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문제 정의
- 이상의 많은 종류의 보고에도 불구하고, Oh등이 이oning한 toluene, phenyl 등을 이용하는 Burkholderia cepacia G4균주의 catechol 2, 3-dioxygenase의 특성에 대해서는 자세히 보고된 바가 없다. 따라서 본 실험에서는 catechol 2, 3-dioxygenase의 발현 효율을 높이며, catechol의 분해산물이 다음 단계로 분해되지 않고 축적되도록 하기 위하여 Burkholderia cepacia G4의 catechol 2, 3-dioxygenase를 암호화하는 tomB 유전자가 cloning된 재조합 균주 E. coli CNU312균주를 사용하여 catechol 2, 3-dioxygenase를 정제하고 효소학적 특성을 조사하였다.
- 효소의 기질 특이성을 알아보기 위해 여러가지 기질에 대한 효소 활성을 조사하였다. 기질로는 catechol, 3-methylcatechol, 4- methylcatechol, 4-chlorocatechol 그리고 2, 3-dihydroxybiphenyl을 효소 반응액에 100 μM이 되도록 첨가하여 효소 활성을 측정하였다.
제안 방법
- 재조합 균주 E. coli CNU312는 Luria-Bertani(LB) 배지(Bacto tryptone 10 g//, Bacto yeast extract 5 g/Z, NaCl 5 g//, pH 7.0) 에 sucrose 2%를 첨가한 배지를 사용하여 37P에서 14시간 배양하였다. 균주의 대량배양은 5 I jar fermentorS- 이용하여 3 I 배양하였으며, 10% 소포제 (Silicon oil) 5 ml, 통기량 3 vvm, 교반속도 200xg의 조건으로 37P에서 통기 교반하며 배양하였다.
- 이 모든 과정은 Econo system(Bio-Rad, USA)을 사용하였다. 위 과정으로 얻어진 효소를 가지고 polyacrylamide gel 전기영동을 실시하였다. gele 두께 1.
- 8)를 사용하여 41에서 45V로 24시간동안 전기영동을 실시하였다(SE 600 Series standard Dual cooled units, Hoefer, USA). 전기영동이 끝난 후 기질을 분무하여 노란색을띠는 band 위치와 일치하는 나머지 band를 자른 후 gel slice들을 모았다. 이와 같이 얻은 gel slice를 가지고 Electro Eluter (Model 422, Bio-Rad, USA>를 사용하였는데 gel slice를 유리관에 채운 후 protein elution buffer(25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine, 5% glycerol)를 사용하여 4℃(그에서 유리관 당 8 mA로 5 시간 동안 용출하였다.
- Catechol 2, 3-dioxygenase의 활성은 100 의 catechole 25℃ 에서 반응시킨 후 생성되는 생성물(2-hydroxymuconic semial- dehyde)을 UV-visible spectrophotometer(Ultrospec 1000E, Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 375 nm에서 흡광도를 즉정하였다. 기질인 catech이은 ethanol에 녹여 10 mM catechol stock 을 만들어 사용하였다.
- 효소의 분자량 측정은 native-PAGE와 SDS-B\GE를 실시하여 측정하였다. Native-R\GE는 8% separating gel(두께 1.
- 5 mm)과 5% stacking geh을 사용하였으며, 4P에서 45V로 일정하게 하여 약 24시간 정도 전기영동하였다(SE250 Mighty small U system, Hoefer, USA). Active staininge 10 mM의 catechol을 분무하여 노란색으로 나타나는 band를 확인하였으며, staining solution (coomassie brilliant blue R-250 1.0g, methanol 450 ml, glacial acetic acid 100 ml, H2O 450 ml에서 1시간 동안 염색한 후 destaining solution I(methanol 500 ml, glacial acetic acid 100 ml, Hfi 400 ml)으로 2시간 동안 탈색한 다음 destaining solution n(methanol 50 ml, glacial acetic acid 70 ml, H2O 880 ml)로 12시간 동안 2차 탈색하여 단백질 band를 확인하였다. 단백질의 분자량은 표준 단백질로 thyroglobulin(669 kDa), ferritin (44Q kDa), cat 이 ase(232 kDa), aldolase(158 kDa), albumin bovine(66 kDa), albumin egg(45 kDa) (Pharmacia Biotech.
- 0g, methanol 450 ml, glacial acetic acid 100 ml, H2O 450 ml에서 1시간 동안 염색한 후 destaining solution I(methanol 500 ml, glacial acetic acid 100 ml, Hfi 400 ml)으로 2시간 동안 탈색한 다음 destaining solution n(methanol 50 ml, glacial acetic acid 70 ml, H2O 880 ml)로 12시간 동안 2차 탈색하여 단백질 band를 확인하였다. 단백질의 분자량은 표준 단백질로 thyroglobulin(669 kDa), ferritin (44Q kDa), cat 이 ase(232 kDa), aldolase(158 kDa), albumin bovine(66 kDa), albumin egg(45 kDa) (Pharmacia Biotech., Sigma Chemical Co., USA)를 이용하여 측정하였다. SDS-SGE 는 12% separating gel(두께 1.
- , USA)를 이용하여 측정하였다. SDS-SGE 는 12% separating gel(두께 1.5 mm)과 5% stacking gel을 사용하여 4, C에서 200 V로 일정하게 하여 약 30분 동안 전기영동한후 native-PAGE와 같은 조건으로 염색과 탈색을 하였다. 표준단백질로는 phosphorylase B(97.
- 5 mm)과 5% stacking gel을 사용하여 4, C에서 200 V로 일정하게 하여 약 30분 동안 전기영동한후 native-PAGE와 같은 조건으로 염색과 탈색을 하였다. 표준단백질로는 phosphorylase B(97.4), bovine serum albumin(66.2), glutamate dehydrogenase(55), ovalbumin(42.7), aldolase(40), carbonic anhydrase(31), soybean trypsin inhibitor(21.5), lysozyme (14.4) (Mid-range protein MW markers, Promega Co., USA)를 이용하여 측정하였다.
- 조사하였다. pH에 대한 효소의 안정성 실험은 각각의 pH에서 4℃에서 48시간 동안 방치한 후, 잔존하는 효소활성을 조사하였다. 온도에 대한 영향은 10~80℃의 구간에서 효소 반응을 수행하여 최적 반응 온도를 조사하였고, 온도에 대한 효소의 안정성 실험은 각각의 온도에서 30분간 열처리한 후 잔존하는 효소 활성을 조사하였다.
- pH에 대한 효소의 안정성 실험은 각각의 pH에서 4℃에서 48시간 동안 방치한 후, 잔존하는 효소활성을 조사하였다. 온도에 대한 영향은 10~80℃의 구간에서 효소 반응을 수행하여 최적 반응 온도를 조사하였고, 온도에 대한 효소의 안정성 실험은 각각의 온도에서 30분간 열처리한 후 잔존하는 효소 활성을 조사하였다.
- 효소 활성에 영향을 줄 수 있는 금속이온들을 효소에 최종농도 0.05 mM, 0.1 mM 그리고 0.5 mM로 첨가한 후 효소활성을 측정하였다. Buffer로는 10 mM Tris-HCl buffer(pH 8.
- 효소의 활성 부위에 존재하는 아미노산 잔기를 알아보기 위해 아미노산 수신 시약인 iodine, N-bromosuccinimide(NBS), naph-thoqumone-4-sulfonic acid(NQS), 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), glyoxal, N-ethylmaleimide, p-diazobenzene sulfonic acid, p-chloromercuri benzoic acid를 반응시켜 죠소 활성을 즉정하였다. 긱긱의 반응시약을 효소에 최종농도 0.
- 긱긱의 반응시약을 효소에 최종농도 0.1 mM과 1 mM로 첨가하여 251에서 30분간 방치한 후 효소의 잔존활성을 측정하였다.
- 효소 활성의 안정화에 영향을 줄 수 있는 다양한 유기용매에 의한 catechol 2, 3-dioxygenase의 활성 정도를 알아보았다. 유기용매로는 ethanol, isopropyl alcohol, acetone, ethyl acetate, acetic acid를 효소 반응액에 10%가 되도록 첨가하고 150시간까지 잔존하는 효소 활성을 측정하였다.
- 유기용매로는 ethanol, isopropyl alcohol, acetone, ethyl acetate, acetic acid를 효소 반응액에 10%가 되도록 첨가하고 150시간까지 잔존하는 효소 활성을 측정하였다.
- 효소의 활성에 영향을 줄 수 있는 킬레이트로 EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), tiron(4, 5-dihydroxy-l , 3-benze- nedisulfonic acid disodium salt), o-phenanthrolinee 사용하여 0.1 mM과 1 mM의 농도로 처리한 후 효소 활성의 억제정도를 측정하였다.
- 산화제와 환원제에 의한 효소활성의 영향을 알아보기 위해 산화제로 HQ, 를 사용하였고, 환원제로는 2-mercaptoethanol, di- thiothreitol, ascorbic acid를 각각의 농도별로 처리하여 효소활성억제 정도를 측정하였다.
- 활성을 조사하였다. 기질로는 catechol, 3-methylcatechol, 4- methylcatechol, 4-chlorocatechol 그리고 2, 3-dihydroxybiphenyl을 효소 반응액에 100 μM이 되도록 첨가하여 효소 활성을 측정하였다. 각 기질의 반응산물에 대한 최적 홉광도와 몰 흡광계수는 다음과 같다; catechol(λmax=375 nm, ε=33,000cm-1M-1), 3-methylcatechol (λmax=388 nm, ε=13,400 4-methyl-catechol(Xmax=382 nm, ε=28,100 4-chlorocatechol (λmax=379 nm, e=39,600 cm-1M-1), 2,3-dihydroxybiphenyl (λmax= 434 nm, ε=22,000 cm-1M-1)(9).
- 배양균 상등액의 침전물을 Sephadex G-75로 6시간 동안 gel filtration하였을 때 18-30 fraction에서 활성을 보였다. 활성 분획을 농축시킨후, 전기영동과 Electro-elution을 행하여 native-PAGE로 효소의 단일 밴드를 확인하였다. 정제 결과 Table 1과 같이 최종 수율은 20.
- Catechol을 비롯한 여러가지 기질들을 이용하여 각 기질의 분해 능력을 조사하였다. Fig.
- Potassium phosphate buffer(50 mM, pH 6-8), Tris-HCl buffer (50 mM, pH 8-9), glycine-NaOH buffer(50 mM, pH 9~ 10)를 사용하여 효소 반응액을 각각의 pH로 맞추어 준 후, pH에 대한 영향을 조사하였다. pH에 대한 효소의 안정성 실험은 각각의 pH에서 4℃에서 48시간 동안 방치한 후, 잔존하는 효소활성을 조사하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 E. coli CNU312는 Burkholderia cepacia G4로부터 클로닝 된 균주로서 tomB 유전자를 암호화하는 Sacl- HindHI DNA fragment(2.2 kb)를 가지고 있는 재조합균주이다 (12).
이론/모형
- catechol 2, 3-dioxygenase의 1 unit는 1분당 1 Mmol의 2-hydroxymuconic semialdehyde# 생성하는 효소의 양으로 정의하였으며, 2-hydroxymuconic semialdehyde의 몰흡광계수 값은 33, 000으로 하여 계산하였다(9). 단백질 양의 측정은 표준 단백질로 bovine serum albumin 정량 Kit(No. 95656, Sigma Chemical Co., USA)를 사용하였고 Lowry 방법으로 수행하였다 (13).
성능/효과
- Catechol 2, 3-dioxygenase는 native-PAGE를 통해 active stain- ing을 실시한 결과 노란색의 band를 확인할 수 있었으며 , 분자량은 약 140.4 kDa이였다. SDS-PAGE를 통해 분자량을 측정했을때는 약 35 kDa으로서, 4개의 동일한 subunit로 구성된 homotetramer인 것으로 주정되었다.
- 4 kDa이였다. SDS-PAGE를 통해 분자량을 측정했을때는 약 35 kDa으로서, 4개의 동일한 subunit로 구성된 homotetramer인 것으로 주정되었다. 이 subunit의 크기는 Oh등 (1997)에 의한 Burkholderia cepacia G4가 생산하는 효소와 같은 효소임을 의미한다.
- pH에 대한 효소 활성의 정도를 조사한 결과, Fig. 2A에서 보는 바와 같이 pH 8.0에서 최대의 효소 활성을 보였으며, pH 7.0-8.0 범위에서 비교적 안정하였다. 반면 pH 9.
- 그러나 다른 extradiol dioxygenase들은 대개 pH 7-8에서 최적 pH를 보이고 있어 대체로 비슷한 특성을 보이고 있는 것으로 생각된다. 온도에 대한 효소 활성은 HTC에서 40℃까지 꾸준히 증가하였으나, 50℃이후 급격히 감소되었으며, 효소 활성의 최적 온도는 40℃였다. 효소의 안정성은 60℃ 이후 효소 활성이 완전히 상실되었으며, 5(rc까지는 비교적 안정하였다(Fig.
- 그러나 Fe3+를 킬레이트하는 Tiron의 경우 큰 영향을 받지 않았다. 따라서 본 실험에서 정제된 catechol 2, 3-dioxygenase는 Fe2+에 의해 활성이 억제되었으나, prosthetic group으로 Fe2+를 가지고 있는 전형적인 extradiol dioxygenase의 특성을 지니고 있는 것으로 생각된다.
- P20(13)과 Rhodococcus globerulus P6(l)이 생산하는 2, 3-DHBP dioxygenase, Pseudomonas putida GJ31(6)이 생산하는 chlorocatechol 2, 3-dioxygenase, 그리고 Bacillus macerans JJlb(17) 가 생산하는 protocatechuate 2, 3- dioxygenase도 HQ?에 의해 효소 활성이 저해되었다. 환원제가 효소 활성에 미치는 영향은 Table 5에서와 같이 2- mercaptoethanol, dithiothreitol, 그리고 ascorbic acid에 대해 큰 안정성을 보이지 않았다
- 능력을 조사하였다. Fig. 5에서와 같이 catechol에 대해 가장 높은 기질특이성을 보였으며, 3-methylcatechol에 대해서도 42.49%의 기질특이성을 보였다. 그리고 4-methylcatechole- 4- chkgcaiechol에 대해서는 9.
- 49%의 기질특이성을 보였다. 그리고 4-methylcatechole- 4- chkgcaiechol에 대해서는 9.01%와 5.84%의 기질특이성을 보였고, 2, 3-DHBP에 대해서는 0.41 %의 매우 낮은 기질특이성을 보였다. Pseudomonas sp.
- Pseudomonas sp. S-47(8), Pseudomonas putida GJ31(6), 그리고 Achromobacter xylosoxidans KF701(ll)에 의해 생산되어지는 catechol 2, 3-dioxygenase들도 catechol에 매우 높은 특이성을 보였으며, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 4-chlorocatechol 과 같은 기질에 대해서도 어느 정도의 분해능을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 2, 3-DHBP에 대해서는 매우 낮은 특이성을 보였다.
- DJ12(I5), 그리고 Pseudomonas sp. P20(13)에서 생산되어지는 2, 3-DHBP dioxygenasee 2, 3-DHBP에만 매우높은 기질특이성을 보였으며 다른 기질에는 매우 낮은 분해능을 보이고 있는 것으라 밝혀져, 본 실험에서 정제된 효소와 매우 상이한 기질특이성을 보였다. 이상과 같이 Burkholderia cepacia G4의 catechol 2, 3-dioxygenase는 이미 보고된 다른 균주로부터 생산되는 extradiol enzyme들과 유사한 특성 뿐 아니라 상이한 특성도 지니고 있어, 앞으로 보다 많은 연구가 필요하며 미생물을 이용한 xenobiotics의 분해연구에 보탬이 될 것으로 기대된다.
- 온도에 대한 효소 활성은 HTC에서 40℃까지 꾸준히 증가하였으나, 50℃이후 급격히 감소되었으며, 효소 활성의 최적 온도는 40℃였다. 효소의 안정성은 60℃ 이후 효소 활성이 완전히 상실되었으며, 5(rc까지는 비교적 안정하였다(Fig. 2B).
후속연구
- P20(13)에서 생산되어지는 2, 3-DHBP dioxygenasee 2, 3-DHBP에만 매우높은 기질특이성을 보였으며 다른 기질에는 매우 낮은 분해능을 보이고 있는 것으라 밝혀져, 본 실험에서 정제된 효소와 매우 상이한 기질특이성을 보였다. 이상과 같이 Burkholderia cepacia G4의 catechol 2, 3-dioxygenase는 이미 보고된 다른 균주로부터 생산되는 extradiol enzyme들과 유사한 특성 뿐 아니라 상이한 특성도 지니고 있어, 앞으로 보다 많은 연구가 필요하며 미생물을 이용한 xenobiotics의 분해연구에 보탬이 될 것으로 기대된다.
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