Phycocyanin locus내의 DNA Polymorphism에 의한 한국산 Cyanobacteria의 유전적 다양성 Genetic Diversity of Korean Cyanobacteria determined by DNA polymorphisms within the Phycocyanin Locus원문보기
Cyanobacteria의 광합성 보조색소인 phycocyanin의 PC operon(cpc gene)을 PCR로 증폭하고, 제한효소로 처리하여 RFLP pattern을 비교하였다. Intergenic spacer sequence를 포함한 cpc gene은 실험에 사용한 cyanobacteria 균주 모두에게 증폭되었으며, 산물의 size는 약 700 bp였다. PCR산물을 5종의 제한효소로 처리한 결과 AluI, MspI, HaeIII는 같은 속내으ㅐ 균주간에 동일한 pattern을 나타내어 속 구분이 가능하였으며 CfoI은 Anabeana와 Synechocystis속의 균주간에 구별되는 양상을 나타내어 속내 균주 구별에 유용하였다. Restriction enzyme profile에 의한 phenogram에서 Anabeana, Chlorogloea, Synechyhocystis는 각각 하나의 cluster를 형성하여 cyanobacteria의 분류에 PC-IGS의 RFLP pattern이 유용함을 알 수 있었다.
Cyanobacteria의 광합성 보조색소인 phycocyanin의 PC operon(cpc gene)을 PCR로 증폭하고, 제한효소로 처리하여 RFLP pattern을 비교하였다. Intergenic spacer sequence를 포함한 cpc gene은 실험에 사용한 cyanobacteria 균주 모두에게 증폭되었으며, 산물의 size는 약 700 bp였다. PCR산물을 5종의 제한효소로 처리한 결과 AluI, MspI, HaeIII는 같은 속내으ㅐ 균주간에 동일한 pattern을 나타내어 속 구분이 가능하였으며 CfoI은 Anabeana와 Synechocystis속의 균주간에 구별되는 양상을 나타내어 속내 균주 구별에 유용하였다. Restriction enzyme profile에 의한 phenogram에서 Anabeana, Chlorogloea, Synechyhocystis는 각각 하나의 cluster를 형성하여 cyanobacteria의 분류에 PC-IGS의 RFLP pattern이 유용함을 알 수 있었다.
The genetic diversity among Korean cyanobacteria was assessed by restriction fragment length polymorphism(RFLP) analysis of PCR products from the phycocyanin locus. Strains of all the genera tested were successfully amplified, and the size of amplified fragments was approximately 700bp. The restrict...
The genetic diversity among Korean cyanobacteria was assessed by restriction fragment length polymorphism(RFLP) analysis of PCR products from the phycocyanin locus. Strains of all the genera tested were successfully amplified, and the size of amplified fragments was approximately 700bp. The restriction patterns generated by AluI, MspI, and HaeIII were conserved for strains within each of genera studied and were specific to the genus level. Intrageneric delineation of strains was revealed by the enzyme, CfoI for members of genera Anabeana and Synechocystis. Phenogram derived from the different RFLP patterns revealed a coherent cluster among Anabeana, Chlorogloea, and Synechocystis strains. PC-RFLP methods provided useful tools for classification of cyanobacteria.
The genetic diversity among Korean cyanobacteria was assessed by restriction fragment length polymorphism(RFLP) analysis of PCR products from the phycocyanin locus. Strains of all the genera tested were successfully amplified, and the size of amplified fragments was approximately 700bp. The restriction patterns generated by AluI, MspI, and HaeIII were conserved for strains within each of genera studied and were specific to the genus level. Intrageneric delineation of strains was revealed by the enzyme, CfoI for members of genera Anabeana and Synechocystis. Phenogram derived from the different RFLP patterns revealed a coherent cluster among Anabeana, Chlorogloea, and Synechocystis strains. PC-RFLP methods provided useful tools for classification of cyanobacteria.
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제안 방법
PCR 산물의 restriction enzyme digested-pattem을 분석하기 위하여, Alul, Cfol, HaeⅢ, MspI, Rsal 5종의 제한 효소를 이용하여 각 균주에 대해 RFLP pattern을 분석하였다. 제한효소의 처리는 PCR 산물 100 ng, 제한효소 5 unit, 10Xreaction buffer 1 μl를 첨가하여 최종 20 μl로 하여 37℃에서 over night 반응시킨 다음 6×tracking dye와 혼합하여 10 μl를 2.
본 연구에서는 PC-IGS 유전자를 PCR기법으로 증폭하고 그 산물을 4-base 인식 제한효소를 처리하여 생성된 restriction fragment length polymorphism(RFLP) profile을 cyanobcteria의 분류에 적용하였다.
분리 균주들을 5ml의 BG-1I 배지에서 배양하여 세포를 고속원심분리기로 수획하였다. 이 세균 세포 침전물을 0.
각 균주에 대해 RFLP pattern을 분석하였다. 제한효소의 처리는 PCR 산물 100 ng, 제한효소 5 unit, 10Xreaction buffer 1 μl를 첨가하여 최종 20 μl로 하여 37℃에서 over night 반응시킨 다음 6×tracking dye와 혼합하여 10 μl를 2.5% nusieve agarose에 loading 하여 0.5×TBE buffer에서 50 V로 1시간 전기영동한 뒤 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV-transilluminator 상에서 각 균주의 band pattern을 관찰하고, polaroid film으로 촬영하였다. 각 restriction enzyme에 의해 생성된 RFLP data를 통계처리 program인 MVSP(plus Ver 3.
5분간 chain extention을 하였다. 증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액의 1 μl를 취하여 1.2%의 agarose gel을 이용하여 100 V, TBE buffer에서 30분 전기영동 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV하에서 관찰하고 polaroid film으로 촬영하였다. 증폭된 DNA의 크기를 측정하기 위한 marker로는 1 Kb ladder(GibcoBRL, USA)를 사용하였다.
대상 데이터
2%의 agarose gel을 이용하여 100 V, TBE buffer에서 30분 전기영동 후 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV하에서 관찰하고 polaroid film으로 촬영하였다. 증폭된 DNA의 크기를 측정하기 위한 marker로는 1 Kb ladder(GibcoBRL, USA)를 사용하였다.
이 실험에 사용한 균주는 Table 1에 나타내었다. 총 17균주 중 11균주는 대전근교의 하천과 온천에서 분리하였으며 나머지 6균주는 PCC, ATCC, IAM, CCAP 등의 균주 보존기관에서 분양받아 사용하였다. 모든 균주는 BG-11 배지에서 30℃, 3~5일간배양하였다.
데이터처리
5종의 제한효소를 이용하여 얻어진 RFLP data를 통계처리 program인 MVSP(3.0 V)를 이용하여 percent similarity와 simple matching coefficient를 이용하여 UPGMA 군집분석을 실시해 dendrogram을 작성한 결과(Fig. 5), Synechocystis. Chlorogloea, Anabaena가 각각 하나의 cluster를 형성하였다.
5×TBE buffer에서 50 V로 1시간 전기영동한 뒤 ethidium bromide 용액으로 염색하여 UV-transilluminator 상에서 각 균주의 band pattern을 관찰하고, polaroid film으로 촬영하였다. 각 restriction enzyme에 의해 생성된 RFLP data를 통계처리 program인 MVSP(plus Ver 3.0)를 이용하여 UPGMA방법으로 simple matching coefficient와 percent similarity를 이용하여 각 세균들간의 restriction pattern에 의한 phenogram을 작성하였다.
성능/효과
PC-IGS를 증폭하기 위한 primer를 사용하여 PCR을 수행한 결과실험 균주 모두에서 약 700 bp위치에 band를 형성하였다(Fig. 2). 대조 균주로 사용된 E.
Restriction pattern 분석을 위해 4 base를 인식하는 AluI, Cfol, HaeⅢ, Mspt, Rasl등의 5종류의 제한효소를 사용하였으며, 사용한 제한 효소는 5종 모두 polymorphic pattern을 형성하였으며(Table 2.), 제한효소 Rasl은 4 pattem(a-d), Mspl과 HaeⅢ는 5 pattern, Cfol은 7 pattern, AluI은 9 pattern을 나타내어 종 17균주에 대하여 30종의 제한효소 절편 양상을 나타내었다. AluI의 경우 Synechocystis는 a type, Chlorogloea와 Anabaena는 c type을 나타냈으며(Fig.
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