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문제 정의
- 1977; Robinson and Kristen 1982)에 근거하고 있다. 이러한 보고를 통하여 본 실험에서는 인삼 {Panax ginseng C. A. Meyer) 캘러스 조직으로부터 분리한 원형 질체를 배양하면서 배지 속에 첨가된 DMSO가 원형질체의 세포벽 재생과 세포 분열에 미치는 영향을 알아보고, 원형질체 배양에 적절한 DMSO의 농도를 조절하여 줌으로써 원형질체의 계속적인 성장 및 분화를 유도할 목적으로 실시하였다.
제안 방법
- 후고정이 완료된 재료는 상기 buffer로 20분간 3회 세척하고 난 후 1 mm3 크기의 1% agar block을 만들어 ethanol 상승 농도순으로 탈수시켜서 propylene oxide로 치환한 다음 Araldite-Epoxy resin을 침투, 포매하였다. Epon 절편은 유리칼을 사용하여 Sorvall ultrami- crotome으로 절단하였다. 두꺼운 절편은 0.
- 부착된 여과지 측면에 silver paint로 mounting하였다. 동판에 부착된 재료는 ion spotter에 넣 고 gold-paladium으로 이온증착시켜 주사전자현미경 (JEOL EM-ASID-4D)으로 40kV 에서 관찰, 촬영하였다
- Epon 절편은 유리칼을 사용하여 Sorvall ultrami- crotome으로 절단하였다. 두꺼운 절편은 0.05% toluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였으며, 금은색 절편은 포화 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색한 다음 투과전자현미경 (jem 120 CXII/ASID)으로 80 kV에서 관찰 촬영하였다. 주사전자현미경 관찰을 위하여는 상기 탈수가 끝난 재료를 여과지 (Whattman No.
- 0 mL를 접종한 후 parafilm으로 밀봉하여 25±1℃에서 암배양하였다. 배양한 원형질체의 세포벽 재생 여부 측정은 0.1% celhifluor로 30분간 염색한 후 UV-Spectrophotometer> 사용하여 300~400nm 사이의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 5 M mannitol용액 1 mL을 첨가한 다음 원심분리 (100 X g, 5분)하여 살아있는 원형질체만을 순수 분리하였다. 순수분리된 원형질체는 Pasteur pipette을 사용하여 모은 후 MS배지에 1 mg/L 2, 4-D, 4 mg/L NAA, 1 mg/L BAP 및 0.4 M mannitol이 첨가된 MS배양액으로 3회 원심분리하 여 세척하였다 원형질체 배양은 liquid-on-agar 배양법을 이용하여 상기의 MS배양액에 여러가지 농도의 DMSO와 0.8% agar를 첨가시킨 원형질체 배양배지를 직경 50 mm plastic petri dish에 2.5 mL 정도 얇게 깔아 굳힌 다음, 원형 질체의 밀도가 5 X lO'-loS/mL인 원형질체 현탁액 1.0 mL를 접종한 후 parafilm으로 밀봉하여 25±1℃에서 암배양하였다. 배양한 원형질체의 세포벽 재생 여부 측정은 0.
- 05% toluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였으며, 금은색 절편은 포화 uranyl acetate와 lead citrate로 이중염색한 다음 투과전자현미경 (jem 120 CXII/ASID)으로 80 kV에서 관찰 촬영하였다. 주사전자현미경 관찰을 위하여는 상기 탈수가 끝난 재료를 여과지 (Whattman No.l)에 올려 N-amylacetate로 치환시켜 CO2를 이용한 임계점 건조기로 건조시켰고, 동 판위에 양면 Scotch tape를 붙이고 그 위에 재료가 붙어 있는 여과지를 부착시켰다. 부착된 여과지 측면에 silver paint로 mounting하였다.
대상 데이터
- 4~5년생 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer)의 뇌두 조직편을 배양하여 유도한 캘러스 조직을 MS고체배지에서 계대 배양하여 원형질체 분리 및 배양의 실험재료로 사용하였다.
- 인삼 캘러스 조직으로부터 분리한 원형 질체를 배양배지에 DMSO를 0%에서부터 8%까지 11개의 실험구로 처리를 달리한 배지에서 배양하였다. DMSO를 첨가하지 않은 배지에서 24시간 동안 배양한 원형 질체는 분리 직후의 원형질체 (Figure 1A)와 거의 유사하게 대부분이 구형의 세포형태를 하고 있었다.
성능/효과
- 특히 배지에 첨가된 DMSO는 원 형질체의 세포벽 재생 효율과 세포분열 빈도를 높이는 것으로 나타났다. DMSO가 첨가되지 않은 배지에서 배양된 원형 질체의 세포벽 재생은 약 62%였으며, 세포분열 빈도는 약 7%로 매우 낮았다. 반면에 1% DMSO가 첨가된 배지에서 배양된 원형질체의 세포벽 재생은 약 83%이었고 세포분열 빈도도 약 27%로 높게 나타났다.
- 1% cellufluor로 형광염색하였을 때 DMSO를 첨가하지 않은 배지에서 배양된 원형 질체와는 달리 매우 밝은 형광을 나타내어 세포벽이 재생되었음을 알 수 있었다 (Figure 1H). 각 배지에서 3일 동안 배양된 원형질체의 세포활성을 비교한 결과 DMSO 첨가유무나 첨가된 DMSO의 농도와는 관계없이 대부분의 배지에서 약 83~88%의 활성을 나타내어 (Figure 3),원형질체 배양시 DMSO는 세포활성에는 별로 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다. 한편 DMSO가 첨가되지 않은 배지와 DMSO가 첨가된 배지에서 3일 동안 배양된 원형질체의 세포벽 재생률을 비교한 결과, DMSO가 첨가되지 않은 배지보다 첨가된 배지의 세포벽 재생률이 전체적으로 높게 나타났다.
- 또한 세포분열 양상도 세포판 형성에 의한 정상적인 분열보다는 돌기를 형성한 후 세포질이 이동하여 2개의 세포로 나뉘어지는 분열 양상인 출아현상이 많이 관찰되었다(Figure IB). 그러나 배지에 첨가된 DMSO의 농도가 높아질수록 세포분열이 점차 증가되다가 1% 농도에서 세포분열 빈도가 약 27%로 최대치를 나타내었고 1%보다 더 높은 농도인 2% 이상의 농도에서는 세포분열이 급격히 감소되었다 (Figure 2). 1% DMSO를 첨가한 배지에서 1일 동안 배양한 원형 질체는 난형이나 길게 신장된 형태를 나타내었고(Figure 1C) 첫 분열은 배양 3~4일 후에 (Figure ID), 2차 분열은 배양 5~6일 후에 관찰되었다 (Figure IE).
- 배양 약 2주 후에는 수많은 세포괴들이 관찰되었으며 (Figure IF), 육안으로 관찰 가능한microcalli는 배양 약 5주 후에 관찰되었다 (Figure 1G). 또한 1% DMSO를 첨가한 배지에서 1~2일 동안 배양된 난형 또는 신장된 형태의 원형 질체를 0.1% cellufluor로 형광염색하였을 때 DMSO를 첨가하지 않은 배지에서 배양된 원형 질체와는 달리 매우 밝은 형광을 나타내어 세포벽이 재생되었음을 알 수 있었다 (Figure 1H). 각 배지에서 3일 동안 배양된 원형질체의 세포활성을 비교한 결과 DMSO 첨가유무나 첨가된 DMSO의 농도와는 관계없이 대부분의 배지에서 약 83~88%의 활성을 나타내어 (Figure 3),원형질체 배양시 DMSO는 세포활성에는 별로 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다.
- 원형질체 배양배지에 1% DMSO를 첨가하여 3일 동안 배양한 원형질체를 투과전자현미경으로 관찰하였을 때 미소관(microtubule)이 원형질막 근처에 평행으로 배열되어 있는 것이 관찰되었다 (Figure 6A). 또한 주사전자현미경으로 관찰한 결과, 분리 직후의 원형질체는 원형질막 표면에 아무것도 형성되어 있지 않은 반면에 (Figure 6B) 배양 1일 후에는 가느다란 fibril들이 원형질막 표면에 형성되어 있었고 (Figure 6C) 배양시간이 경과할수록 점차 fibril 의 양이 많아지면서 이웃한 fibril들과 연결되어 다발을 형성하는 것이 관찰되었다 (Figure 6D).
- DMSO가 첨가되지 않은 배지에서 배양된 원형 질체의 세포벽 재생은 약 62%였으며, 세포분열 빈도는 약 7%로 매우 낮았다. 반면에 1% DMSO가 첨가된 배지에서 배양된 원형질체의 세포벽 재생은 약 83%이었고 세포분열 빈도도 약 27%로 높게 나타났다. 이러한 결과는 인삼 캘러스 원형질체를 배양할 때 배지에 첨가된 1% DMSO가 세포벽 재생된 원형질체의 세포분열을 촉진시키는 것으로 생각된다.
- 인삼 캘러스 조직으로부터 분리한 원형 질체를 DMSO가 첨가되지 않은 배지와 여러가지 농도의 DMSO가 첨가된 배지에서 배양한 결과 1%DMS#가 첨가된 배지가 원형질체 배양에 매우 효과적이었다. 특히 배지에 첨가된 DMSO는 원 형질체의 세포벽 재생 효율과 세포분열 빈도를 높이는 것으로 나타났다.
- 주사전자현미경으로 관찰된 배양된 원형질체의 표면에 형성된 microfibril이 정상적인 세포벽 성분인 cellulose로 구성되어 있는지를 조사한 결과, 캘러스 세포와 비교하여 형광량의 정도에는 다소 차이가 있으나 거의 유사한 peak를 나타내어 정상 세포의 세포벽과 같은 성분으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 배양된 담배 엽육원형질체의 표면에서 형성된fibril이 cellulose성분으로 되어 있음이 보고 (Nagata and Yamaki 1973)된 이후, 당근 배양세포의 원형질체를 배양하 였을 때 초기에는 원형질체 표면에 짧은 polymer를 형성하다가 점차 배양기간이 길어짐에 따라 정상적인 길이의cellulose chain이 형성되었음이 보고되었다 (Asamizu et al.
- 한편 DMSO가 첨가되지 않은 배지와 DMSO가 첨가된 배지에서 3일 동안 배양된 원형질체의 세포벽 재생률을 비교한 결과, DMSO가 첨가되지 않은 배지보다 첨가된 배지의 세포벽 재생률이 전체적으로 높게 나타났다. 특히 DMSO가 첨가되지 않은 배지에서의 세포벽재생률이 약 62%인 반면, 1% DMS#가 첨가된 배지에서의 재생률은 약 83%로 높게 나타났다(Figure 4).
- 가 첨가된 배지가 원형질체 배양에 매우 효과적이었다. 특히 배지에 첨가된 DMSO는 원 형질체의 세포벽 재생 효율과 세포분열 빈도를 높이는 것으로 나타났다. DMSO가 첨가되지 않은 배지에서 배양된 원형 질체의 세포벽 재생은 약 62%였으며, 세포분열 빈도는 약 7%로 매우 낮았다.
- 각 배지에서 3일 동안 배양된 원형질체의 세포활성을 비교한 결과 DMSO 첨가유무나 첨가된 DMSO의 농도와는 관계없이 대부분의 배지에서 약 83~88%의 활성을 나타내어 (Figure 3),원형질체 배양시 DMSO는 세포활성에는 별로 영향을 미치지 않았음을 알 수 있었다. 한편 DMSO가 첨가되지 않은 배지와 DMSO가 첨가된 배지에서 3일 동안 배양된 원형질체의 세포벽 재생률을 비교한 결과, DMSO가 첨가되지 않은 배지보다 첨가된 배지의 세포벽 재생률이 전체적으로 높게 나타났다. 특히 DMSO가 첨가되지 않은 배지에서의 세포벽재생률이 약 62%인 반면, 1% DMS#가 첨가된 배지에서의 재생률은 약 83%로 높게 나타났다(Figure 4).
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