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문제 정의
- 본 연구에서는 미생물 색소 개발의 기초자료를 제공하고자 제주도를 비롯한 섬지역의 해안 해수와 서해안의 평화염전의해수로부터 색소생성능이 우수한 해양세균, Pseudoalteromonas 속 Ju11-1, Ju14, TA20 세 균주를 분리하여 균주들의 분류학적 특성과 최적 색소 생성 조건에 관하여 검토하였다.
제안 방법
- 16S rDNA의 염기서열의 결정은 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 부분 염기서열을 결정하였다. 16S rDNA 염기서열의 상동성 검색은 GenBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast 검색에 의해 실행하였다.
- 16S rDNA의 염기서열의 결정은 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 부분 염기서열을 결정하였다.
- 세균 세포의 염색체 DNA 분리와 G+C 함량(mol%)의 측정은 Jeon과 Park [2]의 방법에 따라 결정하였다. nuclease P1과 Alkaline phosphatase를 처리한 후 HPLC (High-performance Lipiud Chromatograph, Simadzu, Japan)에 의해 측정하였다.
- 균주별 탄소원과 질소원이 색소 생성 조건에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등[6]의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 0.
- 분리된 균주를 MB (marine broth media) 200 ml이 담긴 500 ml 플라스크에 접종하고, 30℃, 200 rpm으로 30 시간 진탕배양하였다. 배양액은 6,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하였고 여기에 물, ethanol, methanol, methanol:acetone (7:2, v/v)을 각각 첨가하여 3회 반복 추출하였다. 추출한 색소는 스펙트로포토미터(Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 350-900 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 온도와 pH에 따른 균주별 색소의 최적 생성 조건을 규명하기 위하여, MB 배지에 배양액을 1% (v/v) 접종하여, 측정하고자 하는 온도, pH 조건에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 4시간 간격으로 스펙트로포토미터를 이용하여 균체량과 색소량을 측정하였다. 온도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 25℃, 30℃와 37℃에서 배양하였고 pH의 영향을 알아보기 위하여 KOH와 HCl를 사용하여 각각 pH 5, pH 6, pH 7, pH 8과 pH 9로 조정된 배지를 이용하였으며, NaCl 농도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 균주의 최적 생장 NaCl 농도를 조사하기 위한 배지와 동일한 배지를 사용하여 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%와 7%까지 NaCl 농도가 조정된 배지에 균을 접종하고 배양하면서 측정하였다. 각 조건별 균체량은 660 nm에서 측정하였으며, 색소량은 각 균주의 최대 흡수 파장인 537 nm, 378 nm, 387 nm에서 각각 측정하였다.
- 온도와 pH에 따른 균주별 색소의 최적 생성 조건을 규명하기 위하여, MB 배지에 배양액을 1% (v/v) 접종하여, 측정하고자 하는 온도, pH 조건에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 4시간 간격으로 스펙트로포토미터를 이용하여 균체량과 색소량을 측정하였다. 온도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 25℃, 30℃와 37℃에서 배양하였고 pH의 영향을 알아보기 위하여 KOH와 HCl를 사용하여 각각 pH 5, pH 6, pH 7, pH 8과 pH 9로 조정된 배지를 이용하였으며, NaCl 농도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 균주의 최적 생장 NaCl 농도를 조사하기 위한 배지와 동일한 배지를 사용하여 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%와 7%까지 NaCl 농도가 조정된 배지에 균을 접종하고 배양하면서 측정하였다.
- 균주별 탄소원과 질소원이 색소 생성 조건에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Kim 등[6]의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 0.75% casamino acid, 1.0% yeast extract, 0.3% sodium citrate, 0.2% potassium chloride, 2.0% magnesium sulphate, 0.0023% ferric sulfate (pH 7.4)에 NaCl 농도를 2%로 한 배지에 최종 농도 1%가 되도록 각각 탄소원과 질소원을 첨가하고 30℃에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 스펙트로포토미터를 사용하여 각 균주의 최대 흡수파장에서 흡광도를 측정하였다. 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, mannitol, sorbitol, glycerol를 첨가하여 확인하였고, 질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone과 peptone의 유기질소원과 potassium nitrate, ammonium nitrate와 sodium nitrate의 무기질소원을 사용하였다.
- 즉, MgSO4·7H2O, 4.8 g; MgCl2·6H2O, 3.5 g; KCl, 1.0g; CaCl2·2H2O, 0.18 g; NaHCO3, 0.03 g; NaBr, 0.013 g을 주요 염성분으로 사용하였고, Bacto-Peptone (Difco, USA), 2.5 g; Yeast extract (Difco, USA), 5.0 g; Glucose (Sigma, USA), 1.0 g; 증류수 1,000 ml, pH 7.2에 NaCl은 각각 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%와 7%가 첨가된 배지를 사용하여 최적 생장 NaCl 농도를 구하였으며, 당으로부터 산 생성능 조사에는 glucose 대신 조사하고자 하는 기질을 1% 첨가하여 사용하였다.
- pH는 KOH와 HCl로 각 각 조정하였다. 최적 NaCl 농도는 Ventosa 등[18]의 기초배지를 변형하여 사용하였다. 즉, MgSO4·7H2O, 4.
- 배양액은 6,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 균체와 상등액을 분리하였고 여기에 물, ethanol, methanol, methanol:acetone (7:2, v/v)을 각각 첨가하여 3회 반복 추출하였다. 추출한 색소는 스펙트로포토미터(Spectronic Genesys 5, Miltonroy, USA)를 이용하여 350-900 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 4)에 NaCl 농도를 2%로 한 배지에 최종 농도 1%가 되도록 각각 탄소원과 질소원을 첨가하고 30℃에서 48 시간 동안 진탕배양하면서 스펙트로포토미터를 사용하여 각 균주의 최대 흡수파장에서 흡광도를 측정하였다. 탄소원은 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, mannitol, sorbitol, glycerol를 첨가하여 확인하였고, 질소원으로는 yeast extract, malt extract, beef extract, tryptone과 peptone의 유기질소원과 potassium nitrate, ammonium nitrate와 sodium nitrate의 무기질소원을 사용하였다.
대상 데이터
- 온도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 25℃, 30℃와 37℃에서 배양하였고 pH의 영향을 알아보기 위하여 KOH와 HCl를 사용하여 각각 pH 5, pH 6, pH 7, pH 8과 pH 9로 조정된 배지를 이용하였으며, NaCl 농도에 따른 색소의 최적 생성 조건을 알아보기 위하여 균주의 최적 생장 NaCl 농도를 조사하기 위한 배지와 동일한 배지를 사용하여 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%와 7%까지 NaCl 농도가 조정된 배지에 균을 접종하고 배양하면서 측정하였다. 각 조건별 균체량은 660 nm에서 측정하였으며, 색소량은 각 균주의 최대 흡수 파장인 537 nm, 378 nm, 387 nm에서 각각 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 2001년 7월부터 2003년 8월까지 제주도, 가거도, 추자도, 귀녀, 구들녀와 태안 염전의 해수로부터 Marine broth 2216 (Difco, USA)에서 30℃, 1～3 일간 배양 후 형태적으로 다르게 구분되는 집락을 분리하였고 이 중 색소를 생성하는 30 균주를 1차적으로 선별하고 최종적으로 색소 생성능이 우수한 Ju11-1, Ju14, TA20 세 균주를 선별하여 실험에 사용하였다. 순수 분리된 균주는 배양액에 20% glycerol을 첨가하여 -80℃에 보관하였다.
이론/모형
- 균체지방산의 분석은 MA 배지에 30℃, 48 시간 배양하여 Lim 등[11]의 방법에 따라 Sherlock Microbial Identification System (MIDI Inc., USA)에 의해 분석하였으며 유사도 0.5 이상을 신뢰성 있는 결과로 판별하였다.
- 분리된 균주들은 MA (Marine agar 2216, Difco, USA) 배지를 기본배지로 하여 배양온도 30℃에서 Yeon 등[19]의 방법에 따라 그람염색, 운동성 및 최적 pH를 조사하였다. pH는 KOH와 HCl로 각 각 조정하였다.
- 세균 세포의 염색체 DNA 분리와 G+C 함량(mol%)의 측정은 Jeon과 Park [2]의 방법에 따라 결정하였다. nuclease P1과 Alkaline phosphatase를 처리한 후 HPLC (High-performance Lipiud Chromatograph, Simadzu, Japan)에 의해 측정하였다.
- 염기서열 결정을 위하여, DNA 증폭 및 염기서열 결정은 Yeon 등[18]의 방법을 이용하였다. 16S rDNA의 염기서열의 결정은 341f (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3') primer와 926r (5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3') primer를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 부분 염기서열을 결정하였다.
성능/효과
- AF227238과 99%, Ju14는 Pseudoalteromonas sp. AY394862와 99%, TA20은 Pseudoalteromonas pscicida AY839777과 99.5%의 상동성을 나타내어 세 균주 모두 서열 유사도 99% 이상에서 Pseudoalteromonas 속에 속하였다.
- 탄소원이 색소 생성에 미치는 영향에 대하여 검토하기 위하여 glucose, lactose, maltose, galactose, arabinose, sucrose, mannitol, sorbitol과 glycerol을 각각 최종 농도 1%(v/v)로 배지에 첨가하여 관찰한 결과 거의 모든 탄소원에서 생육이 저해되었으나 Ju11-1 균주의 경우 lactose에서, Pseudoalteromonas sp. Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20균주의 경우는 maltose를 첨가하였을 때 균체 생장과 색소 생성이 향상되는 것으로 나타났다. Carotenoid를 생산하는 해양세균 Erythrobacter의 경우 mannitol [5]이, Vibrio의 경우 fructose가 최적의 탄소원[4]인 것과는 다른 결과였으며, 이는 세균 종의 차이에 기인하는 대사능의 차이 때문으로 생각된다.
- Ju11-1, Pseudoalteromonas sp. Ju14와 Pseudoalteromonas pscicida TA20에 대한 색소 생성에 대한 배양 온도의 영향을 검토한 결과3 균주 모두 30℃에서 균체량과 색소 생성이 가장 우수하였다. 해양세균인 Erythrobacter [5], Vibrio [4], Bacillus [17] 속의 세균인 경우, 각각 색소 생성능이, 25℃, 21℃, 25℃인 것과는 대조적인 결과를 나타내었다.
- Carotenoid를 생산하는 해양세균 Erythrobacter의 경우 mannitol [5]이, Vibrio의 경우 fructose가 최적의 탄소원[4]인 것과는 다른 결과였으며, 이는 세균 종의 차이에 기인하는 대사능의 차이 때문으로 생각된다. 또한 색소의 생산은 균체 생장 곡선과 거의 비례하는 것으로 나타났다(Table 2).
- 색소 생성에 NaCl 농도가 미치는 영향에 대하여 배지의 NaCl의 농도를 0%에서 7% 까지 변화를 주어 검토한 결과, 세 균주 모두에서 2%의 NaCl 농도에서 최적의 균체 생장과 색소 생성이 관찰되었으며 3% 이상의 NaCl 농도에서는 점진적으로 균체량과 색소량이 감소되었다(Fig. 3). 해양성 Vibrio sp.
- 세 균주 모두 카탈라제 양성을 나타내었으며 Ju14를 제외한 두 균주는 glucose와 lactose로부터 산을 생성하지 않았으며 지방산 조성은 Pseudoalteromonas 속 세균의 주요 지방산으로 알려진 16:1ω7c [1]가 24.5-28.9%로 가장 높은 비율을 나타내어 이들 균주의 주요 지방산이 Pseudoalteromonas 속과 일치함을 확인하였다.
- Ju14의 경우 24 시간에서, Pseudoalteromonas pscicida TA20의 경우 28시간에 관찰되었다. 세 균주 중 색소 생성능은 Pseudoalteromonas pscicida TA20 균주가 가장 우수하였다(Fig. 4). 해양성 균주들이 배양 48 시간[5,17] 혹은 24 시간에 최대 색소 생성을 나타내는 것과 유사한 결과였다.
- 9%로 가장 높은 비율을 나타내어 이들 균주의 주요 지방산이 Pseudoalteromonas 속과 일치함을 확인하였다. 염색체 DNA의 G+C 함량(mol%)은 Ju11-1은 44.3%, TA20은 44.9% 나타내어 Pseudoalteromonas 속 세균의 38-48% 범위[1]에 들어있으나 Ju11-1은 52.3%를 나타내어 전형적인 Pseudoalteromonas 속 세균의 G+C 함량 범위에는 들지 않았다(Table 1). 16S rRNA 염기서열 분석 결과, Ju11-1은 Pseudoalteromonas sp.
- 질소원의 영향을 조사하기위하여 탄소원으로 1%의 maltose가 포함된 배지에 각각 3종의 무기질소원과 5종의 유기질소원에 대하여 조사한 결과, 유기 질소원을 첨가하였을 경우가 무기질소원을 첨가한 경우에 비하여 색소 생성능이 우수하였다. 색소 생성능에 미치는 질소원의 영향에 관한 많은 실험에서 무기질소원보다 유기질소원에서 색소의 생성이 좋은 것으로 나타난 결과와 일치하는 것이다[3,4,17].
- 균주는 Marine broth 2216에서 잘 자랐으며, 30℃, 2% NaCl, pH 6-7 의 조건에서 Ju11-1과 Ju14는 배양 24 시간에, TA20은 배양 28 시간에 최대 색소 생성을 나타냈다. 탄소원으로 maltose를 1% 첨가하였을 경우 색소 생성이 우수하였으며, 질소원으로는 beef extract를 1% 첨가하였을 경우 최적의 색소 생성을 나타냈다.
- 한국의 제주도와 서해안 염전의 해수로 부터 각각 빨강(JU11-1), 노랑(JU14), 주황(TA20)의 색소를 생성하는 3 균주를 분리하였으며, 이들의 분류학적 특성 및 16S rRNA 서열 분석 결과 3 균주 모두 Pseudoalteromonas 속 세균으로 밝혀졌다. 이들 각각의 색소 최대 흡수파장은 각각 537, 378, 387 nm로 나타났다.
- 가 생산하는 적색 색소의 경우, 균체의 생산은 0% NaCl에서, 색소 생성은 1-2% NaCl 농도가 최적인 것으로 나타나 균체의 생산과 색소생성의 최적 조건이 서로 다른 것으로 보고되었으나[4] 본 실험에서 사용한 분리 균주들은 균체의 생육과 색소의 생산이 모두 2% NaCl에서 최적을 나타내었다. 해양 미생물은 육상 미생물에 비하여 높은 염 농도에서 자라는 특성이 있는데, 본 연구에서 사용한 균주는 2%의 NaCl이 첨가된 조건에서 최적 생장이 관찰되어 비교적 다른 세균에 의한 오염이 적어 색소의 생산 시 유리한 조건으로 작용할 것으로 사료된다.
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