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제안 방법
- flavus, Asp. parasiticus)을 미리 도말하여 배양한 PDA plate(두께 4 mm)상에, inhibition zone 형성 방법의 일환으로 멸균된 cork borer(직경 9 mm)를 사용하여, 원형의 agar hole를 만든 후 길항물질 1 mg을 넣어 28。(2에서 3일간 배양시킨 후 그 저지대의 크기를 비교하여 길항 활성을 측정하였다.
- - Sephadex LH-20 (25-100 mesh, Phamacia Co.)을 MeOH-CHCl3 (4:1, V/V) 용매계로 12-16시간 동안 팽윤시켜 column(4X 100 cm)에 충진한 후 같은 용매계로 실리카겔 흡착 크로마 토그래피로 분리한 활성부분에 대하여 용출분획하여 길항 활성을 시험하였다.
- - 동결 건조한 균체 배양물을 다음 ethyl acetate(EtOAC), acetone, ethyl alcohol(EtOH), methyl alcohol(MeOH)로 추출하여 아플라톡신 생성균에 대한 길항 활성을 시험하였다.
- - 활성물질의 약 10배 량에 상당하는 silica gel(80 g, 70-230 mesh, Merck사)을 ethyl acetate로 slurry를 만들어 칼럼(1.8X48 cm)에 충진시킨 후, EtOAC-MeOH 용매계로 MeOH 농도를 50, 60, 70, 80, 90, 100% 까지 증가시키면서 stepwise 용출 방법으로 분획하여 길항 활성을 시험하였다.
- 길항균(Backus subtilis)^ 2 L LB에서 배양하고 배양액 을 원심분리하여 그 상징액을 진공동결 건조하였다. 진공동 결 건조한 길항균 대사산물을 MeOH(12.
- 따라서 antifungal bacterium #19을 동정하기 위하여 미 생물의 형태적, 생리화학적 성질을 검토하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다.
- 따라서 본 연구에서는 여러 곡류에서 분리한 아플라톡신 생성균에 대하여 가장 강력한 길항효과를 갖는 균주를 선 택하고 분리균의 배양학적, 형태학적, 생리적 특성으로 부터 균의 동정과 길항물질을 분리하였다.
- 형태적 특성으로는 Doetch법에 의해서 Gram 염색 및 형태를 관찰하였고, 미생물의 편모염색 및 운동성은 Gray 법과 현적슬라이드법으로 하였다. 미생물의 포자는 malachite green으로 염색하여 내생포자형성 유무와 포자위치를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
- 생리적 특성으로 gelatin 가수분해, starch hydrolysis, arginin dihydrolase, 탄소원 자화성 등을 조사하였다.
- A)에 150 uL씩 접종하였다. 이를 30℃ 배양기에서 4-6, 16-24시간 동안 배양한 후 computer controlled microplate reader를 이용하여 95개 탄소원의 이용성을 조사하고 Biolog사의 데 이터베이스(Biolog Microlog3, 4.01 version)을 사용하여 균을 동정하였다.
대상 데이터
- jlavus나 Asp. parasiticuse 의한 아플라톡신의 생성 및 그의 생육을 효과적으로 저지하기 위하여 식물의 추출물을 이용했을 뿐만 아니라 Lactobacilhis와 같은 미생물도 이용하였다.
- 길항물질은 길항균인 Bacillus subtilis를 Luria-Bertani (LB)배지에서 30℃에서 3일간 진탕 배양한 후 생산하고 배 양액을 원심분리하여 그 상징액을 동결 건조하여 얻었다.
- 아플라톡신 생성 균에 대한 길항 미생물을 찾기 위하여 대두, 벼, 보리 등 각종 곡류에서 500여종의 단일 균주를 분리하고 길항력 시험결과 가장 저해효과가 큰 균주 antifungal bacterium #19를 선발하였다. 선발된 antifungal bacterium #19 균주는 전남 함평 지역에서 생산된 대두에서 분리하였다.
- 아플라톡신 생성균으로는 한국종균협회로부터 분양받은 Aspergillus flavus (KCCM 35078)과 Aspergillus parasiticus (KCCM 35075X 시용하였다.
이론/모형
- 각종 곡류로 부터 희석평판법을 이용하여 단일 균주를 분 리하였다. 길항균의 분리는 채취한 시료를 tris-HCl buffer solution(pH 7.
- 분리된 길항균의 동정은 Bergey's manual of systematic bacteriology,19* Microbiological method,20) The procaryotes21* 등의 방법에 의한 미생물의 형태적 성질 및 생리 생화학적 성질과 미생물 자동동정 시스템인 Biolog system(Biolog사, Hayward, U.S.A)에 의한 결과를 병행하였다.
- 한편, 분리된 길항미생물의 자동 동정은 Biolog system (Biolog사, Hayward, U.S.A)를 이용하였다. 분리된 길항 균은 thioglycolate 액을 도말한 Biolog Universal Growth Medium(0.
- 형태적 특성으로는 Doetch법에 의해서 Gram 염색 및 형태를 관찰하였고, 미생물의 편모염색 및 운동성은 Gray 법과 현적슬라이드법으로 하였다. 미생물의 포자는 malachite green으로 염색하여 내생포자형성 유무와 포자위치를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
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