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문제 정의
- 본 연구는 천연산삼의 부정근을 인공적으로 조직 배양하여 추출한 추출물의 화장품 원료로서의 이용 가능성을 조사하였다.
- 지속되어 왔다. 이에 본 연구는 종래의 미백 원료들이 가지고 있는 문제점을 해결하고 보다 미백 효과가 뛰어난 원료를 찾기 위하여 식물 조직배양으로부터 얻어진 산삼 부정근을 그 대상으로 삼았다.
제안 방법
- 8mm fin chamber(면적 50mm2, 부피 20以)에 필터 종이 디스크를 얹은 후 산삼 부정근추출물(4%)을 마이크로피펫을 이용하여 0.015威씩 채운 후 첩포 시험을 하였다. Micropore tape이 부착된 첩포(3cmX7cm의 면적)를 연구 참여자의 전박부에 24시간 동안 부착하고 24시간이 지난 후 첩포를 제거하였다.
- B-16 melanoma cell을 10% FBS(GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO)으로 6 well에 세포수 2X 10‘cells/well의 농도로 각 well에 2ml씩 첨가하고 5% CO2> 37℃ 조건하에서 24시간 배양하였다. Gordon。)의 방법에 따라 실험하였으며 ELISA reader로 490nm에서 홉광도를 측정하여 melanin 저해율을 측정하였다.
- 침전물을 6N HC1 1ml과 증류수로 헹군 다음 soluene 350 2ml에 녹인다. spectrophotometer를 이용하여 400nm에서 홉광도를 측정하였다.
- Gordon。)의 방법에 따라 실험하였으며 ELISA reader로 490nm에서 홉광도를 측정하여 melanin 저해율을 측정하였다. 또한 video microscope# 이용하여 사진촬영 후미백 활성을 육안 판정하였다.
- 배양 후 배지를 제거하고 농도별로 희석한 시료를 첨가하고 5% CO2, 37℃ incubator에서 24시간 배양한다. 배양 후 cell을 회수하여 1ml의 배지와 0.2ml의 0.4% Trypan blue(GIBCO)를 섞은 solution 을 넣은 후 5분~15분 후에 hemocytometer를 이용하여 cell수를 측정하였다.
- 산삼 부정근 추출물에 대하여 B-16 melanoma cell을 이용하여 미백효과를 측정하였다. B-16 melanoma cell을 10% FBS(GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO)으로 6 well에 세포수 2X 10‘cells/well의 농도로 각 well에 2ml씩 첨가하고 5% CO2> 37℃ 조건하에서 24시간 배양하였다.
- 색소를 추출하여 ELISA reader를 이용하여 홉광도를 측정하여 세포 생존율(NR50)을 구하였다.
- Micropore tape이 부착된 첩포(3cmX7cm의 면적)를 연구 참여자의 전박부에 24시간 동안 부착하고 24시간이 지난 후 첩포를 제거하였다. 약 60분간 안정을 취하도록 한 후 첫 판독을 시행하였고, 첩포 부착 후 48 시간이 경과한 후 2차 판독을 시행하였다. 판정 기준은 아래 기술되어 있는 Table 1의 판정 기준을 이용하였다.
- 첩포 부착 후 24시간과 48시간에 판독한 결과를 아래에 기술된 공식을 이용하여 각 시료에 대한 피부 반응도를 산출하였다. 첩포 부착 후 24시간과 48시간에서의 피부 반응도를 계산한 후 산술 평균하여 각 시료의 평균 피부 반응도를 계산하였다.
- 대한 피부 반응도를 산출하였다. 첩포 부착 후 24시간과 48시간에서의 피부 반응도를 계산한 후 산술 평균하여 각 시료의 평균 피부 반응도를 계산하였다.
대상 데이터
- 110년산 천종삼(강원도 평창에서 채취)의 식물체로부터 유기된 캘러스로부터 유도된부정근을 발근에 적합한 생장 호르몬 IBA(Indolebutyric acid) 5.0mg/l(Duchefa), 5% scurose 가 함유한 Murashige & Skoog medium(Duchefh)에서 현탁 배양(Fig. 1) 하였다.
이론/모형
- B-16 melanoma cell을 10% FBS(GIBCO)가 함유된 DMEM(GIBCO)으로 6 well에 세포수 2X 10‘cells/well의 농도로 각 well에 2ml씩 첨가하고 5% CO2> 37℃ 조건하에서 24시간 배양하였다. Gordon。)의 방법에 따라 실험하였으며 ELISA reader로 490nm에서 홉광도를 측정하여 melanin 저해율을 측정하였다. 또한 video microscope# 이용하여 사진촬영 후미백 활성을 육안 판정하였다.
- Mosmann(8)의 방법에 따라 ELISA reader를 이용하여 홉광도를 측정하여 세포생존율 (MTT50)을 구하였다.
- Mouse fibroblast L929를 2% BCS가 함유된 DMEM배지를 이용하여 96well plate에 3 X103 cell/well이 되도록 분주한 후 Babich⑺의 방법에 따라 실험을 실시하였다. 색소를 추출하여 ELISA reader를 이용하여 홉광도를 측정하여 세포 생존율(NR50)을 구하였다.
성능/효과
- 산삼 부정근과 그 농축액의 DOPA 자동산화 억제 실험 결과는 Table 5와 같다. 각 실험 물질의 농도가 증가함에 따라 억제율도 기하 급수적으로 증가하였으며 산삼 부정근농축액 0.1% 농도에서는 68%로 arbutin과 비슷한 억제율을 보였다. 또한 인삼 농축액 1% 농도에서는 단지 7%정도의 억제율을 보였다.
- 산삼 농축액은 대조군인 arbutin과 비교해 tyrosinase inhibition rate는 약간 떨어지나 Dopa auto-oxidation 저해 효과에서는 대조군과 비슷한 결과를 얻었다. 또한 B-16 melanoma cell내의 melanin 억제율을 측정한 결과, 대조군 보다 높은 수치를 보였다. 이러한 결과들로 미루어 볼 때 산삼근 추출물은 tyrosinase 뿐만 아니라 melanin 을 생성하는 각각의 단계에 영향을 미치는 proteins family 에 영향을 주어 hydroxylation이나 oxitation에 영향을 주는 것으로 보여진다.
- 2와 같이 시료처리를 하지 않은 것과 비교해 차이가 없었다. 또한 cytotoxicity test인 NR assay와 MTT assay에서도 세포 독성은 없는 것으로 보아 산삼 부정근 추출물의 melanin 억제 효과는 세포 사멸에 의한 것이 아닌 tyrosinase와 연관된 효소와 기타의 여러가지 억제 작용에 의한 것이리라 생각된다.
- 1% 농도에서는 68%로 arbutin과 비슷한 억제율을 보였다. 또한 인삼 농축액 1% 농도에서는 단지 7%정도의 억제율을 보였다.
- inhibition 효과를 나타내었다. 산삼 부정근 농축액은 1% 농도에서 45%의 inhibition rate를 보였으며 같은 농도에서 85%의 억제율을 보인 arbutin보다는 다소 적은수치를 나타내었으나(table 4) 인삼 부정근과 인삼 추출물과 비교해 볼 때 월등히 높은 수치를 나타내었다.
- 산삼 부정근 추출물 및 인삼 추출물을 이용하여 B-16내의 melanin 생성 억제율을측정한 결과 산삼 부정근 추출물 및 농축액은 다른 시료에 비하여 우수한 것으로 나타났다. 또한 인삼 농축액의 경우 0.
- 산삼 부정근의 미백 효과를 알아보기 위한 실험을 실행한 결과 melanin 생성 억제에 우수한 것으로 나타났다. 산삼 농축액은 대조군인 arbutin과 비교해 tyrosinase inhibition rate는 약간 떨어지나 Dopa auto-oxidation 저해 효과에서는 대조군과 비슷한 결과를 얻었다.
- 거쳐야 할것으로 생각된다. 실험결과에서 볼 수 있듯이 산삼 부정근 추출물이 여타의 인삼 추출물이나 인삼 부정근 추출물에서 보여지는 결과보다 상당히 좋은 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.
- 또한 B-16 melanoma cell내의 melanin 억제율을 측정한 결과, 대조군 보다 높은 수치를 보였다. 이러한 결과들로 미루어 볼 때 산삼근 추출물은 tyrosinase 뿐만 아니라 melanin 을 생성하는 각각의 단계에 영향을 미치는 proteins family 에 영향을 주어 hydroxylation이나 oxitation에 영향을 주는 것으로 보여진다.
- 6). 현재 화장품에 일반적으로 사용하고 있는 미백 물질을 대조군으로 하여 산삼 부정근 추출물을 비교 실험한 결과 산삼 부정근 추출물의 NR50값은 1이상, MTT50값 역시 1이상으로 대조군인 kqjic acid와 vitamin C, arbutin 보다 훨씬 좋은 결과를 얻었다.
후속연구
- 그밖에 천연물 특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구가 계속 이루어져왔고, 그 중 상백피, 감초, 작약, 계피, 고삼, 갈근, 당귀, 목단피, 반흐卜, 알로에 등 다수의 식물 추출물(3, 4) 및 생약재 추출물 등이 tyrosinase 억제 활성이 있다는 사실은 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 미백에 있어 그 효과가 명백하지 않다는 한계가 있었다.
- 산삼의 어떤 성분이 이런 미백 작용을 하는지에 관해서는 앞으로 더욱더 많은 실험과정을 거쳐야 할것으로 생각된다. 실험결과에서 볼 수 있듯이 산삼 부정근 추출물이 여타의 인삼 추출물이나 인삼 부정근 추출물에서 보여지는 결과보다 상당히 좋은 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.
- 아울러, 산삼 부정근 추출물이 각각의 어떤 단계에 영향을 미치는지에 대해 보다 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 달리 천연물질의 추출물로 인체에 유익하다고 생각된다. 앞으로 다른 효능, 효과 탐색 실험을 거쳐 미백이 아닌 다른 영역에서의 결과도 기대할 수 있으리라 생각된다. 피부에 대한 자극이 거의 없으면서 미 백 효과가 우수한 천연 원료에 대한 이러한 조직배양으로부터 얻어진 산삼 부정근에 대한 연구는 경제적일 뿐 아니라 종래의 미백 원료들이 가지고 있는 문제점을 해결하고 보다 미백 효과가 뛰어난 원료로 그 개발 가능성이 높음을 보여준다.
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