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문제 정의
- 이에 본 연구는 생식용 잎채소로서 소비가 증가하고 있는 상에추 γ-TMT 유전자를 도입하여 촉진 발현시킴으로써(Z- tocopher이 함량이 증가된 상추 계통을 선발하고자 실시하였 다
제안 방법
- Hong 등 (1993)의 방법에 따라 형질전환 상추잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 1070 bp 단편이 증폭되도록 제작한Arabidopsis Z-TMT 유전자 특이적인 정 방향 primer (5'- GAATTCATGAAAGCAACTCTAGC-3') 와 역방향 primer (5' -TAATCGATTAGACTTAGAGTGGCTTC-3')를 사용하여 PCR을 실시하였다. 최종 25 ㎕의 PCR 반응액 조성은10 mM Tris-HCl, pH 8.
- Agrobacterium과 공동배양한 자엽절편을 MS 기본배지에500 mg/L carbenicillin, 50 mg/L kanamycin, 0.1 mg/LNAA, 0.5 mg/L BA가 첨가된 선발배지에 옮겨 23℃ 암상태에서 7일간 배양한 후 연속조명으로 명배양하여 형질전환체를 선발하였다. 분화된 신초는 50 mg/L kanamycin과 250 mg/L carbenicillin이 첨가된 MS 기본배지에서 뿌리를 유도하였고, 얻어진 식물체를 pot에 이식하여 온실에서 순화시킨 후 특성검정을 실시하였다.
- 5 mM MgCh, 200 nM primer, 200 pM dNTP, 주형 DNA 10 ng 그리고 Tag polymerase 1 unit이었다. PCR 반응은 95℃에서 1분간 predenaturation 반응을 거친 후 증폭반응 (94℃에서 50초, 57 C 에서 50초, 72℃에서 1분간 반응)을 30회 진행하였고 최종 신장반응을 72℃에서 3분간 실시하였다. PCR 산물은 0.
- PCR 반응은 95℃에서 1분간 predenaturation 반응을 거친 후 증폭반응 (94℃에서 50초, 57 C 에서 50초, 72℃에서 1분간 반응)을 30회 진행하였고 최종 신장반응을 72℃에서 3분간 실시하였다. PCR 산물은 0.5 ㎍/mL EtBr이 포함된 1 % agarose gE에서 전기영동하여 UV하에서 확인하였다
- 동결건조된 시료로부터 Tanaka 등(1999)의 방법을 변형하여 tocopherol을 추출하였다. Tocopherol의 HPLC 분석은 Waters HPLC System 626에 p-porasil (Waters, USA) 컬럼, 형광검출기 (Waters 474)를 부착하여 실시하였으며 n-hexane과 iso-propanol (98:2) 혼합액을 용리액 (유속 1.0 rnl/min)으로 사용하였다. 추출시료 20㎕ 중의tocopherole 형광검출기 (excitation 295 nm, emission 325 nm) 를 이용하여 검출하였다 (Abdollahi et al.
- 애기장대 γ-TMT 유전자의 삽입이 확인된 상추 형질전환 식물체의 생엽 1 g을 채취하여 액체질소에서 급속냉동하여 동결건조하였다. 동결건조된 시료로부터 Tanaka 등(1999)의 방법을 변형하여 tocopherol을 추출하였다. Tocopherol의 HPLC 분석은 Waters HPLC System 626에 p-porasil (Waters, USA) 컬럼, 형광검출기 (Waters 474)를 부착하여 실시하였으며 n-hexane과 iso-propanol (98:2) 혼합액을 용리액 (유속 1.
- 5 mg/L BA가 첨가된 선발배지에 옮겨 23℃ 암상태에서 7일간 배양한 후 연속조명으로 명배양하여 형질전환체를 선발하였다. 분화된 신초는 50 mg/L kanamycin과 250 mg/L carbenicillin이 첨가된 MS 기본배지에서 뿌리를 유도하였고, 얻어진 식물체를 pot에 이식하여 온실에서 순화시킨 후 특성검정을 실시하였다.
- 선발된 형질전환 식물체내 Arabidopsis /-TMT 유전자 삽입 여부를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. Hong 등 (1993)의 방법에 따라 형질전환 상추잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다.
- 애기장대 γ-TMT 유전자의 삽입이 확인된 상추 형질전환 식물체의 생엽 1 g을 채취하여 액체질소에서 급속냉동하여 동결건조하였다. 동결건조된 시료로부터 Tanaka 등(1999)의 방법을 변형하여 tocopherol을 추출하였다.
- PCR 분석을 통해 Arahidopsis /-TMT 유전자 삽.입이 확인 된 상추 형질전환 식물체를 대상으로 Rogerse- Bendich (1988)의 방법을 변형하여 DNA를 추출하였다 추출한 DNA 10 ㎍을 pBI-TMT 제 작에 사용한 제한효소인 Sma I과 Sac I 으로 2중 소화시킨 다음 0.8% agarose gel에서 전기영동하여capillary transfer 방법 (Southern 1975)으로 nylon membrane 에 전이시켰다. 탐침의 표지는 Dig-High Prime Labeling kit (Boenringer Mannheim, GermanyX 이용하여 실시였으며, Dig Nucleic Acid Detection kit (Boenringer Mannheim,Germany)를 이용하여 Southern analysis를 수행하였다.
- 잎상추 품종 (Lactuca sativa L.)인 흥농종묘 청치마 상추 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지한 후, 2% sodium hypochlorite 용액에 15분간 침지하고 멸균수로 4회 수세하여 표면소독을 실시하였다. 표면소독한 종자를 3% sucrose와 0.
- Agrobacterium 배양액의 OD600이 0.6일 때 배양액을 MS 기본 액체배지에 20배 희석하였고 희석액을 이용하여 1 cn? 크기의 자엽절편을 10분간 접종하였다. Agrobacterium을 접종한 자엽절편은 0.
- 8% agarose gel에서 전기영동하여capillary transfer 방법 (Southern 1975)으로 nylon membrane 에 전이시켰다. 탐침의 표지는 Dig-High Prime Labeling kit (Boenringer Mannheim, GermanyX 이용하여 실시였으며, Dig Nucleic Acid Detection kit (Boenringer Mannheim,Germany)를 이용하여 Southern analysis를 수행하였다.
- )인 흥농종묘 청치마 상추 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지한 후, 2% sodium hypochlorite 용액에 15분간 침지하고 멸균수로 4회 수세하여 표면소독을 실시하였다. 표면소독한 종자를 3% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에 파종하고 25± 1℃, 16시간 일장하에서 7~10일간 배양하여 얻은 자엽을 형질전환 재료로 이용하였다.
대상 데이터
- 1993; Brigh and Dyer 1959). Tocopherol 표준 물질은 Merck사로부터 구입하 여 10 ng/㎕ 희석하여 사용하였다.
- 겨울 상추 품종인 청치마 상추의 자엽조직을 /-TMT 유전자가 도입된 A. tumefaciens LBA 4404와 공동배양한 후, 50mg/L kanamycin, 500 mg/L carbenicillin, 0.1 mg/L NAA,0.5 mg/L BA가 첨가된 MS 재분화 배지에 옮겨 약 4주 배양하여 재분화된 신초를 얻었다. 재분화된 신초를 50 mg/Lkanamycin, 250 mg/L carbenicillin0] 포함된 MS 기본 배지에 옮겨 발근된 소식물체를 얻었다.
- 실험에 사용된 XTMT 유전자는 Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio State Univ. USA)로부터 분양받아 binary vector y pBI 121에 재조합(pBI-TMT) 하여(Figure1) freezing-thawing 방법을 이용하여 A. tumefaciens LBA 4404에 도입하였다 (Anetal. 1988).
- 0 rnl/min)으로 사용하였다. 추출시료 20㎕ 중의tocopherole 형광검출기 (excitation 295 nm, emission 325 nm) 를 이용하여 검출하였다 (Abdollahi et al. 1993; Brigh and Dyer 1959). Tocopherol 표준 물질은 Merck사로부터 구입하 여 10 ng/㎕ 희석하여 사용하였다.
이론/모형
- 선발된 형질전환 식물체내 Arabidopsis /-TMT 유전자 삽입 여부를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. Hong 등 (1993)의 방법에 따라 형질전환 상추잎으로부터 genomic DNA를 추출하였다. 1070 bp 단편이 증폭되도록 제작한Arabidopsis Z-TMT 유전자 특이적인 정 방향 primer (5'- GAATTCATGAAAGCAACTCTAGC-3') 와 역방향 primer (5' -TAATCGATTAGACTTAGAGTGGCTTC-3')를 사용하여 PCR을 실시하였다.
성능/효과
- PCR 분석을 통해 유전자의 삽입이 확인된 식물체 중 3개의 식물체와 형질전환하지 않은 식물체로부터 genomic DNA를 추출하여 I과 Sac I 제한효소로 2중 소화시킨 후 애기장대 /-TMT probe를 이용하여 Southern 분석을 실시한 결과 형질전환된 3개의 식물체 모두에서 형질전환시킨 유전자와 동일한 크기인 약 1.5 kb의 단편이 검출되었으나 대조 식물체에서는 단편이 검출되지 않았다 (Figure 3B). 이것은 선발된 상추 형질전환 식물체에 외래 유전자인 애기장 대 γ-TMT가 안정적으로 도입되었음을 나타내주는 결과이다.
- Agrobacterium과 공동배양한 상추 자엽의 절단면으로부터 배양 2주 후 callus가 형성되기 시작하고, 담황색 callus로부터 신초가 분화되었으나, 형질전환시키지 않은 자엽은 고사하였다 (Figure 2A). 배양 4주 후 대부분의 자엽 절편체로부터 callus가 유도되었으며 신초 형성률은 약 78%로 나타났으며. 재분화된 신초를 50 mg/L kanamycin이 첨가된 MS 기본 배 지에 옮겨 발근을 유도하였다.
- 재분화된 신초를 50 mg/Lkanamycin, 250 mg/L carbenicillin0] 포함된 MS 기본 배지에 옮겨 발근된 소식물체를 얻었다. 선발된 형질전환 식물체의 genomic DNA에 대한 PCR 분석과 Southern 분석을 수행하여 애기장대 /-TMT 유전자 특이적 DNA 단편이 상추의 genomic DNA 내에 삽입되었음을 확인하였다 선발된 상추 형질전환체 잎의 Of-tocopherol/7-tocopherol 함량 비율이 대조 식물체에 비하여 약 4배 증가하여 도입된 γ-TMT 유전자가 안정적으로 발현함을 나타내었다.
- 1070 bp 단편이 증폭되도록 제작한Arabidopsis Z-TMT 유전자 특이적인 정 방향 primer (5'- GAATTCATGAAAGCAACTCTAGC-3') 와 역방향 primer (5' -TAATCGATTAGACTTAGAGTGGCTTC-3')를 사용하여 PCR을 실시하였다. 최종 25 ㎕의 PCR 반응액 조성은10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 1.5 mM MgCh, 200 nM primer, 200 pM dNTP, 주형 DNA 10 ng 그리고 Tag polymerase 1 unit이었다. PCR 반응은 95℃에서 1분간 predenaturation 반응을 거친 후 증폭반응 (94℃에서 50초, 57 C 에서 50초, 72℃에서 1분간 반응)을 30회 진행하였고 최종 신장반응을 72℃에서 3분간 실시하였다.
- 형질전환체로 추정되는 상추 식물체를 대상으로 애기장대 γ-TMT 유전자 특이적 primer쌍을 이용하여 PCR을 수행한 결과 애기장대 /-TMT 유전자가 재조합된 binary vector (pBI-TMT)를 이용하여 형질전환한 식물체의 genomic DNA 에서는 1,070 bp 크기의 DNA 단편이 증폭되었다 (Figure 3A). 그러나 Agrobacteriiun과 공동배양하지 않고 재분화된 식물체의 genomic DNA에서는 어떤 DNA 단편도 증폭되지 않았다.
후속연구
- 그러나 생식할 수 있고 많은 양이 소비되고 있으므로 토코페롤 섭취에 유리하다. 따라서 a-tocopherol 함량이 증대된 상추의 개발은 농산물의 부가가치 증대 및 국민보건 향상에 크게 기여할 수 있을 것이다.
- 그러나X-TMT 유전자의 발현에 의해 X-tocopherol 의 감소량만큼 a- tocopherol 함량이 증가하였고 종자 내의 tocopherol 전체 함량은 변화되지 않았다 (Shintani and DellaPenna 1998). 본 실험에서 얻은 형질전환 상추1 계통은 a-tocopherol 대 Y- tocopherol 함량 비율이 대조 상추와 비교하여 약 4배 증가하였으며 Shintani와 DellaPenna의 결과와는 상이하게 전체 함량도 증가하였는데 (Table 1), 이에 대하여는 계속적인 연 구 검토가 필요하다고 생각된다.
- 본 연구를 통하여 확보한 형질전환체에 대한 후대 검정 등의 과정을 통하여 a-tocopherol 성분이 다량 함유된 상추의 개발이 가능하다고 사료되며, X-tocopherol의 함량이 많은 콩, 참깨, 들깨 그리고 유채 등의 유료작물에 대한 X-TMT 유전자형질전환을 통해 a-tocopherol의 함량이 증가된 품종 개발이 가능하리라고 생각된다.
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