분으로 하였다.
- 분석하였다<9). NMR 실험을 위해서는 Bruker, DRX-300 (Germany)를 사용하였으며, 시료 수 mg을 CDCb 용매에 녹여 p, l3C NMR 실험 및 DEPT, COSY, HETCOR 등의 실험을 통하여 각 성분의 분자구조를 분석하였다. 분자구조가 추정된 화합물의 대해서는 FAB mass spectrometry로 분자량을 확인하였는데 AMD Intectra (Harpstedt, Germany)를 사용하였匸h Source temperature, 69℃; accelerating voltage, 6kV; scan range, m/z 100-1000; scan rate, 35s/cycle; resolution, 1000의 조건 하에서 Cs* 이온을 분자 이온 sourced.
- ODS HPLC cokimn에서 분취한 paclitaxel 함유 분획을 10 mmHg의 진공 및 35℃ 온도에서 감압 건조시키고, 수득한 건조물 중 209.3 mg을 취하여 methylene chloride 2 mL에 용해시켜 다시 silica HPLC column 에 주입시킨 다음, methylene chloride:inethanol (98:2, v/v) 혼합용액을 용리액으로 사용하고, Table 1의 조건에서 용출 시키면서 자외선 검출기로 paclitaxel의 존재 여부를 검출한 결과, 체류시간 40-70분의 분획에서 paclitaxel] 검출되어 이들 분획을 분취하였다. Normal-phase column (silica)을 통하여 주로 paclitaxel보다 극성인 불순물을 효과적으로 제거하게 된다.
- 건조된 잎을 methylene chloride와 methanol (1:1)로 먼저 추출한 다음 건조물을 methylene chloride와 물로 partition 하고 celite 545와 silica gel chromatography< 연속적으로 처리하여 crude paclitaxel를 제조하였다. 최종적으로 reverse-phase HPLC column 에 의하여 paclitaxel (>98%)를 정제하였다.
- 첫째, 고순도와 고수율의 대량 정제방법을 개발하였다. 둘째, 최종 정제된 paclitax이 내에 포함되어 있는 불순물 profile 확인, 함량 분석, 그리고 이들 물질들에 대한 분리, 정제 및 동정을 실시하였다.
- 즉, 첫번째 단계에서 reverse-phase HPLC column, 두번째 단계에서 normalphase HPLC cohimn을 사용하여 최종 제품을 얻었다. 또한 최종 정제된 paclitaxel 내에 포함되어 있는 불순물 profile 확인, 함량 분석, 그리고 이들 물질들에 대한 분리, 정제 및 동정을 실시하였다. 이들 불순물들 중에서 0.
- 분리/정제된 taxane derivative는 NMR과 MS 등을 사용하여 화학구조를 분석하였다<9). NMR 실험을 위해서는 Bruker, DRX-300 (Germany)를 사용하였으며, 시료 수 mg을 CDCb 용매에 녹여 p, l3C NMR 실험 및 DEPT, COSY, HETCOR 등의 실험을 통하여 각 성분의 분자구조를 분석하였다.
- 분별침전공정에서 수득한 paclitaxel 분말 (순도:70%) 299 mg을 methanol 3 mL에 용해시켜 ODS Cis HPLC column (500 X 500 mm)에 주입시킨 다음, methanol과 물의 65:35(v/v) 혼합용액을 용리액으로 사용하고, Table 1의 조건에서 용출시키면서 자외선 검출기로 paclitaxel의 존재 여부를 검출한 결과, 체류시간 40-47분의 분획에서 paclitaxel 이 검출되어 이들 분획을 분취하였다. Reverse-phase column (CM)을 통하여 주로 paclitaxel보다 비극성인 불순물을 효과적으로 제거하게 된다.
- Normal-phase column (silica)을 통하여 주로 paclitaxel보다 극성인 불순물을 효과적으로 제거하게 된다. 분취액을 rotary evaporator 및 진공건조기를 사용하여 진공건조시켜 paclitaxel 결정 170.5 mg을 90%의 회수율로 수득하였다. 얻어진 paclitaxel을 HPLC를 사용하여 정량 분석한 결과 순도는 98.
- Methanol 추출액을 농축하고 (1/5-1/8) 농축액에 methylene chlo-Hde를 첨가하여 (methanokmethylene 아iloride=5:l) 액/액 추출을 실시하여 methanol 농축액에 존재하는 극성불순물 (polar impurity)을 먼저 제거하였다. 액/액 추출은 회분식으로 3회에 걸쳐 실시하였으며 액/액 추출을 통하여 극성불순물이 제거된 methylene chloride 용액을 rotary evaporator (450 mmHg, 30°0에서 농축하고 건조하여 사용하였다 건조물에 포함되어있는 타르성분은 흡착제 (active clay)를 이용하여 제거하고, hexane 침전과 분별침전 공정으로 각각 비극성불순물과 극성불순물들을 제거하여 순도 70% crude paclitax이을 HPLC 정제 공정에 이용하였다<8).
- 건조시료 8 mg을 200 L에 녹인 것을 loading하여 여러가지 taxane derivative# 을 분리한 후 용매를 제거하여 각각의 성분이 약 10 mg-100 mg이 되도록 위의 과정을 반복하였다. 위의 방법으로 분리된 각 성분은 구조분석에 필요한 정도의 순도(>90%)로 만들기 위해 같은 기기를 사용하여 2차로 정제를 하였는데 이때는 정제하고자 하는 성분에 맞게 H2O/CH3CN의 비율이 7이 30에서 2이80 사이의 isocratic elution 방법으로 정제 하였다.
- Pa이itaxel의분리/정제에 대한 다른 접근 방법이 1992년 Vanhaelen-Fastri 등(3)에 의하여 보고되었다. 유기용매를 이용하여 추출한 후에 partition (methanol, water/methylene diloride) 단계를 거쳐 전처리 단계로 column chromatography (silica gel, eluant : hexane/acetone)를 사용하였다 최종 정제 단계로 high speed countercurrent chromatography (HSCCC)를 사용 하였으며 최종 제품 내 cephalomannine 과 paclitaxel 는 preparative HPLC 를 이용하여 분리하였다. 이와 유사한 방법으로 1991년 Zhang 등(4), 1993년 Castor 등(5), 1995년 Rao 둥(6) 에 의하여도 paclitaxel를 분리/정제 하였다.
- 이러한 이유로 두 단계 HPLC system으로 식물세포 배양액으로부터 paclitaxel의 대량 정제를 수행하였다. 즉, 첫번째 단계에서 reverse-phase HPLC column, 두번째 단계에서 normalphase HPLC cohimn을 사용하여 최종 제품을 얻었다.
- 이들의 정제 단계를 보면 건조된 식물체를 유기용매로 추출하고 partition에 의하여 비극성 불순물 (왁스성분 등) 또는 극성 불순물을 제거하였다. 전처리 단계는 고가의 chromatography (silica gel, Sephadex LH-20, celite)를 이용하였으며 최종 정제 단계로 open column 아iromatography/HPLC chromatography를 이용하여 정제하였다. 이러한 공정에서의 문제점은 많은 유기용매 사용과 전처리 단계에서의 column chromatography 사용으로 인한 비경제적인 공정이라는 것이다' 또한 제품의 품질관리와 허가를 위한 정제된 최종 제품 내에 존재하는 불순물의 profile, 함량, 동정 (identification) 등에 대해서는 전혀 언급이 없다.
- 이러한 이유로 두 단계 HPLC system으로 식물세포 배양액으로부터 paclitaxel의 대량 정제를 수행하였다. 즉, 첫번째 단계에서 reverse-phase HPLC column, 두번째 단계에서 normalphase HPLC cohimn을 사용하여 최종 제품을 얻었다. 또한 최종 정제된 paclitaxel 내에 포함되어 있는 불순물 profile 확인, 함량 분석, 그리고 이들 물질들에 대한 분리, 정제 및 동정을 실시하였다.
- 이러한 관점에서 볼 때 본 연구는 두 가지 측면에서 그 의미가 있다. 첫째, 고순도와 고수율의 대량 정제방법을 개발하였다. 둘째, 최종 정제된 paclitax이 내에 포함되어 있는 불순물 profile 확인, 함량 분석, 그리고 이들 물질들에 대한 분리, 정제 및 동정을 실시하였다.
- 건조된 잎을 methylene chloride와 methanol (1:1)로 먼저 추출한 다음 건조물을 methylene chloride와 물로 partition 하고 celite 545와 silica gel chromatography< 연속적으로 처리하여 crude paclitaxel를 제조하였다. 최종적으로 reverse-phase HPLC column 에 의하여 paclitaxel (>98%)를 정제하였다. 1991년 Cardellin以 11(2)에 의하여 Taxus *印(/泌, 의 껍질로부터 paclitaxel 분리/ 정제 공정에 관하여 보고하였다 건조된 껍질을 methanol로 먼저 추출한 다음 건조물을 hexane으로 partition하여 왁스 성분 등을 제거하였다, Aqueous phase에 carbon tetrachloride를 첨가하여 추출하고 사iromatography (Sephadex LH-20, eluant : methanol/methylene chloride)로 전처리하고 최종 normal-phase chromatography(CN-bonded phase column, eluant : hexane/ isopropyl ale사lol)에 의하여 최종 정제를 하였다.
대상 데이터
- 하였다. Curosil PFP column (21 X 250 mm)이 사용되었으며, peak 확인을 위하여 흡광도 227 nm에서 UV detector 를 사용하였다. H2O/CH3CN 공용매를 65/35에서 35/65로 40 분간 2 mL/min 유속으로 gradient elution 하였고 35/65에서 70분간 방치하여 column을 세척하였다.
- 6 nun, Shiseido, Japan), column 온도는 40℃, 이동상은 CH3CN/Water (20-100% gradient), 유속은 L0 miymin, sample 주입량은 10 “L 이며, UV(227 nm) detector를 사용하였다. Paclitaxel 표준물질은 Sigma, 각종 유도체는 Hauser 제품을 사용하였다.
- 이용하였다(7). 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 데칸터 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)를 이용하였으며, 식물세포조각 (cell debris) 회수를 위하여 고속 원심분리기 (q-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 biomass라 하였다.
- 본 연구에 사용된 배양액은 Taxus 아功仞頌忑의 잎으로부터 얻은 세포주를 이용하여 3000 L 발효조에서 배양한 배양액을 이용하였다(7). 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 데칸터 (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter)를 이용하였으며, 식물세포조각 (cell debris) 회수를 위하여 고속 원심분리기 (q-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다.
- 분석 후 평균값을 취하였다. 분석에 사용한 columne Capcell Pak Cis UG 120(250 mm X 4.6 nun, Shiseido, Japan), column 온도는 40℃, 이동상은 CH3CN/Water (20-100% gradient), 유속은 L0 miymin, sample 주입량은 10 “L 이며, UV(227 nm) detector를 사용하였다. Paclitaxel 표준물질은 Sigma, 각종 유도체는 Hauser 제품을 사용하였다.
데이터처리
- HPLC (Waters) 분석 방법에 의하여 paclitaxel 과 taxane derivative 함량을 분석하였으며(8) 모든 samplee 3개씩 취하여 분석 후 평균값을 취하였다. 분석에 사용한 columne Capcell Pak Cis UG 120(250 mm X 4.
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