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문제 정의
- 본 연구에서는 천연물을 이용하여 식중독세균의 증식을 억제시킬수 있는 천연 보존료의 개발을 위한 기초자료를 얻기위하여 솔잎과 녹차의 물과 에탄올 추출물로 서식중독세균에 대한 각 추출물의 항균활성을 조사하였다.
제안 방법
- 105~ 105cells/ml되게 접종하여 35℃에서 24시간 배양하였다. 솔잎과 녹차의 추출물 종류와 농도에 따른 각 식중독세균에 대한 항균활성은 배양액의 생균수 변화를 측정하였으며 이 결과로부터 각 추출물의 최소저해농도와 최소사멸농도를 구하였다. 아울러 솔잎과 녹차의 추출물과 보존료인 sodium benzoate로서 각 세균에 대한 생육저해환의크기를 비교하였다.
- 솔잎과 녹차의 추출물 종류와 농도에 따른 각 식중독세균에 대한 항균활성은 배양액의 생균수 변화를 측정하였으며 이 결과로부터 각 추출물의 최소저해농도와 최소사멸농도를 구하였다. 아울러 솔잎과 녹차의 추출물과 보존료인 sodium benzoate로서 각 세균에 대한 생육저해환의크기를 비교하였다.
- 솔잎 및 녹차 추출물은 물과 70% 에탄올 처리구로 나누어 제조하였다. 솔잎 추출물은 솔잎 중량의 10배의 물 혹은 70% 에탄올을 가한 후 70℃에서 3시간씪, 3회 환류추출하였다.
- 전배양 및 본배양을 위한 액체배지는 tryptic soy broth(TSB, Difco)를 121℃에서 15분간 멸균한후 솔잎과 녹차의 물 혹은 에탄올 추출물을 여과멸균하여 배지의 0~2%(w/v) 되게 첨가하였다. 생균수의 측정을 위한 고체 배지는 tryptic soy agar(TSA)를, 균액의 희석액으로는 0.
- 1 ml를 다시 TSB 10mZ에 접종하여 35℃에서 18~24시간 전배양하였다. 증식과 증식억제실험을 위하여 세균의 전배양액을 실험초기의 세균수가 10’~106 cells/mZ 되도록 각각의 추출물을 0~2%(w/v) 함유한 TSB에 접종하였다. 솔잎과 녹차의 물추출물과 에탄올 추출물의 각 세균에 대한 증식억제작용은 35℃의 incubator에서 24시간 배양한 배양액 mZ당의 colony forming unit(CFU/mZ)로 나타내었다.
- 추출물의 각 세균에 대한 최소저해 농도(minimum inhibitory concentration ; MIC)와 최저사멸농도(minimum bactericidal concentration ; MBC)는 35℃에서 24시간 배양한 배양액에 함유된 추출물의 농도와 생균수변화 그래프로부터 최초의 접종균수보다 증식이 인정되지 않는 최저농도를 MIC, 세균이 사멸한 최저 농도를 MBC로 하였다.
- 멸균하여 미리 건조시킨 한천 평판 배지에 각 세균의 24시간 배양액을 1/1,000 희석하여 0.1 ml를 평판도 말한 후, 솔잎 추출물, 녹차추출물, sodium benzoate의 1%와 2% 용액을 직경 6 mm의 paper disc에 30μl씩 주입하여 확산시킨 후 35℃에서 48시간 배양했을 때, 생육 저해 환의 크기를 비교하였다.
- 솔잎과 녹차의 물추출물과 에탄올추출물을 액체배지에 0~2%(w/v) 첨가하여 5종류의 식중독세균(Z&feria monocytogenes, Staphylococcus aureus 196E, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimuriimi)을 105~ 105cells/ml되게 접종하여 35℃에서 24시간 배양하였다. 솔잎과 녹차의 추출물 종류와 농도에 따른 각 식중독세균에 대한 항균활성은 배양액의 생균수 변화를 측정하였으며 이 결과로부터 각 추출물의 최소저해농도와 최소사멸농도를 구하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 솔잎은 경산시 점촌동의 야산에서 1998년 7월에 채취하여 물로 수세후 표면의 물기를 제거하여 사용하였으며, 녹차는 태평양화학의 덖음차를 1998년 3월에 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 시험균주는 식중독세균으로서 Gram양성균 2종류 (Listeria monocytogenes ATCC 7644, Staphylococcus aureus ATCC 13565)와 Gram 음성균 3종류(Aemmonas hydrophila ATCC 7965, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895, Salmonella typhimurium ATCC 13311)를 사용하였다.
데이터처리
- 솔잎과 녹차의 물추출물과 에탄올 추출물의 각 세균에 대한 증식억제작용은 35℃의 incubator에서 24시간 배양한 배양액 mZ당의 colony forming unit(CFU/mZ)로 나타내었다. 추출물의 종류별 첨가농도에 따른 증식억제실험은 2회 반복하여 실험한 값을 평균하였다.
성능/효과
- 0% 범위내에서 사멸시키는 강한 항균활성을 나타내었다. 솔잎과 녹차추출물은 특히 S. aureus와 A. hydrophila에 대하여 보존료(sodium benzoate)보다도 강한 항균활성을 나타내었다. 전체적인 항균력의 크기는 녹차 에탄올추출물 > 녹차 물추출물 > 솔잎 에탄올추출물>솔잎 물추출물의 순이었다.
- hydrophila에 대하여 보존료(sodium benzoate)보다도 강한 항균활성을 나타내었다. 전체적인 항균력의 크기는 녹차 에탄올추출물 > 녹차 물추출물 > 솔잎 에탄올추출물>솔잎 물추출물의 순이었다. 이 결과로 미루어 녹차추출물은 다양한 종류의 세균에 대하여 우수한 항균작용을 나타내는 천연 보존료로서의 활용가치가 있을 것으로 판단된다.
- 2×105 cells/m/ 되게 접종한 후 35℃에서 24시간 배양하였을 때 배양^의 생균수변화를 나타내었다. 대조구의 생균수는 2.5 ~ 3.2X10' cells/m/로서 4.4 log cycle 증가하였으며 솔잎 물추출물의 경우에는 0.5% 범위내에서는 생균수의 감소가 뚜렷하지 않았으나 0.5~ 1.0%에서 생균수 .가 급격히 감소하여 1%에서 대조구에 비하여 8 log cycle 정도의 차이를 나타내었고 1% 이상의 농도에서는 더 이상 생균수 감소를 나타내지 아니하였다.
- 가 급격히 감소하여 1%에서 대조구에 비하여 8 log cycle 정도의 차이를 나타내었고 1% 이상의 농도에서는 더 이상 생균수 감소를 나타내지 아니하였다. 솔잎 에탄올 추출물의 경우에는 0.3~1.0%에서 생균수가 급격히 감소하여 솔잎 물추출물의 생균수에 비하여 월등히 낮은 생균수로서 0.5%에서 다조구보다 5.2 log cycle의 차이를 나타내었으나 1% 이상의 농도에서는 솔잎 물 추출물의 경우와 비슷한 경향으로 더 이상 생균수 감소를 나타내지 아니하였다.
- 녹차 물추출물의 경우, 0.3~ 1.0%에서 생균수가 급격히 감소하여 1%에서는 대조구보다 5.8 log cycle 낮았으며 1% 이상의 농도에서는 생균수 감소가 완만하여 1%와 2% 간의 생균수 차이는 0.4 log cycle에 불과하였다. 녹차 에탄올추출물에서는 0~0.
- 4 log cycle에 불과하였다. 녹차 에탄올추출물에서는 0~0.5% 범위내에서 생균수 감소가 가장 급격하여 솔잎 물추출물의 생균수와 비슷한 경향을 나타내었으나 0.5%이상의 농도에서는 생균수 감소가 뚜렷하지 읺아서 0.5%와 2%간에는 생균수의 차이가 0.9 log cycle에 불과하였으며 잔존하는 생균수가 3 log cycle 이상이었다.
- 전체적으로 볼 때, 솔잎과 녹차 추출물의 L. monocytogenese 대한 증식억제 효과는 0.5% 이내의 저농도에서는 녹차 추출물이 솔잎 추출물보다 효과적이었다. 추출물 1% 이상의 농도에서는 솔잎 추출물이 녹차 추출물보다 억제효과가 컸으나 솔잎과 녹차 추출물 모두에서 L.
- 5% 이내의 저농도에서는 녹차 추출물이 솔잎 추출물보다 효과적이었다. 추출물 1% 이상의 농도에서는 솔잎 추출물이 녹차 추출물보다 억제효과가 컸으나 솔잎과 녹차 추출물 모두에서 L. monocytogenese 대한 증식억제 효과는 거의 일정 수준이 유지되었으며 세균의 사멸현상은 나타나지 않았다.
- 녹차추출물의 경우에는 솔잎 추출물에 비하여 저농도부터 생균수가 급격히 감소하여 물추출물의 경우에는 1.0%, 에탄올 추출물의 경우에는 0.5%에서 사멸하여 S. 에 대하여 항균활성은 대단히 우수하였다. 특히 S.
- 솔잎 물추출물의 경우에는 0~ 1%에서 생균수 감소가 완만하였고 1~2%에서 생균수의 감소가 빨랐던 반면에 솔잎 에탄올 추출물에서는 0~ 1%에서 생균수 감소가 빠르고 1~2%에서 생균수의 감소가 완만해지는 상반된 결과로서 1%에서 솔잎 에탄올추출물과 물추출물간에는 5.3 log cycle의 가장 큰 생균수 차이를 나타내었다.
- 녹차 추출물에서는 0~0.3%에서 생균수는 급격히 감소하여 대조구에 비하셔 물추출물에서는 5.75, 에탄올 추출물에서는 7.05 log cycle의 차이를 나타내었고, 그 이상의 농도에서도 생균수는 계속 감소하여 물추출물은 0.7%, 에탄올추출물은 0.5%에서 세균은 사멸하였다. 녹차 추출물의 A.
- 한편, 녹차추출물의 경우에는 물추출물에서 0.5% 이상의 농도에서 추출물의 농도에 비례하여 생균수가 감소하여 2%에서 사멸하였으며 에탄올 추출물에서는 0.5%까지는 생균수가 급격히 감소하였고 그 이상의 농도에서도 계속 생균수가 감소하여 1.5%에서 사멸하였다.
- 48 log cycle의 감소에 불과하였다. 녹차추출물에서는 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 0.3~0.7%에서 생균수의 감소가 컸으며 0.7% 이상의 농도에서도 생균수는 계속 감소하여 각각 2%와 L5%에서 사멸하였다.
- 솔잎 물추출물의 MIC는 Gram양성균에서 0.72~ 0.84%에서 억제효과를 나타내었으나 Gram음성균에서는 A. hydmphila는 1.58%에서 억제되었으나 E. coli와 S. typhimuriume 억제되지 않았다. 솔잎 에탄올추출물의 MIC는 솔잎 물추출물의 MIC보다 17~62% 낮았으며 E.
- typhimuriume- 억제되지 않았다. 녹차 주출물에서는 물 추출물에서 0.20-1.04%, 에탄올 추출물에서 0.18-0.46% 범위에서 시험한 5종류의 식중독세균 모두 억제되었다.
- 식중독세균의 사멸현상이 나타나지 아니하였다. 녹차 추출물에서는 L. monocytogenee: 제외한 모든 세균이 사멸되었으며, 녹차 물추출물에서 0.7~2.0%, 녹차 에탄올 추출물에서 0.5~1.5%에서 사멸효과를 나타내어 녹차의 우수한 항균활성이 확인되었다.
- aureue\ 대하여 1%와 2%의 sodium benzoate는 생육저해환을 형성하지 않았으나 솔잎 추출물에서는 1% 농도에서 생육 저해환을 형성하였으며 에탄올 추출물의 생육저해환이 물추출물에 비하여 큰 편이었다. 녹차 추출물에서는 1% 농도에서도 물추출물은 직경 약 15 mm, 에탄올추출물에서는 약 17 mm의 생육저해환이 형성되어 솔잎 추출물에 비하여 월등히 큰 항균활성이 확인되었다.
- Fig. 6과 Fig. 7의 S. aureuse- A. hydrophila0^ 대한 솔잎과 녹차의 물 및 에탄올 추출물의 항균성은 보존료인 sodium benzoate에 비하여 월등히 컸으며, 특히 녹차의 에탄올 추출물은 두 시험균주에 대하여 가장 탁월한 효과를 나타내어 보존료로서의 활용가치가 높을 것으로 생각된다.
- hydrophila0^ 대하여 1%와 2%의 솔잎추출물, 녹차 물추출물과 보존료에 의해 형성된 생육저해환의 크기를 비교한 사진이다. A. hydrophilae 대한 생육저해환은 sodium benzoate에 의해서는 형성되지 않았으며 솔잎의 경우에는 물추출물 1%에서 생육 저해환을 볼 수 없었으나 2%에서는 생육저해환이 형성되었다. 솔잎에탄올 추출물에서는 1%와 2% 모두 뚜렷한 생육저해환이 형성되었다.
- 솔잎추출물은 Gram 양성균(L. monocytogenes, S. grens)과 Gram 음성균중 A. hydrophilae 대하여 0.4 ~1.6% 범위내에서 증식을 억제시켰으며 E. coli와 S. typhimuriume: 솔잎주출물에 대하여 강한 내성을 나타내었다. 솔잎 추출물은 시험한 5균주에 대하여 사멸작용은 전혀 나타내지 않았다.
- 솔잎 추출물은 시험한 5균주에 대하여 사멸작용은 전혀 나타내지 않았다. 반면에 녹차추출물은 시험한 5균주 모두에 대하여 0.2~ 1.0% 범위내에서 증식을억제시켰으며 L. monocytogenese: 제외한 모든 균주를 0.5-2.0% 범위내에서 사멸시키는 강한 항균활성을 나타내었다. 솔잎과 녹차추출물은 특히 S.
후속연구
- 전체적인 항균력의 크기는 녹차 에탄올추출물 > 녹차 물추출물 > 솔잎 에탄올추출물>솔잎 물추출물의 순이었다. 이 결과로 미루어 녹차추출물은 다양한 종류의 세균에 대하여 우수한 항균작용을 나타내는 천연 보존료로서의 활용가치가 있을 것으로 판단된다.
- hydrophila는 다양한 식품에서 분리되고 있는 저온세균으로서 장염을 일으키는 원인 세균인데, .쩌본 실험의 결과에서 저농도의 녹차추출물로서 이 세균의 증식을 억제시킬 수 있는 효과는 A. hydrophila 에 의한 식중독사고를 예방할 수 있는 효과적인 방법이 될 것으로 예상된다.
- typhirmrium에 대한 솔잎과 녹차 추출둘의 항균활성은 아주 비슷한 결과로서 솔잎추출물은 이 두 균주에 대한 항균활성이 미미하였으나 녹차추출물은 대단히 우수한 항균활성을 나타내었다. 특히 이 두 균주가 각국에서 대형 식중독 사고의 대표적 원인세균인데 typhinuirium과 E. coli O157:H7의 증식억제를 위하여 녹차를 이용한 식품의 개발22,23)을 통하여 식품의 안전성을 크게 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
- 0%에서 이 두 균주가 사멸되었다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, 우리가 식품으로 사용하는 천연물은 여러 가지 항균성 물질을 함유하고 있기 때문에 각 식중독세균을 억제할 수 있는 식품의 연구가 계속되어야 할 것이다. 나아가서는 식품중의 항균성 물질들을 밝혀 내고 이들 성분의 병용효과 등의 실험을 통하여 안전한 천연보존료의 개발이 빨라질 것으로 생각된다.
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