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문제 정의
- 본 연구에서는 만성적인 암 환자를 위하여 서방성 미립 구의 제제화에 있어서 국소 부위에서 초기 약물의 burst없이 서서히 약물이 zero-order로 방출할 수 있는 미립구를 제조하는데 이러한 생분해성 고분자를 합성하고 마취제인 펜타닐 베이스를 함유한 PLGA 미립구를 제조하고자 하였다. 중합된 PLGA 생분해성 고분자에 펜타닐 베이스를 함유한 미립 구의 제조 방법으로 0/W 유화 용매 증발법을 사용하였다.
제안 방법
- 또한 미립구의 단면도를 위한 샘플의 제조는 적당한 양의 미립구를 취해 5% 정도의 glycerin을 함유한 30% gelatin용액 속에 넣고 24시간 동안 진공 건조하여 수술용 칼날로 1mm정도로 잘라서 관찰하였다.25 미립구의 크기 분포도는 기준 scale과 비교하여 결정하였다.
- PLGA 의 합성 및 특성 결정. L-lactide 와 glycolide의 몰비 를 75:25로 하여 개 환 중합으로 PLGA를 공중합하여 합성을 하였다. 혼합물 30 g을 Pyrex중합관 (0: 50 mm, 길이 : 50 cm)에 넣은 후, 촉매는 toluene 에 용해된 stannous octoate 를 150 ppm을 취하여 중합관에 가하고 분당 100회 회전으로 교반하였다.
- 제조한 미립구의 크기와 형태를 관찰하기 위하여 SEM(S-2250N, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였다. SEM 사진을 찍기 위하여 양면테이프로 붙인 금속판 위에 샘플을 고정시킨 후 플라즈마 스퍼터 (Emscope, Model SC 500K, UK)를 이용하여 아르곤 분위기 하에서 1분 30초 동안 코팅을 하였다. 또한 미립구의 단면도를 위한 샘플의 제조는 적당한 양의 미립구를 취해 5% 정도의 glycerin을 함유한 30% gelatin용액 속에 넣고 24시간 동안 진공 건조하여 수술용 칼날로 1mm정도로 잘라서 관찰하였다.
- SEM 사진을 찍기 위하여 양면테이프로 붙인 금속판 위에 샘플을 고정시킨 후 플라즈마 스퍼터 (Emscope, Model SC 500K, UK)를 이용하여 아르곤 분위기 하에서 1분 30초 동안 코팅을 하였다. 또한 미립구의 단면도를 위한 샘플의 제조는 적당한 양의 미립구를 취해 5% 정도의 glycerin을 함유한 30% gelatin용액 속에 넣고 24시간 동안 진공 건조하여 수술용 칼날로 1mm정도로 잘라서 관찰하였다.25 미립구의 크기 분포도는 기준 scale과 비교하여 결정하였다.
- 제조된 미립구의 생체외에서의 방출 거동을 조사하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)로 측정하였다. 또한 미립구의 물리화학적 성질을 X선 회절기 (X-ray diffraction, XRD)와 시차 주사 열량계 (differential scanning calorimeter, DSC)로 관찰하였다.
- 포접율 및 생체외 방출 분석. 미 립구의 약둘 함량 분석을 하기 위하여 먼저 일정양의 미립구를 메틸렌 클로라이드에 넣어 고분자를 녹이고 (0.04 g 미 립구/3mL MC) pH 7.4인 phosphate buffered saline (PBS) 용액을 lOmL를 첨가하여 약물을 추출하였다. 상등액에 있는 약물의 양은 HPLC (SD-200, Dynamax®, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 결정화 거동 및 열분석. 미립구 제조시 약물의 입자의 결정 형태의 변화를 관찰하기 위해서 XRD (D/ Max-ⅢB, Rigaku, Japan)를 사용하여 5°/min의 속도로 하여 2 0의 값을 0~80°의 범위에서 측정하였고 미립구의 열적성질의 변화를 DSC(TA Instrument DSC 3100, Dupont, USA)를 이용하여 10 ℃/ min의 속도로 승온하여 -20에서 150 ℃까지 측정하였다.
- 4인 phosphate buffered saline (PBS) 용액을 lOmL를 첨가하여 약물을 추출하였다. 상등액에 있는 약물의 양은 HPLC (SD-200, Dynamax®, USA)를 사용하여 측정하였다. 생성된 미립 구로부터의 약물 방출을 관찰하기 위해서 PBS 용액에 미립 구를 넣어 (0.
- 상등액에 있는 약물의 양은 HPLC (SD-200, Dynamax®, USA)를 사용하여 측정하였다. 생성된 미립 구로부터의 약물 방출을 관찰하기 위해서 PBS 용액에 미립 구를 넣어 (0.2 g 미 립구/10 mL PBS) 현탁하고 37 ℃ 로 유지하면서 shake를 할 수 있는 항온조 속에 넣고 일정한 기간별로 샘플링하여 포접율 측정과 마찬가지로 분석하였으며 채취한 양만큼 새로운 PBS 용액을 넣었다. 본 실험은 측정시 각각 3번으로 하여 평균값을 본 실험의 데이터로 사용하였다.
- 이후 질소로 치환시키고 중합온도는 165 ℃에서 반응을 수행하였으며 중합시간으로 분자량을 조절하였다. 실리콘 oil bath를 사용하여 온도 조절하였다. PLGA 공중합체는 MC를 양용매로 과량의 메틸알콜을 난 용매로 2회 정제하였으며 진공 건조하여 사용 전까지 진공오븐에 보관하였다.
- 중합된 PLGA 생분해성 고분자에 펜타닐 베이스를 함유한 미립 구의 제조 방법으로 0/W 유화 용매 증발법을 사용하였다. 유화제의 종류, 고분자의 농도, PLGA의 분자량, 약물의 초기 loading양 등의 제조 조건을 달리 하였으며 생성된 미립구의 크기, 평균 크기, 크기 분포, 표면 상태와 단면도 등을 관찰하기 위해 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 관찰하였다. 제조된 미립구의 생체외에서의 방출 거동을 조사하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)로 측정하였다.
- 유화제의 종류, 고분자의 농도, PLGA의 분자량, 약물의 초기 loading양 등의 제조 조건을 달리 하였으며 생성된 미립구의 크기, 평균 크기, 크기 분포, 표면 상태와 단면도 등을 관찰하기 위해 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 관찰하였다. 제조된 미립구의 생체외에서의 방출 거동을 조사하기 위하여 고성능 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC)로 측정하였다. 또한 미립구의 물리화학적 성질을 X선 회절기 (X-ray diffraction, XRD)와 시차 주사 열량계 (differential scanning calorimeter, DSC)로 관찰하였다.
- 미립구의 형태관찰. 제조한 미립구의 크기와 형태를 관찰하기 위하여 SEM(S-2250N, Hitachi, Japan)을 사용하여 관찰하였다. SEM 사진을 찍기 위하여 양면테이프로 붙인 금속판 위에 샘플을 고정시킨 후 플라즈마 스퍼터 (Emscope, Model SC 500K, UK)를 이용하여 아르곤 분위기 하에서 1분 30초 동안 코팅을 하였다.
- 비가 75 : 25인 것을 사용하였다. 초기 약물 loading양(5, 10, 및 20%), PLGA의 분자량별, PLGA의 MC 내의 농도별 (5.7, 및 10%), 또한 유화제의 종류별 (gelatin, PVA, Tween 40)로 각각 변수를 주어 일반적인 0/W 용매 증발법을 이용하여 미립 구를 제조하였으며 제조 방법은 다음과 같이 수행하였다24먼저 PLGA와 FB를 메틸렌 클로라이드에 녹인 후에 유화제가 함유된 수용액 상에 천천히 떨어뜨린 후 5시간 동안 교반시키면서 용매를 증발시켰다. 원심분리기를 사용하여 3500 rpm으로 10분간 원심 분리하여 미립구를 아래로 가라앉힌 후 상등액을 버리고 0.
- 포접율 및 생체외 방출 분석. 미 립구의 약둘 함량 분석을 하기 위하여 먼저 일정양의 미립구를 메틸렌 클로라이드에 넣어 고분자를 녹이고 (0.
- 합성 고분자중에서 유일하게 FDA의 승인을 받은글리콜라이드와 락타이드를 선택하여 공중합하여 생분해성 고분자를 합성하였다. 이러한 생분해성 고분자인 PLGA를 매트릭스로 하여 펜타닐을 함유한 미립 구를 제조하였는데 본 실험을 통하여 얻어진 PLGA의 중합과정, 미립구의 제조 기술, 미립 구의 방출 거동의 기본 데이터 등은 본 실험에서 적용된 약물뿐만 아니라 타 약물에도 적용될 것으로 예상되며 그에 따른 결론은 다음과 같다.
대상 데이터
- 본 중합과정을 전보에 상세히 나타내었다.2" 중합된 PLGA의 분자량을 측정하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피 (gel permeation chromatography, GPC) 를 측정하였는데 사용한 기종은 Waters사의 200 series이였으며 6 μm Styragel®이 충전된 컬럼의 다공도는 105, 104, 103 및 500 A 이었다. 사용된 용매는 테트라하이드로퓨란 (THF)이었으며 온도, 유량 및 측정체적은 각각 30 ℃, 1 mL/min 및 15 ℃이었다.
- 2 g 미 립구/10 mL PBS) 현탁하고 37 ℃ 로 유지하면서 shake를 할 수 있는 항온조 속에 넣고 일정한 기간별로 샘플링하여 포접율 측정과 마찬가지로 분석하였으며 채취한 양만큼 새로운 PBS 용액을 넣었다. 본 실험은 측정시 각각 3번으로 하여 평균값을 본 실험의 데이터로 사용하였다. HPLC 분석을 위해 사용되어진 조건은 다음과 같다: 26,27 Column, Waters jtz-Bondapak® C18 (3, 9 x 300 mm); detector, UV 205 nm ; flow rate, 1 mL/min; mobile phase, 50% acetonitrille, 50% 0.
- 펜타닐이 함유된 미립구의 특성. 본 연구에서 사용된 펜타닐 베이스의 화학적 구조는 Figure 1과 같으며 물에 약간 녹는 성질을 가지고 있다. 생분해성 PLGA 고분자를 매트릭스로 하여 FB가 함유한 미립 구를 제조한 조건 및 고분자의 농도, 유화제의 종류, 초기 약물 loading 양, 그리고 고분자의 분자량 등을 달리하여 제조되어진 미립구의 크기, 포접율 등을 Table 1에 나타내었다.
- 사용된 용매는 테트라하이드로퓨란 (THF)이었으며 온도, 유량 및 측정체적은 각각 30 ℃, 1 mL/min 및 15 ℃이었다. 분자량을 보정하기 위하여 단분산성의 폴리스티렌 표준 물질을 사용하였다. 중합 정제된 PLGA의 분자량 및 분자량 분포는 20000-90000 g/mole 및 1.
- 2" 중합된 PLGA의 분자량을 측정하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피 (gel permeation chromatography, GPC) 를 측정하였는데 사용한 기종은 Waters사의 200 series이였으며 6 μm Styragel®이 충전된 컬럼의 다공도는 105, 104, 103 및 500 A 이었다. 사용된 용매는 테트라하이드로퓨란 (THF)이었으며 온도, 유량 및 측정체적은 각각 30 ℃, 1 mL/min 및 15 ℃이었다. 분자량을 보정하기 위하여 단분산성의 폴리스티렌 표준 물질을 사용하였다.
- 펜타닐 베이스는 영국의 MacFaran Smith Limited사의 제품을 사용하였다. 톨루엔 (Junsei Chem. Co., Japan), 메틸렌 클로라이드 (MC, Tedia Japan), 아세토트릴 (덕산화학), gelatin (Junsei Chem. Co.), 폴리비닐알콜 (PVA, Junsei Chem. Co.), Tween 40 (Junsei Chem. Co.), 및 glycerin (Showa Chem. Inc.)은 정제하지 않고 그대로 사용하였다.
- (Japan)의 것을 정제하여 사용하였다. 펜타닐 베이스는 영국의 MacFaran Smith Limited사의 제품을 사용하였다. 톨루엔 (Junsei Chem.
- 펜타닐이 함유된 PLGA 미립구의 제조 중합된 생분해성 PLGA공중합체는 락타이드와 글리콜라이드의 비가 75 : 25인 것을 사용하였다. 초기 약물 loading양(5, 10, 및 20%), PLGA의 분자량별, PLGA의 MC 내의 농도별 (5.
- 8의 범위에 있었으며, 재연성은 실험오차 범위 안에서 양호하였다. 펜타닐이 함유한 미립구를 제조하기 위하여 합성된 PLGA중에서 분자량이 27000, 55000, 그리고 87000 g/mole을 사용하였다.
이론/모형
- 미립구를 제조하고자 하였다. 중합된 PLGA 생분해성 고분자에 펜타닐 베이스를 함유한 미립 구의 제조 방법으로 0/W 유화 용매 증발법을 사용하였다. 유화제의 종류, 고분자의 농도, PLGA의 분자량, 약물의 초기 loading양 등의 제조 조건을 달리 하였으며 생성된 미립구의 크기, 평균 크기, 크기 분포, 표면 상태와 단면도 등을 관찰하기 위해 주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 관찰하였다.
성능/효과
- 1. PLGA ( 락타이 드 :글리 콜라이 드 = 75: 25) 를합성하여 27000, 55000, 그리고 80000g /mole 인 분자량을 갖은 재현성이 있는 생분해성 고분자를 얻었다.
- 4. XRD와 DSC의 결과로부터 미립구의 제조에 있어서 용매의 사용으로 인한 약물의 결정성 감소를 확인하였으며 약물이 매트릭스인 고분자의 무정형의 영역에 포함돼 있음을 확인할 수 있어 초기 방출 없이 일정 기간 동안 약물 방출을 할 수가 있었다.
- PLGA의 분자량이 증가함에 따라 생체외 방출 속도를 줄일 수 있었으며 초기의 약물 loading이 적을수록 방출 속도는 낮았고 loading 이 많을수록 방출 속도가 빠름을 알 수 있었다. 고분자의 농도가 증가할수록 방출 속도를 줄일 수 있었다.
- 고분자와 약물의 중간부위에서 용융 온도의 전이가 일어남을 관찰할 수 있었다. XRD와 DSC 의 결과로부터 미립구의 제조시 용매의 사용으로 인한 약물의 결정성 감소와 약물의 결정성이 매트릭스인 고분자의 무정형의 영역에 포함하고 있어서 결정성이 감소됨을 알 수가 있었다.29
- Figure 10은 PLGA, FB, 그리고 미립구의 용융 온도를 나타낸 그림이다. 고분자와 약물의 중간부위에서 용융 온도의 전이가 일어남을 관찰할 수 있었다. XRD와 DSC 의 결과로부터 미립구의 제조시 용매의 사용으로 인한 약물의 결정성 감소와 약물의 결정성이 매트릭스인 고분자의 무정형의 영역에 포함하고 있어서 결정성이 감소됨을 알 수가 있었다.
- 나타내었다. 고분자의 농도가 5.7%로 제조된 미립 구의 방출 속도가 10%로 제조된 미립구보다 더 빠름을 알 수 있었다. 용매의 사용감소로 인한 고분자의 농도 증가는 분포상의 점도의 증가로 인해 일정한 교반 속도로 행해질 때 미립구의 크기가 커짐으로, 미립구의 크기 증가는 비 표면적이 작아지기 때문에 방출 속도가 낮아짐을 알 수 있었다.
- 빠름을 알 수 있었다. 고분자의 농도가 증가할수록 방출 속도를 줄일 수 있었다.
- 또한 물리적인 혼합물은 약물과 고분자가 같이 공존한 피크가 나왔지만 미립 구의 경우에는 결정영역이 보이지 않았고 무정형 형태로 측정되었다. 물리적인 혼합물보다는 미립구의무정형성이 증가됨을 알 수가 있었다. Figure 10은 PLGA, FB, 그리고 미립구의 용융 온도를 나타낸 그림이다.
- Figure 7, 8은 고분자의 분자량을 달리하여 제조된 미립구의 방출 거동을 나타낸 그래프이다. 분자량이 큰 분자량으로 제조된 미립구의 방출 속도가 느림을 알 수 있었다. 분자량이 커짐에 따라 분자량이 낮은 것보다는 PLGA의 소수성이 증가하여 수용액이 미립 구로의 젖음이나 확산되는 속도가 늦어져 방출 속도는 늦어지게 되는 것으로 생각된다.
- 생분해성 PLGA 고분자를 매트릭스로 하여 FB가 함유한 미립 구를 제조한 조건 및 고분자의 농도, 유화제의 종류, 초기 약물 loading 양, 그리고 고분자의 분자량 등을 달리하여 제조되어진 미립구의 크기, 포접율 등을 Table 1에 나타내었다. 약물의 포접율은 제조 조건에 따라서 5~60%의 범위로 나타났으며 고분자의 농도가 높은 미립구가 농도가 낮은 것보다 포접율이약간 좋게 나타났는데 10%의 고분자 농도로 제조된 미립 구는 5.7%로 제조된 것보다는 포접율이 다소 큼을 알 수 있었다 (FB-4와 FB-7, 그리고 FB-9와 FB-10). 이러한 경우는 고분자의 농도가 높을수록 분포상의 점도가 증가하여 분포상에 존재하는 약물이 액체상인 연속상으로 빠져나가려고 하는 것을 느리게함으로써 약물의 함량이 증가하는 것으로 사료된다.
- 이러한 경우는 고분자의 농도가 높을수록 분포상의 점도가 증가하여 분포상에 존재하는 약물이 액체상인 연속상으로 빠져나가려고 하는 것을 느리게함으로써 약물의 함량이 증가하는 것으로 사료된다. 연속상에 사용되어진 유화제의 종류를 달리하여 제조한 결과는 gelatin의 사용이 다른 유화제의 사용보다도 월등하게 좋게 나타났으며 다음으로 PVA, Tween 40의 순서로 나타났다 (FB-1, FB-2, 그리고 FB-3). 유화제를 gelatin으로 사용하여 제조되어진경우에는 PLGA의 분자량이 증가함에 따라 포접율이 감소하는 반면에 PVA는 분자량이 증가할수록 증가하였다 (FB-4, 5, 6 그리고 FB-10, 11, 12).
- 7%로 제조된 미립 구의 방출 속도가 10%로 제조된 미립구보다 더 빠름을 알 수 있었다. 용매의 사용감소로 인한 고분자의 농도 증가는 분포상의 점도의 증가로 인해 일정한 교반 속도로 행해질 때 미립구의 크기가 커짐으로, 미립구의 크기 증가는 비 표면적이 작아지기 때문에 방출 속도가 낮아짐을 알 수 있었다. Figure 7, 8은 고분자의 분자량을 달리하여 제조된 미립구의 방출 거동을 나타낸 그래프이다.
- 연속상에 사용되어진 유화제의 종류를 달리하여 제조한 결과는 gelatin의 사용이 다른 유화제의 사용보다도 월등하게 좋게 나타났으며 다음으로 PVA, Tween 40의 순서로 나타났다 (FB-1, FB-2, 그리고 FB-3). 유화제를 gelatin으로 사용하여 제조되어진경우에는 PLGA의 분자량이 증가함에 따라 포접율이 감소하는 반면에 PVA는 분자량이 증가할수록 증가하였다 (FB-4, 5, 6 그리고 FB-10, 11, 12).
- 유화 제의 종류에 따라 미립구 형태의 변화와 단면내부의 공극의 크기가 다름을 관찰할 수 있었다. 유화제의 농도를 일정하게 하고 유화제의 사용을 다양하게 하여 미립 구를 제조한 결과 gelatin과 PVA로 제조된 경우에 매끈한 구형의 미립구를 얻을 수 있었고 미립 구의 크기 분포도가 좁았으며 Tween 40으로 제조된 경우에는 미립구의 엉김 현상과 크기 분포의 범위가 다른 유화제의 사용보다는 큼을 알 수가 있었다.28
- 제조 조건인 초기 약물 loading 양, 고분자의 분자량, 고분자의 농도, 유화제의 종류에 따른 포접율이 다른 미립구를 얻었다. 유화제인 gelatin 의사용이 약물의 포접율이 가장 좋음을 확인하였다. 미립 구는 10-150 /m의 크기 분포도를 갖고 있었으며 형태는 매끈하며 원형이었다.
- 분자량을 보정하기 위하여 단분산성의 폴리스티렌 표준 물질을 사용하였다. 중합 정제된 PLGA의 분자량 및 분자량 분포는 20000-90000 g/mole 및 1.2~ 1.8의 범위에 있었으며, 재연성은 실험오차 범위 안에서 양호하였다. 펜타닐이 함유한 미립구를 제조하기 위하여 합성된 PLGA중에서 분자량이 27000, 55000, 그리고 87000 g/mole을 사용하였다.
- Figure 3은 제조시 유화제의 종류에 따른 방출 거동을 나타낸 그래프이다. 초기 20% 약물 함유, PLGA 분자량 27000 g/mole, PLGA 농도가 5.7 %로 제조된 모든 미립구는 대략10일 정도까지 방출이 되었고 연속상에 유화제인 gelatin으로 제조된 미립구가 포접율이 가장 높아서 방출 속도는 다른 유화제의 사용보다는 빠르게 나타났다. Figure 4는 초기 약물 loading양에 따른 펜타닐을 함유한 미립구의 방출 거동을 나타낸 것이다.
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