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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 미나리과에 속하는 당귀를 약침액으로 제조하여 약침액이 생체장기에 미치는 영향과 약침액의 암 예방 효과를 살펴보았다. 즉, 당귀가 생체 장기에 미치는 영향을 생쥐 혈청 중의 GOT GPT LDH 및 ALP-s의 활성을 측정하여 살펴보았고, 생쥐의 복수암에 대한 암예방 효과를 in vivo 실험으로 관찰하였다.
- 혈청 중 GOX GPT 활성의 측 점 -생약 추출물에서는 생약 특유의 여러 배당체가 용출되어 나오고 이 배당 체는 인체의 간에 손상을 가져올 가능성이 있으므로, 본 실험에서 사용한 당귀약침액을 mouse에 7일간 임의혈, 중완혈, 간수혈에 주사한 실험군과 약침액을 주사하지 않은 대조군의 혈청으로 간세포 이상의 지표로 사용하고 있는 GOT GPT를 측정하여 당귀약침액이 간세포에 미치는 영향을 알아보았다. Table I의 결과에서와 같이 당귀약침액을 주사한 실험군에서는 약침액을 투여하지 않은 대조군(132.
제안 방법
- 세포내 GSH 생성량 측정 - 세포 내 총 GSH 함량은 Griffith")의 방법을 96-well microtiter plate에서 사용할 수 있게 변형하여 측정하였다. Hepalclc7를 배양하여 당귀약침액 및 열수 추출액에 의한 세포내 GSH의 양을 측정하였다.
- Hepalclc7를 배양하여 당귀약침액 및 열수 추출액에 의한 세포내 GSH의 양을 측정하였다. 1X104의 세포를 200 B MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종시키고 CO2 incubator에서 24시간 배양 후 10 p/ 당귀 약침액(O.ix, 0.5X, lx, 3x, 5X) 또는 열晋출액(0.1 X, 0.5X, lx, 3x, 5X)o] 포함된 배지를 각 所11에 가하였다. 시료 처리 후 48시간 뒤 배지를 버리고 PBS로 세 번 씻고 세포를 용해시킨 후 40 p/ stock buffer {125 mM sodium phosphate, 6.
- 3 ml OGM {3 N KOH, 30% glucose. 2, 000 x vitamins(0.2 g thiamine HC1, 40 mg biotin, 200 jig vitamin B12/100 m/ 95% ethanol), 100 x salt I (0.4 g ferric citrate, 0.1g CaCl2 - H2O, 3.1g MgSO4 - 7H2O in 250 ml dH2O), 100 x KH2PO4(13.6 압I, pH 7.0), yeast extract-proteose peptone(7.5 g//)}에부유시켜 T-25 tissue culture flask에서 당귀 약침액 (lx, 5X) 또는 열수 추출액(lx, 5X) 150 世와 배양하였다. 그리고 24, 48, 96, 120, 144, 16时]간 후의 세포수를 hemocytometei# 이용하여 계수하였다.
- EATC 복수암에 대한 당귀약침액의 전투여에 의한 항암 효과 측정을 위하여 수컷 ICR 마우스를 각 군당 10마리로 하여 비처리한 정상군, 약침을 맞지 않고 EATC만을 이식한 대조군, 당귀약침액을 비경혈인 임의 혈(AGARS-BL)에 취혈한 실험군 및 약침액을 중완혈(AGARS-CVS과 간수혈(AGARS-BL])에 놓은 실험군으로 나누어 복강 내 암세포 이식 및 당귀 약침액의 처리를 하였다. 당귀약침액 IX, 砂를 10회 투여한 후, lx 106 EATC를 실험동물의 복강 내에 이식하고 6일 후각각의 실험군의 마우스 spleen 무게를 측정하고, 각 실험군 마우스의 복강 내 암세포의 수를 측정하여 당귀 약침액의 전투여에 의한 암 예방 효과를 살펴보았다.
- EATC를 사용하여 생쥐를 대상으로 복수암을 유발시킨 후 생체(汤。物°)에서의 당귀약침액의 전처리에의한 암억제 효과를 측정하였다. 생체 내에서 당귀 약침액이 EATC에 미치는 효과를 살펴본 결과, 종양세포만을 이식한 생쥐에 비해 임의혈, 중완혈과 간수혈에 취혈한 쥐들에게서 spleen의 중량 증가를 보였고, 높은 암세포 성장 억제율을 보였다.
- lx—5x for 48 hrs. Glutathione S-transferase level of sample-treated cells was analyzed and compared with the level of solvent-treated cells to calculate the ratio of GST induction. Each point represents the mean 士 SD (standard deviation) of three separate experiments.
- lx—5x for 48 hrs. Glutathione level of sample-treated cells was analyzed and compared with the level of solvent-treated cells to calculate the ratio of GSH induction. Each point represents the mean 土 SD (standard deviation) of three separate experiments.
- 하였다. Hepalclc7 cell을 96-well microtiter plate의 각 well에 1乂10가 ceils을 접종시키고 37°C, CO2 incubator에서 24시간 배양 후 새 배양액 190와 당 귀 약침액(O.ix, 0.5X, IX, 3X, 5X) 또는 열수 추출액(0.1X, 0.5X, lx, 3X, 5X)을 10 씩각 well에 처리하였다.세포를 약침액 또는 열수 추출액이 처리된 배양액에서 48시간 배양 후 PBS로 3회 씻고, 3회의 freeze-thaw cycles에 의해 세포를 용해시켰다.
- 수 있게 변형하여 측정하였다. Hepalclc7를 배양하여 당귀약침액 및 열수 추출액에 의한 세포내 GSH의 양을 측정하였다. 1X104의 세포를 200 B MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종시키고 CO2 incubator에서 24시간 배양 후 10 p/ 당귀 약침액(O.
- LDH 활성도의 측정-LDH는 동물에 서 5종의 isozyme이 있으며 그 종류에 따라 장기특이성이 있으나 본 실험에서는 혈청중의 total enzyme을 측정하여 심폐기관, 혈액, 간세포에 대한 영향을 알아내는 지표로 사용하였다. Table I에 그 결과를 나타낸 바와 같이 약침액을 투여하지 않은 대조군(485.
- Polyamine metabolism에 미치는 영향 -polyamine은 아메바증식에 필수적이므로 당귀 약总액이 아메바의 polyamine 대사에 미치는 영향을 알아 보기위해 아메바의 증식을 측정하였다(Fig. 5), 2X105 cells의 Acanthamoeba azs碱z湖에 150 \d 3차 증??수만을 처리한 후 24시간, 48시간, 96시간, 120시간, 144 시간, 16S 시간을 관찰했을 때, Fig. 6에서와 같이 아메바의 세포 수는 1.
- Polyam血e metabolism 측정&)一Accmt物mo血i cast血inii의 증식을 즉정하여 polyamine metabolism 을 측정하였다, 2 X IO’ cells의 Acanthamoeba castel- lan五을 3 ml OGM {3 N KOH, 30% glucose. 2, 000 x vitamins(0.
- QR 생성에 미치는 영향- 당귀의 암 예방 효과를 살펴보기 위하여 발암물질을 무독성화시키는 Phase II enzyme, QR 생성의 유도 효과를 측정하였다. Hepalclc7세포에 대한실험에서 5X 농도에서 가장 높은 수치인 2.
- spleen 중량에 대한 효과- 생체 내에서 당귀 약침액의 전투여에 의한 spleen의 중량 변화를 살펴보기 위하여 당귀약침액을 10회 투여한 뒤 EATC lx 106 cells을 복강에 이식하여 암을 유발시킨 쥐에게서 spleen을 취하여 무게를 측정하였다(Eble II). 시료를 처리하지 않은 대조군이 125.
- 5 g//)}에부유시켜 T-25 tissue culture flask에서 당귀 약침액 (lx, 5X) 또는 열수 추출액(lx, 5X) 150 世와 배양하였다. 그리고 24, 48, 96, 120, 144, 16时]간 후의 세포수를 hemocytometei# 이용하여 계수하였다.
- 22 皿, Whatman, Germany) 로 여과한다. 그리고 3차 증류수를 가하여 200 nW] 되게 하여 IX의 약침액으로 사용하였으며 10X, 5X, 3X약침액은 IX의 약침액을 감압 농축하여 사용하였고, 증류수나 phosphate buffered saline(PBS)를 첨가하여 0.1 X, 0.5X 농도를 조제하였다.
- 즉, 당귀가 생체 장기에 미치는 영향을 생쥐 혈청 중의 GOT GPT LDH 및 ALP-s의 활성을 측정하여 살펴보았고, 생쥐의 복수암에 대한 암예방 효과를 in vivo 실험으로 관찰하였다. 그리고 당귀 약침액의 암예방효과의 기전을 살펴보기 위하여 QR 생성 유도, GSH, GST의 활성, polyamine metabolism 저해를 측정하였다.
- 즉, 당귀 60 g에 증류수 400 mZ을 가한 뒤 rotary evaporator(BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전 탕하여 추출하고 여과한 후 4°C, 2, 500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상층액 200 mE을 감압 농축하였다. 농축된 용액에 99.9% ethanol을 가하여 75%, 85%, 95%의 ethanol 용액이 되게 하여 침전물을 여별하고, pH 7.4로 적정한 후 저온에서 24시간 방치하여 membrane filter(0.22 皿, Whatman, Germany) 로 여과한다. 그리고 3차 증류수를 가하여 200 nW] 되게 하여 IX의 약침액으로 사용하였으며 10X, 5X, 3X약침액은 IX의 약침액을 감압 농축하여 사용하였고, 증류수나 phosphate buffered saline(PBS)를 첨가하여 0.
- 상온에서 5 분간 shaking 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단백질 함량은 GSH 활성 측정을 한plate와 같이 처리한 plate 에서 binchinchoninic acid solution protein kit를 사용하여 측정하였다.
- 5)을 첨가하고 1 분간 plate 아laker에서 shaking한 후 405 nm에서 3 분간 흡광도의 증가를 microplate reader에서 측정하였다. 단백질 함량은 GST 활성 측정을 한plate와 같이 처리한 plate에서 binchinchoninic acid solution protein kit를 사용하여 측정하였다.
- 당귀 약침액을 사용한 본 실험에서는 GOT GPI; LDH와 ALP-s의 활성도 측정으로 장기독성유무를 알아보았다. 그 결과, 당귀약침액을 임의혈, 중완혈, 간 수혈에 주사했을 때 GOT GPT 활성도 측정에 의하면 당귀 약침액은 간세포에 나쁜 영향이 없으며 오히려 간세포 기능을 증가시키는 효과가 있었다.
- 당귀 열수 추출액의 제조- 당귀 60 g어】 증류수 400 m/을 가 한 뒤 rotary evaporator(BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전탕하여 추출하고 여과한 후 4°C, 2, 500 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액 200 m2을 감압농축하여 pH 7.4로 적정한 후 저온에서 24시간 방치하여 membrane filter(0.22 pm, Whatman. Germany)로 여과하고 PBS를 가하여 200 mZ이 되게 하여 IX의 열수 추출액으로 사용하였으며 10X, 5X, 3X 열수 추출액은 IX의 열수 추출액을 감압 농축하여 사용하였고, 증류수나 PBS를 첨가하여 O.ix, 0.5X 농도를 조제하였다.
- 처리를 하였다. 당귀약침액 IX, 砂를 10회 투여한 후, lx 106 EATC를 실험동물의 복강 내에 이식하고 6일 후각각의 실험군의 마우스 spleen 무게를 측정하고, 각 실험군 마우스의 복강 내 암세포의 수를 측정하여 당귀 약침액의 전투여에 의한 암 예방 효과를 살펴보았다.
- 세포 내 GSH 생성에 미치는 영향- 약침액에 의한 GSH 생성을 Hepalclc7 세포에서 살펴보았다. 0.
- 세포 내 GST 생성량 측정i-、GST % GST 卩를발현하는 Hepalclc7 cell을 사용하여 GST 활성 측정을 하였다. Hepalclc7 cell을 96-well microtiter plate의 각 well에 1乂10가 ceils을 접종시키고 37°C, CO2 incubator에서 24시간 배양 후 새 배양액 190와 당 귀 약침액(O.
- 수컷 ICR 마우스를 각 군당 6마리로 하여 당귀 약침액을 맞지 않은 대조군, 당귀약침액을 7일간 비경혈인 임의혈에 놓은 실험군(AGARS-BL) 및 중완혈 (CV]2)과 간수혈(BL®)에 놓은 실험군(AGARS-CVu, AGARS-BL^)들에서 혈액을 안와정맥 총 부위로 채혈하여 혈청을 분리한 후 장기에 미치는 영향을 측정하였다.
- 암세포의 성장 저해 효과-생체내에서 당귀 약침액의 전투여에 의한 Ehrlich ascites tumor cell (EATC)에 대한암억제 효과를 알아보기 위해 당귀 약침액을 10회 투여한 뒤 EATC lx io*5을 복강에 이식하여 암을 유발시킨 생쥐에게서 암세포 성장 저해 효과를 살펴보았다Q3ble II). 약침을 투여하지 않은 대조군에 비해 임의혈, 중완혈, 간수혈에 약침을 투여한 경우 높은 암세포 성장 억제율을 보였다.
- 열수 추출액에 의한 아메바증식 억제능을 살펴보기 위해 약침액 실험과 같이 2X105 cells의 Acanthamoeba castellanii^ 150 昭 증류수 및 당귀열수추출액 1 X, 5X를 처리하였다. 168시간 후에 대조군, lx, 5X 에 대해세포수를 측정해보았을 때 15X106, 12.
- 방법에 따라 측정하였다. 즉, I X JO*개의 Hepalclc7 세포와 Ac2F 세포를 200 祕의 MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종시키고 CO2 incubator에서 24시간 배양 후, 새 배양액 190 B와당귀 약 침액(O.ix, 0.5X, lx, 3x, 5X) 또는 열수추출액(0.1X, 0.5X, IX, 3><, 5X)을 10 也씩 각 well 에 가하였다.세포를 약침액 또는 열수 추출액이 첨가된 배양액에서 48시간 배양 후 배양액을 버리고 세포를 용해시켰다.
- 따라서 본 연구에서는 미나리과에 속하는 당귀를 약침액으로 제조하여 약침액이 생체장기에 미치는 영향과 약침액의 암 예방 효과를 살펴보았다. 즉, 당귀가 생체 장기에 미치는 영향을 생쥐 혈청 중의 GOT GPT LDH 및 ALP-s의 활성을 측정하여 살펴보았고, 생쥐의 복수암에 대한 암예방 효과를 in vivo 실험으로 관찰하였다. 그리고 당귀 약침액의 암예방효과의 기전을 살펴보기 위하여 QR 생성 유도, GSH, GST의 활성, polyamine metabolism 저해를 측정하였다.
대상 데이터
- kit는 Sigma chemical Co.(USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS)은 Gibco(U.S.A)에서, GOT GPT LDH, ALP-s kits는 아산제약 주식회사에서 구입하였다. 기타 시약은 세포배양용 및 1 급 시약을 사용하였다.
- 당귀약침액의 제조- 본 실험에서 당귀0潘ftcae gigantis Radix) 약침액을 제조하기 위하여 동국대학교 부속 한방병원에서 구입한 당귀를 정선하여 사용하였고, 추출용매인 물은 이온교환수지를 통과시킨 증류수를 사용하였다. 嘔액은 앞서 보고된 문 등1아과 김 등M)의 방법에 의하여 수제알콜침법으로 조제하였다.
- 대한실험동물센터에서 구입한 6주령 수컷 ICR 마우스를 사용하였다. 7~10일간 안정화시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 중 사료와 물은 자유로 먹게하였다.
데이터처리
- SD)로 표현하였다. Student's t-test를 시행하여, 결과치는 P 값이 0.05또는 0.()1미만을 통계학적으로 의미 있는 것으로 간주하였다.
- 통계처리 -실험 결과는 평균土표준편차(Standard deviation, SD)로 표현하였다. Student's t-test를 시행하여, 결과치는 P 값이 0.
이론/모형
- ALRs 활성도의 측정- 혈청 중 ALRs의 활성도는 ALP-s 측정용kit(아산제약주식회사, 한국)를 사용하여 Knd-king법에 의하여 측정하였다. 그리고 ALP-s 활성도는 표준혈청으로 작성한 표준검량 곡선에 의해 계산하여 K-A unit로 표기하였다.
- GOT GPT 활성도 측정- GOT 및 GPT의 활성도는 혈청 중 transaminase 측정용 kit(。산제약斥식회사, 한국)를 사용하여 Reitman-Frankel법에 의하여 측정하였다. 그리고 GOT GPT의 활성도는 표준곡선에의해 활성치를 계산하여, 혈청 1 m/당 Karman unit로 표기하였다.
- LDH 활성도의 측정-혈청 중 LDH의 활성도는 LDH 측정용kit(아산제약주식회사, 한국)를 사용하여 효소법(젖산기질법)에 의하여 측정하였다. 그리고 LDH 활성도는 표준혈청으로 작성한 표준검량 곡선에 의해 계산하여 Wroblewski unit로 표기하였다.
- QR 생성 측정 -QR 생성 유도효과는 Prochaska17) 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉, I X JO*개의 Hepalclc7 세포와 Ac2F 세포를 200 祕의 MEM 배지에 부유시켜 96-well plate에 접종시키고 CO2 incubator에서 24시간 배양 후, 새 배양액 190 B와당귀 약 침액(O.
- 嘔액은 앞서 보고된 문 등1아과 김 등M)의 방법에 의하여 수제알콜침법으로 조제하였다. 즉, 당귀 60 g에 증류수 400 mZ을 가한 뒤 rotary evaporator(BUCHI RE121, Switzerland)에서 3시간 전 탕하여 추출하고 여과한 후 4°C, 2, 500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상층액 200 mE을 감압 농축하였다.
성능/효과
- 0.1X 농도의 약침액을 처리한 세포에서 대조군보다 GSH level이 1.1배의 증가를 보이다가 3X에서 1.3배를 보였다. 열수 추출액에서는 각각의 시료 농도에서 1.
- 1.당 귀 약침액이 장기에 미치는 영향을 조사하기 위하여 약침액을 7일간 투여한 mouse 혈청중의 효소 GOT, GPT, LDH 및 ALP-s의 활성변화를 측정한 결과, GPT는 변화가 없었고 GOT LDH와 ALP・s의 활성은 감소하였으므로 약침액이 간세포, 골세포, 심폐기관에 유해작용이 없으며 오히려 각 기능을 증가시키는 효과가 있었다.
- 5X를 처리하였다. 168시간 후에 대조군, lx, 5X 에 대해세포수를 측정해보았을 때 15X106, 12.2X 106, 8.6X106의 세포수를 보여 대조군에 비해서 열수 추출액 lx, 5X에서 20%, 43%의 아메바증식 억제 효과가 나타났다.
- 2.당 귀 약침을 10일간 전투여한 후 Ehrlich ascites tumor cell을 이식하여 복수암이 유발된 생쥐의 비장무게 증가률을 살펴본 결과 약침액을 주사한 생쥐의 비장 무게 증가율이 대조군에 비해서 높았다.
- 발암을 저해한다고 보고되었다.23)이에 당귀 약침액에 의 해 증가한 GSH는 산화적인 유리기의 공격 (oxidative free radical attack)으로부터 세포를 보호하고 DNA에 결합하는 것을 막아주어 mutagenesis 또는 carcinogenesis를 저해할 것으로 여겨지며 세포내 GSH 생성을 촉진하여 세포 내 발생한 산화물질과 기타의 독성물질을 무독하게 할 것으로 추측된다.
- 그러므로 원생동물의 polyamine 생합성 억제제는 암세포의 성장을 저해할 수 있다.26)당 귀 약침액과 열수 추출액은 농도 의존적으로 아메바의 성장을 억제하였다. 당귀약침액과 열수 추출액에 의해 아메바의 수가 감소하는 것이 아니라 증식속도가 지연되었으므로 독성에 의한 수의 감소가 아니라 아메바 성장에 필요한 polyamine의 고갈에 따른 증식 속도의 지연으로 보인다.
- 3.당 귀 약침을 10일간 투여한 후 Ehrlich ascites tumor cell을 이식하여 복수암이 유발된 생쥐의 EATC 성장을 살펴본 결과 약침액을 주사한 쥐의 EATC의 성장이 크게 억제되었다.
- 4.당 귀 약침액의 암억제 효과를 살펴보기 위하여 quinone reductase(QR)생성 유도를 측정한 결과 당귀약침액, 열수 추출액을 처리한 간암세포인 Hepalclc7 과 血의 Ac2F에서 QR생성이 유도되었으며 약침액에의한 유도율이 더 높았다.
- 5 uniS. 42%, 15%, 53%씩각각 감소하였으며, 임의혈과 간수혈사에는 GOT 활성에 큰 차이가 없었다. GPT 활성은 임의혈, 중완혈, 간수혈 실험군이 대조군(23.
- 제거해준다.5) 대부분의 외부의 화학물질은 cytochrome p-450-depen- dent monooxygenase system에서 대사되어져 전자친화적 물질 (electrophilic product), epoxides 또는 매우 독성이 강한 물질이 된다.2D 이물질들은 GSH와 직접적으로 결합하거나 GST에 의해 촉매되는 과정을 거쳐 결합하기도 한다.
- 5. Hepalclc7에서 glutathione(GSH) 생성을 살펴본 결과 당 귀 약침액과 열수 추출액에 의한 GSH 생성이 증가하였다.
- 6. Hepalclc7에서 glutathione S-transferase(GST)활성은 당귀약침액에 의해 활성이 증가되었다.
- 7. 농도별 당귀약침액과 열수 추출액에 의한 Acanthamoeba castellanii 증식을 살펴본 결과, 약침액과 열수주 출액이 Acanthamoeba cast成cmii의 polya mine metabolism을 억제하여 농도 의존적으로 Acanthamoeba azstdMn初의 증식을 저해하는 효과가 있었다.
- Ac2F 세포에 대한 당귀의 QR 유도율을 측정해 본 결과, 약침액의 경우 농도 0.1 X에서 1.0인수치를 보이다가 농도 5X 에서는 유도율 2.1로 현저히 많은 QR 생성이 유도되었다. 열수 추출액을 Ac2F에 처리했을 때에는 농도 0.
- 42%, 15%, 53%씩각각 감소하였으며, 임의혈과 간수혈사에는 GOT 활성에 큰 차이가 없었다. GPT 활성은 임의혈, 중완혈, 간수혈 실험군이 대조군(23.7 unit)에 비해 각각 22.5 unit, 15.0 unit, 10.0 unit로 감소하였으며, 비경 혈인 임의 혈에 비해 경혈이 높은 감소율을 보였다.
- 측정하였다. Hepalclc7세포에 대한실험에서 5X 농도에서 가장 높은 수치인 2.6배의 높은 생성 유도율을 보였다. 열수추출액에서는 농도 차이에 따른 QR 생성 유도율의변화가 없으며 대조군과 같은 1.
- 당귀약침액 및 열수 추출액이 polyamine 생성을 저해시키고 이에 당귀 약침액 및 열수 추출액에서 배양한 아메바의 세포 성장이 저해된 것으로 보인다. Polyamine 대사 저해제의 대표적인 예인 碰uoromethylornit仕ine(DFMO)는 polyamine 대사 경로에서 중요한 효소인 ornithine decarboxylase의 활성을 저해함이 증명되었으며 DFMO는 많은 종류의 발암물질에 의해 유도된 tumorgenesis를 저해하는 효과가 있었다.2728)본 실험에서의 아메바 성장억제는 polyamine 대사의 저해로 인한 것으로 여겨지며 이로 인해 종양 발생을 억제할 것으로 예측되므로 앞으로 radioactivity를 이용하여 ODC활성을 직접 측정하는 것은 매우 의미 있는 실험이라 하겠다.
- 0X106까지 증가하였다. 각 처리 시간에서 당귀약침액 lx, 5X 농도를 처리했을 때 농도 5X당귀 약침액에서는 168시간이 지난 후, 9.4X106로 대조군에 비해서 37% 정도의 억제 효과가 나타났다. 또한, IX의 약침액 농도에서도 대조군에 비해 20%의 아메바의 증식 억제 효과를 보였다.
- 당귀 약침액을 사용한 본 실험에서는 GOT GPI; LDH와 ALP-s의 활성도 측정으로 장기독성유무를 알아보았다. 그 결과, 당귀약침액을 임의혈, 중완혈, 간 수혈에 주사했을 때 GOT GPT 활성도 측정에 의하면 당귀 약침액은 간세포에 나쁜 영향이 없으며 오히려 간세포 기능을 증가시키는 효과가 있었다. 또한 LDH 활성도 측정에 의하면 심폐기능, 간세포 기능을 증가시키는 효과가 있었다.
- 이 반응들은 무독성과정 (detoxification pathway)으로 세포 내 GSH가 고갈되면 독성이 강한 대사물질들이 만들어져 세포내 손상을 유발시켜mutagenesis, carcinogenesis# 일으킨다. 끄) Hepalclc7에서 GSH, GST는 당귀 약침액의 농도에 의존적으로 생성율이 증가하였다. 위의 결과로 당귀약침액은 세포 내 glutathione 생성을 촉진하여 세포내 발생한 산화물질과 기타의 독성물질을 무독하게 할 것으로 추측된다.
- 당귀약침액을 생쥐의 간암 세포 Hepalclc7에 처리하였을 때 5X 농도에서 2.6배의 QR 생성 유도률을 보였고 당귀 약침액의 농도가 높아짐에 따라 QR 유도률도 증가되었다. Rat의 Ac2F 세포에서의 당귀 약침액의 QR 생성유도는 생쥐의 간암 세포에서와 마찬가지로 높은 QR생성율을 나타낸 바 당귀약침액은 Phase II enzyme인 QR의 생성을 유도하였다.
- ALP-s 활성도 측정에서도 당귀약 料 액은 생체의 간세포나 골세포의 기능에 영향을 미치지 않았다. 따라서 반복된 당귀약침액의 투여가 간세포, 골세포, 심폐기관 등에 유해작용⑴ 없었으며 오히려 각 기능을 증가시키는 효과가 있었다.
- 0배의 생성 유도율을보였다. 따라서 생쥐의 간암 세포인 Hepalclc7에서 약침액이 QR 생성을 유도하였으며 최고 2.6배의 유도율을 보였으나 열수 추출액은 1.0의 유도율로 대조군과 같은 효과를 보였다 (Fig. 1).
- 그 결과, 당귀약침액을 임의혈, 중완혈, 간 수혈에 주사했을 때 GOT GPT 활성도 측정에 의하면 당귀 약침액은 간세포에 나쁜 영향이 없으며 오히려 간세포 기능을 증가시키는 효과가 있었다. 또한 LDH 활성도 측정에 의하면 심폐기능, 간세포 기능을 증가시키는 효과가 있었다. ALP-s 활성도 측정에서도 당귀약 料 액은 생체의 간세포나 골세포의 기능에 영향을 미치지 않았다.
- 7 mga로 대조군에 비해서 높게 증가되었다. 또한 약침액의 농도가 높아질수록 spleen의 중량 증가는 뚜렷하게 나타났다.
- 4X106로 대조군에 비해서 37% 정도의 억제 효과가 나타났다. 또한, IX의 약침액 농도에서도 대조군에 비해 20%의 아메바의 증식 억제 효과를 보였다.
- 암억제 효과를 측정하였다. 생체 내에서 당귀 약침액이 EATC에 미치는 효과를 살펴본 결과, 종양세포만을 이식한 생쥐에 비해 임의혈, 중완혈과 간수혈에 취혈한 쥐들에게서 spleen의 중량 증가를 보였고, 높은 암세포 성장 억제율을 보였다.
- 증??수만을 처리한 후 24시간, 48시간, 96시간, 120시간, 144 시간, 16S 시간을 관찰했을 때, Fig. 6에서와 같이 아메바의 세포 수는 1.8X105, 9.0Xl()5, 440X1()5으로 9&시간까지 서서히 증가하다가 120시간 이후 급격히 세포수의 증가를 보여 168시간에는 15.0X106까지 증가하였다. 각 처리 시간에서 당귀약침액 lx, 5X 농도를 처리했을 때 농도 5X당귀 약침액에서는 168시간이 지난 후, 9.
- 시료를 처리하지 않은 대조군이 125.7 mg인데 비해 임의혈, 중완혈, 간수혈의 실험군에서 spleen의 중량 증가를 보였고, 특히, 간수혈 5X에서는 197.7 mga로 대조군에 비해서 높게 증가되었다. 또한 약침액의 농도가 높아질수록 spleen의 중량 증가는 뚜렷하게 나타났다.
- 유발시킨 생쥐에게서 암세포 성장 저해 효과를 살펴보았다Q3ble II). 약침을 투여하지 않은 대조군에 비해 임의혈, 중완혈, 간수혈에 약침을 투여한 경우 높은 암세포 성장 억제율을 보였다. 특히 간수혈의 경우 lx, 5X에서 각각 53.
- 끄) Hepalclc7에서 GSH, GST는 당귀 약침액의 농도에 의존적으로 생성율이 증가하였다. 위의 결과로 당귀약침액은 세포 내 glutathione 생성을 촉진하여 세포내 발생한 산화물질과 기타의 독성물질을 무독하게 할 것으로 추측된다.
- 이상의 결과를 종합해 볼 때 당귀약침액은 효과적으로 세포 내 QR의 농도를 높혀주고 polyamine metabolism# 저해할 뿐 아니라 GSH와 GST의 양을 증가시켜 외부물질 또는 대사물에 의해 일어날 수 있는 돌연변이와 암 발생을 억제할 것으로 사료된다.
- 이와 같이 당귀약침액과 열수 추출액은 농도 의존적으로 아메바증식을 억제하였고 약침액과 열수추출액은 비슷하게 아메바증식을 억제하였다.
- 6 units. 증가하였고, 중완혈, 간수혈은 19.9 unit, 20.0 unit로 각각 10% 감소하여 비경혈인 임의혈에 비해 경혈인 실험군에서 ALP-s 활성도가 현저히 감소하였다.
후속연구
- Polyamine 대사 저해제의 대표적인 예인 碰uoromethylornit仕ine(DFMO)는 polyamine 대사 경로에서 중요한 효소인 ornithine decarboxylase의 활성을 저해함이 증명되었으며 DFMO는 많은 종류의 발암물질에 의해 유도된 tumorgenesis를 저해하는 효과가 있었다.2728)본 실험에서의 아메바 성장억제는 polyamine 대사의 저해로 인한 것으로 여겨지며 이로 인해 종양 발생을 억제할 것으로 예측되므로 앞으로 radioactivity를 이용하여 ODC활성을 직접 측정하는 것은 매우 의미 있는 실험이라 하겠다.
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