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문제 정의
- 본 연구에서는 식물세포인 Taxus chinensis 대량 배양액으로부터 생산되는 여러 가지 유도체들에 대한 분리와 동정으로 paclitaxel이외의 여러 가지 유도체 생산 경향을 파악하는 데 그 목적이 있다. 이러한 연구는 결국 paclitaxel 이외의 새로운 유용성분 및 전구체 확인, 분리/정제 방법의 개발, paclitaxel 생산 품질관리에 유용하게 사용되어질 수 있다
제안 방법
- HPLC 분석 방법에 의하여 paclitaxel 과 taxane derivative 함량을 분석하였으며(6) 모든 샘플은 3개씩 취하여 분석 후 평균값을 취하였다. 채취한 샘플 2 mL에 내부 표준 (internal standard) 용액 100 μL (6.
- 분석하였다 (7). NMR 실험을 위해서는 Bruker, DRX-300 (Germany)를 사용하였으며, 시료수 mg을 CDCb용매에 녹여 'H, 13C NMR 실험 및 DEPT, COSY, HETCOR 등의 실험을 통하여 각 성분의 분자구조를 분석하였다. 분자구조가 추정된 화합물의 대해서는 FAB mass spectrometry로 분자량을 확인하였는데 AMD Intectra (Harpstedt, Germany)를사용하였다.
- 5 mL 를 첨가하고 밤새 교반하였다.교반 후상등액을 취하여 amino propyl SPE cartridges (Alltech, Cat. #211025)를 통과시킨 후 methyl-t-butyl ether/methanol (85/15, v/v) 용액 3 mL 로 세척 하고 여액을 건조한 후에 0.5 mL 메탄올에 녹여 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼은 Capcell Pak Ci8 UG 120 (250mm X 4.
- 메탄올을 이용하여 biomass내 paclitaxel을 4회 회분식으로 추출하였다. 메탄올과 biomass 혼합비는 1:1 (biomass kg/1 이용하였다(5). 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 Decanter (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter, Germany)를이용하였으며, 식물세포 조각의 회수를 위하여 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다. 회수한 식물세포와 세포조각(debris)을 합하여 biomass라 하였다.
- 분리/정제된 taxane derivative는 NMR, MS 등을 사용하여 화학구조를 분석하였다 (7). NMR 실험을 위해서는 Bruker, DRX-300 (Germany)를 사용하였으며, 시료수 mg을 CDCb용매에 녹여 'H, 13C NMR 실험 및 DEPT, COSY, HETCOR 등의 실험을 통하여 각 성분의 분자구조를 분석하였다.
- 메탄올 추출액을 농축하고 (1/5-1/8) 농축액에 CH2CI2를 첨가하여 (MeOH: CH2C12=5:1) 액/액 추출을 실시하였으며 메탄올농축액에 존재하는 극성 불순물 (polar Impurity)을 먼저 제거하였다. 액/액 추출은 회분식으로3회에 걸쳐 실시하였으며 액 /액 추출을 통하여 극성 불순물이 제거된 CH2CI2 용액을 rotary evaporator (450 mmHg, 30℃)에서 농축하고 건조하여 사용하였다 (6).
- 건조 시료 8 mg을 200 (L에 녹인 것을 loading 하여 여러 가지 taxane derivative들을 분리한 후 용매를 제거하여 각각의 성분이 약 10 mg-100 mg이 되도록 위의 과정을 반복하였다. 위의 방법으로 분리된 각 성분은 구조분석에 필요한 정도의 순도(>90%)로 만들기 위해 같은 기기를 사용하여 2차로 정제를 하였는데 이때는 정제하고자 하는 성분에 맞게 HQ/C压CN의 비율이 70/30에서 20/80 사이로 isocratic elution 방법으로 정제하였다. HPLC를 사용하여 분석한 결과 최종적으로 얻어진 taxane derivative-^ 순도는 90% 이상이었다.
- 되었다. 이를 목표물질로 선정하여 P此p-LC를 이용하여 분리/정제하고 NMR, MS 등으로 화학구조 분석을 하여 이들 물질들에 대한동정을 하였다. 또한 Taxus chinensis 식물세포 배양에 의한 paclitaxel 대량생산의 경우 paclitaxel 생산량에 따른 여러 가지 유도체들의 생산경향을 조사하였으며, paclitaxel의 생산량이 증가할수록 유도체들의 생산량은 상대적으로 감소함을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 되었다. Curosil PFP column (21X250 mm, Phenomenex, USA) 이 사용되었으며, peak 확인을 위하여 흡광도 227 nm 에서 UV detector를 사용하였다. H2O/CH3CN 공용매를 65/35에서 35/65로 40분간 2 nUmin 유속으로 gradient elution하였고 35/65에서 70분간 방치하여 컬럼을 세척하였다.
- 0 mL/min, 샘플 주입량은 10 μL 이며, UV (227 nm) detector를 사용하였다. Paclitaxel 표준물질은 Sigma 제품을 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 배양액은 Taxus chinensise} 잎으로부터 얻은 cell line을 이용하여 3000 L 발효조에서 배양한 배양액을 이용하였다(5). 배양액으로부터 식물세포 회수를 위하여 Decanter (Westfalia, CA150 Clarifying Decanter, Germany)를이용하였으며, 식물세포 조각의 회수를 위하여 고속 원심분리기 (a-Laval, BTPX 205GD-35 CDEFP)를 사용하였다.
- 5 mL 메탄올에 녹여 분석하였다. 분석에 사용한 컬럼은 Capcell Pak Ci8 UG 120 (250mm X 4.6mm, Shiseido, Japan), 컬럼 온도는 40℃, 이동상은 CH3CN/Water (20-100% gradient), 유속은 1.0 mL/min, 샘플 주입량은 10 μL 이며, UV (227 nm) detector를 사용하였다. Paclitaxel 표준물질은 Sigma 제품을 사용하였다.
이론/모형
- NMR 실험을 위해서는 Bruker, DRX-300 (Germany)를 사용하였으며, 시료수 mg을 CDCb용매에 녹여 'H, 13C NMR 실험 및 DEPT, COSY, HETCOR 등의 실험을 통하여 각 성분의 분자구조를 분석하였다. 분자구조가 추정된 화합물의 대해서는 FAB mass spectrometry로 분자량을 확인하였는데 AMD Intectra (Harpstedt, Germany)를사용하였다. Source temperature, 69(C; accelerating voltage, 6kV; scan range, m/z 100-1000; scan rate, 35s/cycle; resolution, 1000의 조건 하에서 Cs+ 이온을 분자이온 source 로 사용하였다.
성능/효과
- 위의 방법으로 분리된 각 성분은 구조분석에 필요한 정도의 순도(>90%)로 만들기 위해 같은 기기를 사용하여 2차로 정제를 하였는데 이때는 정제하고자 하는 성분에 맞게 HQ/C压CN의 비율이 70/30에서 20/80 사이로 isocratic elution 방법으로 정제하였다. HPLC를 사용하여 분석한 결과 최종적으로 얻어진 taxane derivative-^ 순도는 90% 이상이었다.
- 이를 목표물질로 선정하여 P此p-LC를 이용하여 분리/정제하고 NMR, MS 등으로 화학구조 분석을 하여 이들 물질들에 대한동정을 하였다. 또한 Taxus chinensis 식물세포 배양에 의한 paclitaxel 대량생산의 경우 paclitaxel 생산량에 따른 여러 가지 유도체들의 생산경향을 조사하였으며, paclitaxel의 생산량이 증가할수록 유도체들의 생산량은 상대적으로 감소함을 알 수 있었다. 이러한 연구는 결국 paclitaxel 이외의 새로운 유용성분 및 전구체 확인, 분리/정제방법의 개발, paclitaxel 생산에서의 품질관리에 유용하게 사용되어 질 수 있다.
- 예를 들면, taxcultine의 경우 배양이 끝난 시점에서의 발효조내 paclitaxel 농도가 10 mg/L 일 때는 paclitaxel의 5배 정도로 많이 생산되는 반면 paclitaxel 농도가 50 mg/L 일 때는 paclitaxel과 거의 같은 생산량을 보였다. 또한 taxayuntin C, baccatin Ⅲ, taxol C의 경우에도 paclitaxel 생산량이 증가할수록 이들 유도체의 생산량은 급격히 감소하였다. 이러한 현상은.
- Figure 2에 나타내었다. 배양이 끝난 후 발효조 내 Paclitaxel의 생산량이 증가할수록 유도체들의 생산량은 상대적으로 감소함을 알 수 있었다. 예를 들면, taxcultine의 경우 배양이 끝난 시점에서의 발효조내 paclitaxel 농도가 10 mg/L 일 때는 paclitaxel의 5배 정도로 많이 생산되는 반면 paclitaxel 농도가 50 mg/L 일 때는 paclitaxel과 거의 같은 생산량을 보였다.
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