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문제 정의
- 1998). 본 연구에서는 액체배양에서 체세포배의 발아억제 현상과 경정분열조직의 구조 변화를 밝힘으로써 체세포배의 발아를 향상시키는 기초확립에 기여할 목적으로 시도되었다.
- 사사 : 본 연구는 교육부 기초과학연구소 지원 연구비 (BSRI -1998-이5-D00205)의 지원에 의해 수행되었으며 주사전자현미경에 의한 관찰을 도와준 전북대학교 생명과학부 김경식 교수에게 사의를 표하는 바이다.
제안 방법
- ) 하파품종의 종자를 70% 에탄올에 1분간 그리고 1% sodium hypochlorite 용액에 15분간 침적시켜서 표면 살균을 한 다음 멸균수로 3~4회 세척하여1/2 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에서 6일간 무균발아시킨 유식물을 재료로 사용했다. MS 기본배지에 1 mg/L 2.4- D, 및 3% 설탕을 첨가하여 pH 5.8로 조정하였고 배지의 고형화를 위해 8% 한천을 첨가하였으며 121℃, 1.2기압에서 15분간 고압멸균하여 준비된 배지에 유식물의 하배축 절편을 (5x5 mm) 배양하였다. 배양물은 25±1℃의 암처에서 3주간 유지되었다.
- 액체배지에서 발생된 발생단계별 체세포배의 발아배지는 MS 기본 배지를 액체 및 고체형으로 준비하여 사용하였다. 고형 발아 배지에서 체세포배는 3주간 배양한 후 발아율을 관찰하였다. 한편 발아율에 미치는 액체발아배지에서의 배양기간의 영향을 구명하기 위하여 액체배지상에서 발생된 자엽기 체세포 배를 1, 2, 3, 또는 4주간 액체배지에서 연속배양 후 고형 MS 기본배지에 각각 이식하여 발아율을 관찰하였다.
- 접합자배, 자엽기 체세포배 및 발아중인 체세포배의 경정분열조직은 주사전자현미경 (ISI ABT, SR-50, Tokyo, Japan)으로 관찰 및 촬영되었다. 관찰을 위한 재료는 Craf Ⅲ액에 고정한 다음 t-butyl alcohol에서 탈수시켰고 t-butyl alcohol freeze-drying method(Inoue and Osatake 1988)로 동결건조한 후 금박을 입혀서 관찰하였다.
- 증식된 현탁배양 세포괴는 100㎛ 및 200㎛의 나이론체로 이중여과시킨 다음 2, 4-D를 제거한 MS 배지로 3~4회 세정한 다음 MS 기본배지에서 배발생능 캘러스를 증식시킬 때와 같이 현탁배양하면서 배발생을 관찰하였다. 구형, 심장형, 어뢰형, 및 자엽기배 등의 발생단계별 체세포 배는 일정 배양기간에 맞춰서 선발한 다음 다시 해부현미경 밑에서 특정단계의 배만을 선별하여 발아시험에 사용하였다. 액체배지에서 발생된 발생단계별 체세포배의 발아배지는 MS 기본 배지를 액체 및 고체형으로 준비하여 사용하였다.
- 한편 발아율에 미치는 액체발아배지에서의 배양기간의 영향을 구명하기 위하여 액체배지상에서 발생된 자엽기 체세포 배를 1, 2, 3, 또는 4주간 액체배지에서 연속배양 후 고형 MS 기본배지에 각각 이식하여 발아율을 관찰하였다. 발생단계별로 30개의 체세포배를 재료로 한 관찰을 세 번 반복하여 발아율을 산정했다. 발아 판정 기준은 배축과 뿌리의 신장이 일어나며 아울러서 제1엽이 자라 나온 것으로 정했다 (Merkleet al.
- 앞에서와 같이 준비된 고형배지를 25mL씩 분주한 페트리접시 (87 mmS<15 mm)에서 하배축의 절편체로부터 캘러스를 유도한 다음 배발생능 캘러스만을 선별하였고. 0.
- 접합자배, 자엽기 체세포배 및 발아중인 체세포배의 경정분열조직은 주사전자현미경 (ISI ABT, SR-50, Tokyo, Japan)으로 관찰 및 촬영되었다. 관찰을 위한 재료는 Craf Ⅲ액에 고정한 다음 t-butyl alcohol에서 탈수시켰고 t-butyl alcohol freeze-drying method(Inoue and Osatake 1988)로 동결건조한 후 금박을 입혀서 관찰하였다.
- 4- D를 첨가한 MS 액체배지를 20mL씩 분주한 100 mL 플라스크에 옮겨 진탕기 진탕속도 100 rpm에서 현탁 배양하여 증식시켰다. 증식된 현탁배양 세포괴는 100㎛ 및 200㎛의 나이론체로 이중여과시킨 다음 2, 4-D를 제거한 MS 배지로 3~4회 세정한 다음 MS 기본배지에서 배발생능 캘러스를 증식시킬 때와 같이 현탁배양하면서 배발생을 관찰하였다. 구형, 심장형, 어뢰형, 및 자엽기배 등의 발생단계별 체세포 배는 일정 배양기간에 맞춰서 선발한 다음 다시 해부현미경 밑에서 특정단계의 배만을 선별하여 발아시험에 사용하였다.
- 체세포배의 발아에 미치는 액체 발아배지 에서의 배 양기간의 영향을 밝히기 위해 액체배지에서 발생된 자엽기배를 액체 발아 배지에서의 발아기간을 달리하여 (Figure 2) 배양한 다음 고형배지에 옮겨서 발아율을 관찰하였다. 그 결과 1주일간 액체발아배지에서 발아를 위한 배양을 하고 고형배지로 옮긴 경우 92%의 발아율을 보였지만 액체발아배지에서 배양 기간이 길어질수록 발아율은 낮아졌고 4주간 액체 발아 배지에서 배양을 한 경우에는 26% 밖에 발아되지 않았으며 계속하여 액체배지배양을 하면 전혀 발아하지 않았다.
- 고형 발아 배지에서 체세포배는 3주간 배양한 후 발아율을 관찰하였다. 한편 발아율에 미치는 액체발아배지에서의 배양기간의 영향을 구명하기 위하여 액체배지상에서 발생된 자엽기 체세포 배를 1, 2, 3, 또는 4주간 액체배지에서 연속배양 후 고형 MS 기본배지에 각각 이식하여 발아율을 관찰하였다. 발생단계별로 30개의 체세포배를 재료로 한 관찰을 세 번 반복하여 발아율을 산정했다.
대상 데이터
- 당근 (Daucus carota L.) 하파품종의 종자를 70% 에탄올에 1분간 그리고 1% sodium hypochlorite 용액에 15분간 침적시켜서 표면 살균을 한 다음 멸균수로 3~4회 세척하여1/2 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지에서 6일간 무균발아시킨 유식물을 재료로 사용했다. MS 기본배지에 1 mg/L 2.
- 구형, 심장형, 어뢰형, 및 자엽기배 등의 발생단계별 체세포 배는 일정 배양기간에 맞춰서 선발한 다음 다시 해부현미경 밑에서 특정단계의 배만을 선별하여 발아시험에 사용하였다. 액체배지에서 발생된 발생단계별 체세포배의 발아배지는 MS 기본 배지를 액체 및 고체형으로 준비하여 사용하였다. 고형 발아 배지에서 체세포배는 3주간 배양한 후 발아율을 관찰하였다.
성능/효과
- 옮겨서 발아율을 관찰하였다. 그 결과 1주일간 액체발아배지에서 발아를 위한 배양을 하고 고형배지로 옮긴 경우 92%의 발아율을 보였지만 액체발아배지에서 배양 기간이 길어질수록 발아율은 낮아졌고 4주간 액체 발아 배지에서 배양을 한 경우에는 26% 밖에 발아되지 않았으며 계속하여 액체배지배양을 하면 전혀 발아하지 않았다.
- 체세포배의 발아는 배축의 신장 및유근의 생장으로부터 시작되며 이와 같은 생장과정을 발아된 것으로 판정하는 경우가 적지 않다. 그러나 본 연구에서는 유근의 생장과 더불어 유경으로 부터 저H 엽이 발생된 경우만을 발아한 것으로 판정했으며 이와 같은 기준을 적용하면 자엽기 체세포배를 액체발아배지에서 4주 이상 발아시켜도 발아가 되지 않는 것을 확인했다 (Figure 3B). 유근이 생장한 상태를 발아로 인정하면 figure 3B는 발아한 것으로 판정되겠지만 4주 이상 액체발아배지에서 배양해도 경엽부의 형성은 물론 발생중인 제 1엽의 생장이 일어나지 않았으므로 유식물의 재생은 될 수 없었다.
- 본 연구의 주사전자현미경 관찰에서 경정분열조직의 불규칙적인 세포배열 등 비정상구조와 이로부터 발생된 부실한 엽원기의 생장정지현상 (Figure 5) 또는 엽원기의 발생이 일어나지 않는 현상이 확인되었으며 이와 같은 결과는 체세포 배가 발아하지 못한 주요 원인으로 판단된다. 고형배지에서 발아시킨 당근 및 고구마의 체세포배 중에서 발아되지 않는 체세포 배가 많았으며 이들 체세포배의 경정분열조직을 종단면으로 관찰한 결과 구조적 결함을 가지고 있었다는 것이 밝혀졌다 (Nickle and Yeung, 1993; Padmanabhan et al.
- 자엽기배의 일부에서는 배축에 2차배 형성이 일어났지만 대부분의 배가 휴면 없이 발아하여 유식물로 재생되었다. 이처럼 액체배지에서 체세포배를 자엽시기까지 발생시킨 다음 고형 발아 배지에서 계대배양하면 정상적인 유식물체의 재생이 잘 일어났다.
후속연구
- 1996). 경정부의 발생과정에서 저장 물질의 축적현상은 본 연구의 범위 밖에 있으므로당근 체세포배의 발아에 대한 심도 있는 이해를 위해 경정 분열조직의 형태학적인 관찰에 이어서 저장물질의 변화와 경정 분열조직의 분화에 관한 연구도 수행되어야 할 것이다.
- (Nickle and Yeung 1993; Soh 1993). 특히 액체배지 배양에서 이와 같은 장애가 많으므로 경정 분열조직의 활성과 체세포배 발아의 관계에 관심을 기울여야 할 것이다. (Soh, 1996; Padmanabhan et al.
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