[논문]Apoptosis 관련 Bcl-2유전자의 도입을 통한 곰팡이 저항성 형질전환 상추의 육성

서경순; 민병환

doi:10.5010/jpb.2011.38.3.209

Apoptosis 관련 Bcl-2유전자의 도입을 통한 곰팡이 저항성 형질전환 상추의 육성
Fungal pathogen protection in transgenic lettuce by expression of a apoptosis related Bcl-2 gene 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.38 no.3, 2011년, pp.209 - 214

서경순 (경북대학교 생태환경대학 생태환경시스템학부 식물자원환경) , 민병환 (경북대학교 생태환경대학 생태환경시스템학부 식물자원환경)

초록
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본 실험에서는 상추 연산홍에 apoptosis 관련 유전자인 Bcl-2 유전자를 도입하여 내병성 상추의 육성을 하기 위한 목적으로 형질전환을 수행하였다. 상추의 자엽조직을 NPTII-35S Promoter와 Bcl-2 유전자가 삽입된 Agrobacterium GV 3101과 공동배양 한 후 0.1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP, 100 mg/L Kanamycin, 300 mg/L Lilacillin이 첨가된 MS 배지에서 식물체가 유기되었다. Kanamycin 내성을 가진 식물체들을 PCR, Southern blot 분석을 통해 Bcl-2 유전자가 안정적으로 식물체 genome 안에 삽입되었음을 확인하였다. 100개의 형질전환식물체가 확인되었으며 T1식물체를 채종하였다. T1 종자를 파종하여 Sclerotinia sclerotiorum. 균주를 접종하여 내병성 검정을 실시하였고 그 중 2개의 line에서 내병성을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 인간의 apoptosis에 관련하는 유전자가 식물체 내에서 안정된 발현을 통하여 내병성을 증가시켰음을 밝혔다.

Abstract ▼ AI-Helper

Transgenic lettuce plants were successfully obtained from hypocotyl explants inoculated with Agrobacterium tumefaciens, which harbored a binary vector plasmid with Bcl-2 gene, related to apoptosis. After culture and selection on MS medium a number of kanamycin-resistant plantlets were regenerated. Polymerase chain reaction, Southern blot analysis and Northern blot analysis were used to identify and characterize the transgenic plants with the integrated Bcl-2 gene. Over 100 transgenic plants have been established in soil and flowered in the greenhouse. T1 progeny of 100 transgenic lettuce inbred lines were inoculated with Sclerotinia sclerotiorum. Expression of the Bcl-2 peptide in transgenic lettuce plants provides high levels of field resistance against Sclerotinia sclerotiorum, causal agent of the agronomically important fungal disease of lettuce.

AI 본문요약
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문제 정의

본 실험은 Agrobacterium을 이용한 형질전환을 통하여 내병성 형질을 가진 상추의 육성을 목적으로 하였다. 내병성 상추의 개발을 위하여 apoptosis에 관련하는 유전자인 Bcl-2유전자를 상추에 형질전환하였으며 유전자가 도입된 상추에 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum)을 접종하여 저항성을 나타내었기에 보고하는 바이다.
본 실험에서는 상추 연산홍에 apoptosis 관련 유전자인 Bcl-2유전자를 도입하여 내병성 상추의 육성을 하기 위한 목적으로 형질전환을 수행하였다. 상추의 자엽조직을 NPTII35S Promoter와 Bcl-2 유전자가 삽입된 Agrobacterium GV 3101과 공동배양 한 후 0.
2004). 본 실험은 Agrobacterium을 이용한 형질전환을 통하여 내병성 형질을 가진 상추의 육성을 목적으로 하였다. 내병성 상추의 개발을 위하여 apoptosis에 관련하는 유전자인 Bcl-2유전자를 상추에 형질전환하였으며 유전자가 도입된 상추에 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum)을 접종하여 저항성을 나타내었기에 보고하는 바이다.
3B). 이러한 신초들은 4주정도 지난 후에 자엽 절편체와 분리하여 다시 선발배지에 계대배양을 해주어 확실한 항생제 내성을 가진 식물체들을 선발하고자 하였다(Fig. 3C). 그리고 발근배지에 kanamycin이 첨가되는 경우는 뿌리의 형성이 어려우므로 재분화 배지에 비해 발근 배지의 kanamycin의 양을 줄이는 것이 발근에 효과적이라는 보고 (Lyu, 등2001; Eliseu 등 1994: Yang 등 1998)를 근거로 200 mg/L lilacillin과 50 mg/L의 kanamycin의 양으로 뿌리를 유기 시키거나, 아니면 선발배지에서 두 번에 걸친 계대배양으로 선발되었다고 가정이 되는 식물체들은 200 mg/L lilacillin만 들어있는 배지에서 발근을 유도하였다 (Fig.

제안 방법

PCR 검정된 형질전환 상추는 Southern blot 분석를 위해 온실에서 순화시킨 뒤, 잎 1 g정도를 채취하여 genomic DNA를 CTAB법으로 추출하여 DNA를 제한효소 BamH I으로 절단한 뒤 0.8％ agarose gel상에서 0.5 × TAE buffer 400 ml을 넣고 30 V로 12~16 시간 정도 전기영동을 시킨 후 gel을 0.25 N HCl 용액에 넣고 20~30분동안 천천히 흔들어 주었다.
최종 마지막 단계에서 72℃ 5분 동안 신장반응을 실시하였다. PCR반응이 끝난 뒤 생성된 PCR 산물은 0.8% agrose gel에서 전기영동 후, EtBr 염색을 하여 UV하에서 확인하였다. PCR 검정된 형질전환 상추는 Southern blot 분석를 위해 온실에서 순화시킨 뒤, 잎 1 g정도를 채취하여 genomic DNA를 CTAB법으로 추출하여 DNA를 제한효소 BamH I으로 절단한 뒤 0.
상추 자엽 절편체의 형질전환체 선발조건을 규명하기 위해서 kanamycin 내성정도를 검정하였다. 각기 다른 농도의 kanamycin (0. 30. 50. 70. 100. 150 mg/L)으로 처리한 재분화 배지에 상추 절편체를 치상하여 kanamycin 내성여부를 검정하였다.
8) 20 ml에 Agrobacterium pellet을 희석시켜 만든 Agrobacterium 현탁액에 발아 후 3일 된 상추의 엽병이 약간 포함된 자엽 절편체와 함께 15분간 공동배양 하였다. 공동배양배지 (MS 3%, 0.5 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, pH 5.2)에 치상하고 암 상태에서 48시간 배양하였다. 본 실험에 사용된 균주의 선발마커로 kanamycin 저항성 유전자가 삽입되어 있으므로 형질전환체 선발은 100 mg/L kanamycin과 Agrobacterium의 제거를 위하여 300 mg/L lilacillin (penicillin-sulfate sodium)이 함께 첨가되어있는 선발배지에 4주 정도 배양한 후, 동일한 배지에 다시 계대배양하여 형질전환체를 선발하였다.
T1 종자를 파종하여 Sclerotinia sclerotiorum. 균주를 접종하여 내병성 검정을 실시하였고 그 중 2개의 line에서 내병성을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 인간의 apoptosis에 관련하는 유전자가 식물체 내에서 안정된 발현을 통하여 내병성을 증가시켰음을 밝혔다.
7 Kb의 Bcl-2 유전자 단편 밴드가 뚜렷하게 나타나 유전자가 정상적으로 상추의 genome 내에 도입되었음을 확인하였다 (결과 미제시). 또한 PCR 검정을 통하여 Bcl-2 유전자의 도입을 확인한 식물체의 genomic DNA를 분리한 후 pPTN 161벡터의 유일한 cutting site인 BamH I으로 절단하고 Bcl-2유전자를 probe로 Southern blot 검정을 수행하였다. 그림4에서 보는 바와 같이 예상하였던 4.
상추의 형질전환을 위하여 벡터의 EcoR I과 Nco I site에 TEV-leader를 클로닝하고 이어서 Nco I과 Xba I site에 Bcl-2유전자를 연결하였다. 마지막으로 CaMV 35S promoter의 조절하에 항생제 선발마커인 nptII 유전자를 클로닝하여 binary 벡터 pPTN161을 구축하였다. 구축된 binary벡터는 Agrobacterium tumefaciens 균주 GV3101에 도입하였으며 YEP medium (10 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 5 g/L NaCl, pH 7.
상추 genome 내로 Bcl-2 유전자의 도입을 확인하기 위해 먼저, 선발배지에서 살아남은 식물체와 정상적인 식물체의 genomic DNA를 추출하여 0.7 Kb의 Bcl-2 유전자 단편만이 증폭되도록 제조된 primer를 이용하여 PCR을 수행하여 형질전환 여부를 확인하였다. 반응결과 정상적인 식물체에서는 유전자 단편의 증폭이 전혀 이루어지지 않았고, kanamycin이 첨가된 선발배지에서 생존하여 유기된 식물체들은 예상크기인 0.
상추 자엽 절편체의 형질전환체 선발조건을 규명하기 위해서 kanamycin 내성정도를 검정하였다. 각기 다른 농도의 kanamycin (0.
7 kb 크기의 Bcl-2 유전자는 배재대학교 민병훈박사로부터 제공받아 사용하였다. 상추의 형질전환을 위하여 벡터의 EcoR I과 Nco I site에 TEV-leader를 클로닝하고 이어서 Nco I과 Xba I site에 Bcl-2유전자를 연결하였다. 마지막으로 CaMV 35S promoter의 조절하에 항생제 선발마커인 nptII 유전자를 클로닝하여 binary 벡터 pPTN161을 구축하였다.
7 정도까지 잘 자란 Agrobacterium 현탁액 20 ml을 원심분리시킨 뒤. 전처리 액체 배지 (MS 3%, 0.5 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, pH 5.8) 20 ml에 Agrobacterium pellet을 희석시켜 만든 Agrobacterium 현탁액에 발아 후 3일 된 상추의 엽병이 약간 포함된 자엽 절편체와 함께 15분간 공동배양 하였다. 공동배양배지 (MS 3%, 0.
실험에 사용한 식물체는 25℃, 16시간의 광조건하에서 온실에서 3주 정도 기른 후 접종실험을 수행하였다. 접종실험은 동일한 방법으로 3번의 반복실험을 하여 정확한 결과를 유도하였다.
형질전환상추에 대한 내병성 실험을 하기위하여 균핵병의 원인균인 Sclerotinia sclerotioru를 현탁배양하여 현탁액에 멸균된 귀리종자를 침전한 후 귀리종자를 대조구와 형질전환상추의 잎에 치상하여 접종하였다. 실험에 사용한 식물체는 25℃, 16시간의 광조건하에서 온실에서 3주 정도 기른 후 접종실험을 수행하였다.
형질전환이 확인된 20 line의 형질전환체로부터 T1종자를 채종하여 각 line별로 50개의 식물체를 파종하여 본엽이 5~6매 시기에 균핵병균을 접종하여 전체 1000개의 식물체로부터 저항성 line을 선발하였다. 접종 후 1주일이 경과한 후 총 20 line중 2개의 line (line 135, 151)에서 균핵병에 대한 강한 저항성을 보인 반면 (Fig.
형질전환체로 추정되는 식물체를 순화시켜 본엽이 2~4매 되었을 때 새로 나온 잎 100 mg을 채취하여 genomic DNA를 뽑아 Bcl-2 유전자 specific primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 반응조건 94℃에서 7분, 94℃ 1분, 55℃ 1분 그리고 72℃에서 1분 동안 35 cycle을 반복 실행하였다.

대상 데이터

Kanamycin 내성을 가진 식물체들을 PCR, Southern blot 분석을 통해 Bcl-2 유전자가 안정적으로 식물체 genome 안에 삽입되었음을 확인하였다. 100개의 형질전환식물체가 확인되었으며 T1식물체를 채종하였다. T1 종자를 파종하여 Sclerotinia sclerotiorum.
상추 자엽 절편체는 내병성을 증진시키는 Bcl-2 유전자와 표지유전자로써 kanamycin에 저항성이 있는 nptII gene을 포함하는 식물발현용 binary vector pPTN161을 가지는 Agrobacterium. tumefacience GV3101과 공동배양 한 후, 100 mg/L kanamycin과 300 mg/L lilacillin이 첨가된 선발배지에 치상하여 선발하였다. 배양 1-2주부터 자엽 끝부분에 callus가 형성되기 사작되었고 (Fig.
본 실험에 사용된 0.7 kb 크기의 Bcl-2 유전자는 배재대학교 민병훈박사로부터 제공받아 사용하였다. 상추의 형질전환을 위하여 벡터의 EcoR I과 Nco I site에 TEV-leader를 클로닝하고 이어서 Nco I과 Xba I site에 Bcl-2유전자를 연결하였다.
2)에 치상하고 암 상태에서 48시간 배양하였다. 본 실험에 사용된 균주의 선발마커로 kanamycin 저항성 유전자가 삽입되어 있으므로 형질전환체 선발은 100 mg/L kanamycin과 Agrobacterium의 제거를 위하여 300 mg/L lilacillin (penicillin-sulfate sodium)이 함께 첨가되어있는 선발배지에 4주 정도 배양한 후, 동일한 배지에 다시 계대배양하여 형질전환체를 선발하였다. 선발배지에서 살아남은 식물체들은 100 mg/L kanamycin, 200 mg/L lilacillin이 첨가된 배지에서 신장 시킨 뒤, 100 mg/L lilacillin이 첨가된 MS배지에서 발근을 유도하였다.
형질전환에 사용한 상추종자는 농우바이오 시판종인 연산홍 적축면 (Lactuca sativa L. cv. Yeonsanhong) 종자를 분양 받아 사용하였다. 종자는 70% 에탄올에 30초간 담근 후 2%의 sodium hypochlorite 용액에 15분간 소독을 하였다.

이론/모형

Northern blot hybridization을 위한 형질전환 상추 식물체의 어린잎으로부터 total RNA의 추출은 Logemann 등 (1987)의 방법에 준하여 하였으며 전기영동은 1.2% formaldehyde agarose gel상에서 수행하였고, Sambrook et al (1989)의 방법에 준하여 Bcl-2 cDNA의 0.7 kb절편을 32P-dCTP로 labeling하여 probe로 사용하였다. Hybridization은 50% formamide, 5 X SSC, 0.

성능/효과

4). Bcl-2유전자가 상추의 genome에 도입되어 발현되었음을 확인하기 위하여 m-RNA를 분리하여 Northern blot 분석을 수행해본 결과 대조구로 사용된 식물체에 band가 나타나지 않는데 비해 형질전환식물체는 모든 lane에 0.7kb 크기의 band가 확인되었다 (Fig. 5). 형질전환이 확인된 상추는 순화과정을 통하여 정상적으로 생육하였다.
5 mg/L BAP, 100 mg/L Kanamycin, 300 mg/L Lilacillin이 첨가된 MS 배지에서 식물체가 유기되었다. Kanamycin 내성을 가진 식물체들을 PCR, Southern blot 분석을 통해 Bcl-2 유전자가 안정적으로 식물체 genome 안에 삽입되었음을 확인하였다. 100개의 형질전환식물체가 확인되었으며 T1식물체를 채종하였다.
2001). 기존의 단일유전자의 도입을 통한 내병성 및 내재해성 작물의 육성은 결과적으로 한계점에 봉착하고 있으며 내병성의 경우 바이러스병에 대해 coat protein 유전자를 도입한 경우에만 저항성을 나타내었으나 이 경우에도 세대가 진전될수록 저항성의 정도가 불안정하게 나타났고, 특히 곰팡이병의 경우에는 단일유전자의 도입으로 내병성작물을 육종하는 것은 지금까지의 경험으로 비추어 볼 때 어려운 것으로 사료 된다. 본 실험에서 사용된 Bcl-2 family에 속하는 유전자는 apoptosis의 조절에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다 (Dickman et al.
0kb 이상의 크기를 가진 1개 또는 2개의 밴드가 강하게 나타났다. 따라서 Bcl-2 유전자가 genome내 안정적으로 도입되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 4). Bcl-2유전자가 상추의 genome에 도입되어 발현되었음을 확인하기 위하여 m-RNA를 분리하여 Northern blot 분석을 수행해본 결과 대조구로 사용된 식물체에 band가 나타나지 않는데 비해 형질전환식물체는 모든 lane에 0.
7 Kb의 Bcl-2 유전자 단편만이 증폭되도록 제조된 primer를 이용하여 PCR을 수행하여 형질전환 여부를 확인하였다. 반응결과 정상적인 식물체에서는 유전자 단편의 증폭이 전혀 이루어지지 않았고, kanamycin이 첨가된 선발배지에서 생존하여 유기된 식물체들은 예상크기인 0.7 Kb의 Bcl-2 유전자 단편 밴드가 뚜렷하게 나타나 유전자가 정상적으로 상추의 genome 내에 도입되었음을 확인하였다 (결과 미제시). 또한 PCR 검정을 통하여 Bcl-2 유전자의 도입을 확인한 식물체의 genomic DNA를 분리한 후 pPTN 161벡터의 유일한 cutting site인 BamH I으로 절단하고 Bcl-2유전자를 probe로 Southern blot 검정을 수행하였다.
3E). 상추의 형질전환율을 조사해본 결과 전체 3,828 절편체를 접종하여 식물체를 재분화시키고 PCR을 수행하여 96 식물체에서 유전자가 도입되었음을 확인하였으며 2.4%의 형질 전환율을 보였다 (Table 1). 이러한 형질전환율은 일반적으로 형질전환율이 어렵다고 보고된 오이 (0.
균주를 접종하여 내병성 검정을 실시하였고 그 중 2개의 line에서 내병성을 확인하였다. 이러한 결과를 통하여 인간의 apoptosis에 관련하는 유전자가 식물체 내에서 안정된 발현을 통하여 내병성을 증가시켰음을 밝혔다.
항생제 선발조건은 자엽 절편체를 재분화배지에 kanamycin 농도별 (0, 30, 50, 70, 100, 150 mg/L) 로 처리하여 4주 후에 생존여부를 조사한 결과, 70 mg/L의 농도에서 고사되는 절편체가 관찰되었다. 100 mg/L와150 mg/L 농도에서는 절편체가 대부분 고사하었다 (Fig.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	식물에서 과민뱐응과 연관된 apoptosis 유전자의 특징은 무엇인가?	식물에서는 megagametogenesis에서 4개의 megaspores 중에 3개가 소멸되는 현상이나, 종자가 발아하는 과정 중에 내배유의 소멸, Monstera deliciosa의 잎의 부분적인 소멸, 조직 내에 형성된 공동세포의 형성 등 이다. 또한 과민뱐응과 연관된 apoptosis 유전자는 병균에 의하여 세포가 감염되었을 때 즉각 반응하여 세포 스스로가 병이 감염된 세포를 국부적으로 죽임으로써 병원균에게 공급되는 영양분을 차단하게 되어 병균은 죽고 식물은 그 병에 대한 저항성을 갖게 한다 (McLellan et al. 2009; Hofius et al.
	과민반응 (hypersensitive response)과 관련된 apoptosis 유전자의 예시는 무엇이 있는가?	과민반응 (hypersensitive response)과 관련된 apoptosis 유전자는 빠르게 발현되고 조직을 분해하는 것이 아니라 용해시키는 것이다. 예를 들면 올챙이 꼬리의 소실이나, 포유동물의 융합된 손의 조직을 용해시켜 손가락을 분리시키는 것 등이다. 식물에서는 megagametogenesis에서 4개의 megaspores 중에 3개가 소멸되는 현상이나, 종자가 발아하는 과정 중에 내배유의 소멸, Monstera deliciosa의 잎의 부분적인 소멸, 조직 내에 형성된 공동세포의 형성 등 이다. 또한 과민뱐응과 연관된 apoptosis 유전자는 병균에 의하여 세포가 감염되었을 때 즉각 반응하여 세포 스스로가 병이 감염된 세포를 국부적으로 죽임으로써 병원균에게 공급되는 영양분을 차단하게 되어 병균은 죽고 식물은 그 병에 대한 저항성을 갖게 한다 (McLellan et al.
	Eukaryotic organism의 특징은 무엇인가?	Eukaryotic organism은 biotic 또는 abiotic stress에 의해서 세포가 죽기도 하지만 식물이나 동물 모두 정상적으로 생장하고 발육하기 위해서는 일부의 세포가 필수적으로 죽어야 한다. 이와 같은 세포의 죽음이 어떤 mechanism에 의하여 유기되고 제어되는 것을 programmed cell death 또는 apoptosis라고도 한다 (Dickman et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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