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문제 정의
- 본 연구는 반응성 산소족에 의한 수정능력획득 및 첨체 반응 양상을 조사함으로써 반응성 산소족에 의한 수정과정 중에 필수적인 단계에서의 반응성 산소족의 영향을 알아보고자 대표적인 반응성 산소족 발생물질인 HiO2, xanthine -xanthine oxidase와 nitro oxide 발생인자인 sodium nitro prusside, leukocyte와 같은 반응성 산소족 발생인자들을 처리하였고, 또한 반응성 산소족 발생이 자연적으로 감소하리라예측되어지는 저산소농도 (5% 02) 상태에서의 결과를 수정능력획득과 첨체반응 및 정자 세포막의 지질과산화 유발 정도를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 5% 02 군을 제외한 각각의 처리군과 대조군들을 0분, 30 분, 1시간, 3시간 6시간 동안 CO2 배양기 안에서 배 양하였고, 5% 02 처리군은 5% Q로 고정시 킨 chamber내에서 배양한 후 냉장 보관되어진 40% TCA (trichloroacetic acid) 200μl를 첨가하여 단백질 침전을 유기하였다. 40% TCA를 첨가한 후 14, 000rpm에서 25분간 원심분리하고, 상 등액을 분리하였다.
- X (100μM)-X0 (50~400mIU)를 XO의 농도별로 처리한 후 30분부터 1, 3, 6시간까지 지질 과산화유발 정도를 측정한 결과는 다음과 같다. 30분에서 6시간까지의 지질 과산화 유발 정도는 대조군이 5.
- 1μM~1mM 처리하였다. 또한 남성 불임 요인의 하나로 알려진 leukocytospermia에 대한 영향을 알아보기 위해lymphocyte를 농도별로 1×10/ml~4×106/ml까지 처리하였다. 일반적인 배양기내 산소농도인 20% 6농도를 생체내 농도와 유사한 5%O2 농도로 낮추어서 배양한 후 결과를 분석하였다.
- 반응성 산소족이 수정능력 획득, 첨체 반응에 미치는 영향을 알아보기 위해서 반응성 산소족으로 superoxide anione xanthine (X) -xanthine oxidase (XO) system을 X (100 XO (50mlU~400mIU) 처리하였고, hydroperoxide는 H2O2를 125μM~ ImM까지 처리하였으며, nitric oxide는 NO donoi.인 sodium nitroprusside를 0.
- 40% TCA를 첨가한 후 14, 000rpm에서 25분간 원심분리하고, 상 등액을 분리하였다. 분리된 상등액 200μl에 0.05% NaOH용액 내 2% thiobarbituric acid를 800/21첨가한 후 10분간 끊인 후, 실온까지 식히고, spectrophotometer (Amershamphamacia, USA)를 이용하여 534nm 파장에서 흡광도를 측정하여 malondialdehyde (malondialdehyde-thiobarbituric reactivity)를 정량하였다. malon-aldehyde를 순차적으로 희석한 농도를 흡광 기준으로 이용하였다 (Mammto et al.
- 처리 농도 및 시간에 따라 준비된 정자를 CTC염색하기 전에 정자의 생존성을 확인하기 위해서 100mg/ml의 Hoechst 33258를 단백질이 제거된 배양액으로 1:1,000 비율로 희석한 후 정자와 1:100으로 섞은 후 약 2분간 실온에서 염색하였다. 염색되어 진 정자를 2% PVP가 들어 있는 배양액으로 세척하여 남아있는 염색성분을 제거한 후 CTC 염색 과정을 아래와 같이 수행하였다. 정자와 CTC 용액을 1:1 (50μl)로 알루미늄 호일로 빛을 차단한 tube에서 혼합한 후 완전하게 교반기를 이용하여 섞어준 후 0.
- 또한 남성 불임 요인의 하나로 알려진 leukocytospermia에 대한 영향을 알아보기 위해lymphocyte를 농도별로 1×10/ml~4×106/ml까지 처리하였다. 일반적인 배양기내 산소농도인 20% 6농도를 생체내 농도와 유사한 5%O2 농도로 낮추어서 배양한 후 결과를 분석하였다. 첨체 반응률을 알아보기 위해서 각 실험군과 대조군에 progesterone을 10μM를 첨가하였다.
- 결과 판독은 2가지로 구분하였다. 정자 두부 전체가 골고루 형광을 띠거나, post-equatorial region에 형광띠가 관찰되지 않는 것을 intact acrosome으로 구분하였고, 정자의 두부 전체에 형광을 띠지 않는 것을 acrosome reacted군으로 구분하여 각각의 slide에서 100개의 정자를 조사하였다.
- 결과판독은 2가지로 구분하였다. 정자 두부 전체가 골고루 형광을 띠는 것을 uncapacitated군으로, post-equatorial region에 형광띠가 관찰되지 않거나 정자의 두부 전체에 형광을 띠지 않는 것을 capacitated군으로 구분하여 각각의 slide에서 100개의 정자를 조사하였다.
- 각각의 실험군에 lOxl"개의 정자를 분주하여 실험에 사용하였다. 정자를 각각의 실험군에 분주한 후 5% CO2, 37℃ 의 배양기와 5% 02, 5% CO2, 37℃ chamber에 넣어 0, 30분, [시간, 3시간, 6시간 동안 배양하였다.
- 염색되어진 정자를 2% PVP가 들어있는 배양액으로 세척하여 남아 있는 염색성분을 제거한 후 CTC염색방법에 의해 아래와 같이 수행하였다. 정자와 CTC용액을 1:1 (50μl)로 알루미늄호일로 빛을 차단한 tube에서 혼합한 후 완전하게 교반기를 이용하여 섞어 준 후 0.5M Tris-HCl내 2.5% (w/v)의 glutaraldehyde를 10μl를 첨가하여 고정하였다.고정된 정자를 슬라이드 위에 정치한 후 antifade 용액을 한 방울 떨군 후 잘 섞어준 뒤 cover slip를 덮는다.
- 일반적인 배양기내 산소농도인 20% 6농도를 생체내 농도와 유사한 5%O2 농도로 낮추어서 배양한 후 결과를 분석하였다. 첨체 반응률을 알아보기 위해서 각 실험군과 대조군에 progesterone을 10μM를 첨가하였다.
- 해빙하여 실험에 사용하였다. 해빙 후정자를 얻기 위해 3개층 (50-90-100%)으로 구성된 percoll방법으로 2회 원심분리하여 움직이는 정자를 획득하였다. 원심분리는 1,000 rpm 에서 20분간 1회, 1,200 rpm에서 5분간 1회씩 시행하였다.
- Cover slip 주위의 여분의 용액을 닦아내고, slide 위의 정자가 최대한 편평해지도록 압력을 가한 후 투명한 매니큐어로 mounting하였다. 형광현미경 (Nikon TE-600, Japan)하에서 수정능력 획득 여부를 조사하였다. 결과판독은 2가지로 구분하였다.
- Cover slip 주위의 여분의 용액을 닦아내고, slide 위의 정자가 최대한 편평해지도록 압력을 가한 후 투명한 매니큐어로 mounting하였다. 형광현미경 (Nikon TE-600, Japan)하에서 첨체반응을 조사하였다. 결과 판독은 2가지로 구분하였다.
대상 데이터
- 원심분리는 1,000 rpm 에서 20분간 1회, 1,200 rpm에서 5분간 1회씩 시행하였다. 각각의 실험군에 lOxl"개의 정자를 분주하여 실험에 사용하였다. 정자를 각각의 실험군에 분주한 후 5% CO2, 37℃ 의 배양기와 5% 02, 5% CO2, 37℃ chamber에 넣어 0, 30분, [시간, 3시간, 6시간 동안 배양하였다.
- 4% BSA를 첨가하여 사용하였다. H2O2, xanthine - xanthine oxidase, sodium nitroprusside, progesterone등과 spectrophotometry에 사용된 trichloroacetic acid (TCA), thiobarbituric acid (TBA), malondialdehyde (MDA), chlortetracycline (CTC) 등의 시약은 Sigma (St Louis, USA)사 제품을 구매하여 사용하였다,
- 실험에 사용된 배양액은 Ham's F-10에 0.4% BSA를 첨가하여 사용하였다. H2O2, xanthine - xanthine oxidase, sodium nitroprusside, progesterone등과 spectrophotometry에 사용된 trichloroacetic acid (TCA), thiobarbituric acid (TBA), malondialdehyde (MDA), chlortetracycline (CTC) 등의 시약은 Sigma (St Louis, USA)사 제품을 구매하여 사용하였다,
- 정액은 비뇨기과로 불임를 주소로 내원한 환자에게서 동의서를 받고 정액 검사 후 남은 정액을 냉동 보관 하여 보관한 뒤 해빙하여 실험에 사용하였다. 해빙 후정자를 얻기 위해 3개층 (50-90-100%)으로 구성된 percoll방법으로 2회 원심분리하여 움직이는 정자를 획득하였다.
데이터처리
- 통계적 유의성은 Chi-square test를 사용하였으며, 유의 수준을 5%로 하여p값이 0.01보다 낮은 경우를 유의하다고 정의하였다.
이론/모형
- CTC염색방법을 이용하여 첨체 반응을 조사하였다. 첨체 반응을 유기하기 위해서 최종 농도 의 progesterone을 정자 현탁액에 섞어주었다.
- 염색되어진 정자를 2% PVP가 들어있는 배양액으로 세척하여 남아 있는 염색성분을 제거한 후 CTC염색방법에 의해 아래와 같이 수행하였다. 정자와 CTC용액을 1:1 (50μl)로 알루미늄호일로 빛을 차단한 tube에서 혼합한 후 완전하게 교반기를 이용하여 섞어 준 후 0.
성능/효과
- 남성에 있어서 감염 등에 의해 정액 내 leukocyte 수가 1×106/ml을 초과하는 경우를 불임의 원인으로 정하고 있다. 본 연구에서는 1~2×106/ml의 lymphocyte에서는 수정능력획득을 저해하는 것으로 나타나 지금까지의 결과들과 같은 결과를 얻었으나 3~4x1"/ml의 경우에 보다 더 높은 억제 효과를 얻지는 못하였다(Fig. 4).이러한 결과는 lymphocyte에서 발생하는 반응성 산소족이 정자의 기능에 영향을 미치기는 하지만 lymphocyte 중에서 주된 반응성 산소족의발생체 인 polynuclear macrophage (PNM)의 비율이 높고 낮음이 저해 정도를 결정짓는 것으로 사료된다.
- 1μM~100μM까지 1시간에서 6시간까지 처리하여 첨체 반응률을 알아본 결과는 다음과 같다. 1시간 처리군에서 수정능력 획득률은 0.1, 1μM군을 제외한 모든 처리농도에서(29.7±4.5, 71.3±6.0, 85.7±3.5%) 대 조군 (9.7±7.5%)에 비해 유의하게 높게 나타났다(p<0.001). 3시간 처리 시에는 모든 처리군 (95.
- 1시간 처리군에서 첨체 반응률은 모든 농도처리군이 대조군 (9.0±7.5%)에 비해 유의하게 높게 나타났다(p<0.001). 처리농도 간에는 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 1시간 처리군에서는 대조군과 차이가 없었다. 3시간 처리 군과 6시간 처리군에서도 첨체 반응률이 69.7±5.5~100 + 0.0%으로 대 조군 (22.3±1.5~81.3±5.0%)보다 통계적으로 높은 첨체반응률을 나타냈으며 (P<0.001), 고농도 처리군 (200 mIU, 400mIU)이 저농도군들에 비해 첨체 반응률이 낮게 나타났다. 실험군이 처리 농도에 관계없이 대조군에 비해 첨체 반응이 빠르게 진행됨을 보여주고 있다.
- 처리농도간에는 100 μM 처 리군에서 가장 높은 지질 과산화유발 정도를 나타내었다. 3시간과 6시간 처리시에는 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났으며, 처리농도간에서도 농도 증가에 따른 증가 양상은 보이지 않았다 (Table 1).
- 5% 02 처리한 군에서의 처리시간 (4.6±1.4, 10.3+2.1, 14.8±2.2)에 따른 지질 과산화 유발 정도 및 증가양상이 대조군 (5.2±1.6, 14.3±2.8, 18.5±5.7)과 차이가 없는 것으로나타났으나, 전반적으로 대조군보다 낮은 지질 과산화 유발 정도를 나타냈다 (Table 1).
- 이). 6시간 처리 시에는 저농도군 (125, 250μM)에서는 약간의 증가는 있었으나, 대조군보다 낮은 수준을 유지하는 반면에, 500에서는 대조군과 유사한 정도의 지질 과산화가 유발되었으며, ImM 처리 군은 대 조군보다 지질 과산화 유발 정도가 높게 나타났으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다 (Table 1).
- 이는 Aitken등 (1995)의 결과 와일 치하며, hydroperoxide를 정자자체 에서 생성하는 기작이 없기 때문에 다른 반응성 산소군보다 그 일어나는 정도 및 시간이 지연되는 것으로 사료된다. Superoxide anion에 의한 지질 과산화는 대조군에 비해 차이가 없는 것으로 본 연구에서는 밝혀졌는데 (p<0.01) (Table 1) 이는 지금까지의 신선 정자를 이용한 결과들과는 배치되는 결과이다. 이러한 결과가 도출된 이유는 냉동 보존된 정자의 동결 및 해빙과정에서의 세포막 상해가 그 원인이라 사료된다.
- 또한 남성불임 요인의 하나로 알려진 leukocytospermia와 같은 경우는 백혈구의 숫자의 많고 적음보다 실제 영향을 미칠 수 있는 PNM세포에 대한 검증 작업이 더 중요함을 확인할 수 있었다.
- 2±08으로 처리 농도에 상관없이 대조군과 차이가 없는 것으로 나타났다. 또한 처리 시간이 늘어남에 따른 대조군의 지질 과산화유발 정도와 같은 양상의 증가를 나타내었다 (Table 1).
- 본 연구에서 hydroperoxide의 경우, 처리 후 3시간까지는 처리농도에 관계없이 지질 과산화가 덜 일어나는 특징을 보여주었다 (p<0.01) (Table 1). 이는 Aitken등 (1995)의 결과 와일 치하며, hydroperoxide를 정자자체 에서 생성하는 기작이 없기 때문에 다른 반응성 산소군보다 그 일어나는 정도 및 시간이 지연되는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 처리한 4종류의 반응성 산소족과 수정능력획득 및 첨체 반응과의 관계에서는 수정능력 획득 및 첨체 반응은 모든 반응성 산소족에 저농도군에서는 수정능력획득 및 첨체 반응을 촉진하나, 고농도에서는 대조군과 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다 (Table 1, 2). 한편, 배양기내 산소농도를 저산소상태로 유지한 실험에서는 매우 유의한 첨체 반응의 촉진이 있었다.
- lymphocyte는 복합적인 반응성 산소족을 유발하는 생체 내 세포이며, 활성화된 경우에는 정자 자체에서 생성하는 반응성 산소족의 약 1,000배에 해당하는 반응성 산소족을 방출하는 것으로 보고되어 있다. 본 연구에서는 lymphocyte에 의한 지질 과산화는 처리 1시간에 대조군에 2배 이상의 지질 과산화를 유발했으며, 그 이후로는 대조군과 차이가 없었다 (P< 0.01) (Table 1).처리농도에 따른 증가 양상은 시사하는 바가 크다 할 수 있겠다.
- (Johns et al, 1978; Alvares and Storey, 1984). 사람 정자에 superoxide anion이나 hydroperoxide등의 산소족을 처리하면 약 20% 정도의 불포화지방산이 감소되어진다고는 보고 (Alvares and Storey, 1984) 처럼, 본 연구에서도 superoxide anion (X-XO), hydroperoxide (H2O2), nitric oxide (SNP), lymphocyte등과 같은 다양한 반응성 산소족을 처리하였을 때 지질과 산화가 유발됨을 알 수 있었다.
- 3%와 차이가 없었다. 실험군이 처리 농도에 관계없이 대조군에 비해 수정능력 획득 정도가 빠르게 진행됨을 보여주고 있다. (p<0.
- 3%와 차이가 없었다. 실험군이 처리 농도에 관계없이 대조군에 비해 수정능력 획득 정도가 빠르게 진행됨을 보여주고 있다. (p<0.
- 3%와 차이가 없었다. 실험군이 처리 농도에 관계없이 대조군에 비해 수정능력 획득 정도가 빠르게 진행됨을 보여주고 있다. (p<0.
- 이상의 결과를 종합해보면, 반응성 산소족은 그 종류에 관계없이 사람 사정정자의 수정능력 획득에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 특히, 5% 6에서 20%O2보다 빠른 수정능력 획득을 일으키는 것을 확인한 결과는 보조생식술을 시행하는 데 있어 정자를 다루는 방법과 과정에 있어 보다 더 세밀하고 정확한 계산이 필요함을 시사한다고 사료된다. 또한 남성불임 요인의 하나로 알려진 leukocytospermia와 같은 경우는 백혈구의 숫자의 많고 적음보다 실제 영향을 미칠 수 있는 PNM세포에 대한 검증 작업이 더 중요함을 확인할 수 있었다.
- 같다. 처리농도와 시간에 따른 증가 양상을 보여 주었으나 유의한 차이는 없었다, 그러나 1시간 처리시에는 저농도(1 xl0%il)군을 제외한 lymphocyte 처리군 (12.3±1.2, 12.9± 1.0, 17.5±1.0)에서 대조군 (5.2±1.6) 보다 통계적으로 유의한 증가가 나타났다 (p<0.01) (Table 1).
후속연구
- , 1996)의 증거라 사료된다. 저산소(5%) 상태에서 지질과산화가 낮게 유발되어진 것(p<0.01) (Table 1)은 배양조건에 따른 차이가 있을 수 있음을 나타내주는 결과라 사료되며, 많은 항산화제들과의 복합적인 연관실험을 통해 반응성 산소족에 의한 상해를 예방 혹은 줄일 수 있는 방편으로 활용가치가 있다고 사료된다.
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