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문제 정의
- 625mg/ml/mm을 정점으로 이 보다 더 커지게 되면,주화성 반응도는 반대로 감소된다고 하겠다. 또한 본논문의 목적은 체외수정을 위한 가장 활동성 있는 정자를 선별하는데 있으므로 체외수정 시 여러 마리 정자가 필요한 것이 아니므로 본 방법으로 선별한 정자를 임상실험에 사용되는 것은 충분히 가능할 것으로 생각된다.
- 이러한 단점을 극복하기 위해서 본 연구에서는 층류 현상이 필요치 않는, 즉 실린지 펌프와 같은 유동발생 장치가 필요 없는 운동성 정자의 분리용 마이크로바이오칩을 설계 및 제작하였다. 실제로 쥐 정자(mouse sperm)를 이용하여 제작된 칩의 마이크로 채널 내에서 주화성에 의해 활동성 정자를 분리하였다.
제안 방법
- Fig.3(a)에서 보는 바와 같이, 5분 동안 형광물질의 확산시간을 준 후 형광현미경으로 관찰하였다. 그결과 모든 채널에서 형광물질의 농도 구배가 선형적으로 형성되는 것을 확인할 수 있었다.
- 정자들이 마이크로칩상에서 농도 구배에 의한 주화성에 반응하는지를 확인하기 위해 Fig. 4(a)와 같이 배출구들에 투입되는 유도물질의 농도들을 세가지 경우로 달리하여 실험을 수행하였다. 수행 결과인 Fig.
- 2 mm/min이기 때문에 10분 후면 배출구에 도달할 수있을 것으로 예상되기 때문이다. 10분 후 현미경을 통하여 배출구에 도달 한 정자 수를 측정하였다. 일정 비율로 희석시킨 유도 물질에 대해 총 30번반복실험을 수행하였다.
- 배양접시에 들어 있는 부고환과 이물질을 제거하고 각각 100 ㎕씩 마이크로 튜브에 분주한 후 37℃로 유지되고 있는 항온조에 저장하고 각각의 마이크로 튜브에서 1 ㎕씩 추출하여 계수측정기(cytometer)를 통해 정자의 개수를 계산한다. 그 후 준비된 칩에 약 30~40 ㎕ HTF medium을 채운후 유도 물질인 아세틸콜린을 일정 비율(1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64)로 희석시킨 용액과 대조군(control)으로 사용된 D.I water를 마이크로 피펫(micropippet)을 이용하여 배출구에 각각 2 ㎕씩 떨어뜨린 후유도물질이 마이크로채널 내에서 농도구배를 형성시키기 위해 37℃로 유지된 항온조에 5분 동안 넣어둔다. 5분 후 주입구에 1 ㎕의 정자가 섞인 용액을 떨어뜨린 후 10분 동안 37℃로 유지된 항온조에 넣어둔다.
- 2 mm/min이므로 길이를 10 mm로 정하였다. 그리고 유도물질의 최적 농도 구배 범위를 찾고 실제 정자들이 그 농도구배에서 주화성에 의한 분리가 잘되는지 용이하게 관찰하기 위해서, 정자샘플을 주입하기 위한 주입구(inlet)를 가운데 위치시키고 유도 물질이 놓일 활동성 정자 배출구(outlet)를 방사형으로 설계하였다.
- 따라서 본 연구에서 아세틸콜린대신 형광물질인 Rhodamine B를이용하여 화학적 유도물질이 마이크로채널 내에서 길이 방향으로 선형적으로 농도차가 형성되는지 정량적으로 측정하였고 그 결과는 Fig. 3과 같다.
- 마이크로채널 내에서 화학 유도물질의 화학적 농도 구배(chemical concentration gradient)가 채널 길이방향으로 선형적으로 잘 형성되는지를 확인하고 길이방향으로 확산된 결과를 정량화 하기 위해 형광실험을 첫 번째로 수행하였다. 우선 제작된 칩에 약 30 ~ 40 ㎕ HTF medium을 채운 후 배출구에 Rodamine B 2㎕를 마이크로 피펫을 이용하여 떨어뜨린 후 37℃로 유지되고 있는 항온조(dry bath)에 넣어두고 경과시간이 5분일 때와 20분일 때에 각각 공초점 형광 현미경(Confocal Laser Scanning Scope, CLSM)을 이용하여 형광측정 및관찰을 수행하였다.
- 추출된 부고환을 500 ㎕ HTF solution이 들어 있는 페트리디쉬(petridish)에 넣어 주사바늘을 이용하여 살짝 누르면서 짜주어 부고환 안의 정자가 잘 나올수 있게끔 배양접시를 5분 동안 서서히 양 옆으로 흔들어 준다. 배양접시에 들어 있는 부고환과 이물질을 제거하고 각각 100 ㎕씩 마이크로 튜브에 분주한 후 37℃로 유지되고 있는 항온조에 저장하고 각각의 마이크로 튜브에서 1 ㎕씩 추출하여 계수측정기(cytometer)를 통해 정자의 개수를 계산한다. 그 후 준비된 칩에 약 30~40 ㎕ HTF medium을 채운후 유도 물질인 아세틸콜린을 일정 비율(1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64)로 희석시킨 용액과 대조군(control)으로 사용된 D.
- 실제로 쥐 정자(mouse sperm)를 이용하여 제작된 칩의 마이크로 채널 내에서 주화성에 의해 활동성 정자를 분리하였다. 실험결과를 통해 쥐 정자들의 주화성 반응 여부를 검증하고 활동성 정자를 유도하기 위한 유도물질의 최적 농도구배를 구하였다.
- 마이크로채널 내에서 화학 유도물질의 화학적 농도 구배(chemical concentration gradient)가 채널 길이방향으로 선형적으로 잘 형성되는지를 확인하고 길이방향으로 확산된 결과를 정량화 하기 위해 형광실험을 첫 번째로 수행하였다. 우선 제작된 칩에 약 30 ~ 40 ㎕ HTF medium을 채운 후 배출구에 Rodamine B 2㎕를 마이크로 피펫을 이용하여 떨어뜨린 후 37℃로 유지되고 있는 항온조(dry bath)에 넣어두고 경과시간이 5분일 때와 20분일 때에 각각 공초점 형광 현미경(Confocal Laser Scanning Scope, CLSM)을 이용하여 형광측정 및관찰을 수행하였다. 형광측정은 총 3번 측정하여 평균값을 계산하였다.
- 형광실험을 통해 얻은 결과를 바탕으로 제작된 칩에서 과연 주화성에 의한 정자들이 이동하는지를 확인하는 실험을 수행하였고 정자들이 실험에 적용된 유도 물질의 다양한 농도 구배 중에서 어떤 농도 구배에서 제일 강한 주화성을 나타내는지를 알아보기 위한 농도 구배 최적화 실험을 수행하였다. 우선, 구입한 쥐를 경추탈골 시킨 후 해부용 가위를 이용하여 개복하여 두 개의 부고환(epididymis)을 추출한다. 추출된 부고환은 미리 준비된 1 mℓ HTF solution이 들어 있는 마이크로 튜브(microtube)에 넣고 37℃로 유지되고 있는 항온조에 보관한다.
- 칩 재료로서 생화학적으로 안정하고 광학특성이 우수한 PDMS와 유리를 이용하였고 설계된 마이크로칩의 제작 공정은 다음과 같다. 우선, 실리콘 기판 위에 음성 감광제(SU-8 3050, MicroChem Corp., USA)를 도포하여100㎛ 후막을 형성시킨 후 포토리소그래피(photolithography) 공정을 통하여 몰드(mold)를 제작한다. 제작된 몰드에 PDMS와 경화제가 10:1로 섞인 혼합물을 부어 65℃에서 4시간 동안 오븐(oven)에서 경화시킨 후몰드에서 PDMS를 분리하여 기계적인 펀칭으로 주입구와 배출구를 형성시키면 최종적으로 PDMS층이 완성된다.
- 운동성 있는 정자의 분리를 위한 마이크로칩을 설계하고 제작하였다. 제작된 마이크로채널 내에서 농도구배가 선형적으로 형성됨을 형광실험을 통하여 확인하였고 유도물질인 아세틸콜린과 대조군으로 사용된 탈이온수를 이용하여 쥐 정자가 채널 내에 형성된 농도 구배에 대하여 주화성 반응을 보이는 것을 확인하였다.
- 10분 후 현미경을 통하여 배출구에 도달 한 정자 수를 측정하였다. 일정 비율로 희석시킨 유도 물질에 대해 총 30번반복실험을 수행하였다.
- 형광실험을 통해 얻은 결과를 바탕으로 제작된 칩에서 과연 주화성에 의한 정자들이 이동하는지를 확인하는 실험을 수행하였고 정자들이 실험에 적용된 유도 물질의 다양한 농도 구배 중에서 어떤 농도 구배에서 제일 강한 주화성을 나타내는지를 알아보기 위한 농도 구배 최적화 실험을 수행하였다. 우선, 구입한 쥐를 경추탈골 시킨 후 해부용 가위를 이용하여 개복하여 두 개의 부고환(epididymis)을 추출한다.
대상 데이터
- 그리고 채널 내에서 유도물질 확산이 제대로 일어나는지를 확인하고 확산된 결과를 정량화하기 위해 형광물질인 Rhodamine B(M.W 479.01, Fluka®, UK)를 사용하였다.
- 본 연구에서는 주화성을 이용한 활동성 정자의 분리 실험을 위해 쥐 정자(mouse sperm)를 이용하였다. 왜냐하면 구입이 용이하고 인간의 정자와 유사하며, 또한 일반적으로 포유류 정자는 길이나 외형이 약간 다를 뿐 행동 성향이나 기본적인 기관의 구조와 기능은 거의 같기 때문에 인간 정자의 주화성에 대한 반응을 예측할 수 있기 때문이다.
- 1과 같다. 설계된 마이크로 칩은 직경이 4 mm인주입구(inlet) 1 개, 직경이 2 mm인 배출구(outlet) 8개와 길이가 10 mm인 마이크로 채널들 8개가 형성되어 있는 PDMS층과 유리기판으로 구성되어 있다. 설계된 칩에서 마이크로 채널은 일반적으로 쥐 정자의 속도가 1~1.
- 왜냐하면 구입이 용이하고 인간의 정자와 유사하며, 또한 일반적으로 포유류 정자는 길이나 외형이 약간 다를 뿐 행동 성향이나 기본적인 기관의 구조와 기능은 거의 같기 때문에 인간 정자의 주화성에 대한 반응을 예측할 수 있기 때문이다. 우선 정자를 채취하기 위해 6~8주 이상의 수컷 outbred ICR mouse(Samtako, INC, Korea)를 구입 하였다. 추출된 정자들이 체외에서 살 수 있도록 하기 위해 사람의 난관 체액과 조성이 유사한 HTF(human tubal fluid) medium을 Chemicon international, Inc.
- 625 mg/ml/mm 임을 확인하였다. 제작된 마이크로칩은 배출구가 8개로 구성되어 있어 8가지 반응조건을 동시에 실험할 수있다. 따라서 각각의 반응조건에 대해 개별적으로 실험하는 것보다 시간이 훨씬 단축되고 신뢰성이 있기 때문에 high throughput screening(HTS)이 가능할수 있다.
- 5에서 오차 막대가 비교적 크게 나타나고 있다. 총 30회의 실험에서 쥐 개체를 총 6마리를 사용하였는데 각 마리당 5회 실험을 수행하였다. 이때 각 개체마다 추출한 정자의 밀도(정자 개체수/㎕) 차이에서 측정 오차가 기인 하였다고 추측 된다.
- 칩 재료로서 생화학적으로 안정하고 광학특성이 우수한 PDMS와 유리를 이용하였고 설계된 마이크로칩의 제작 공정은 다음과 같다. 우선, 실리콘 기판 위에 음성 감광제(SU-8 3050, MicroChem Corp.
- 에서 구입하여 사용하였다. 화학 유도물질로서는 아세틸콜린(acetylcholine)을 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 아세틸콜린은 쥐 정자들에게 주화성을 일으키는 것으로 추정되는 물질 중 하나이다.
데이터처리
- 우선 제작된 칩에 약 30 ~ 40 ㎕ HTF medium을 채운 후 배출구에 Rodamine B 2㎕를 마이크로 피펫을 이용하여 떨어뜨린 후 37℃로 유지되고 있는 항온조(dry bath)에 넣어두고 경과시간이 5분일 때와 20분일 때에 각각 공초점 형광 현미경(Confocal Laser Scanning Scope, CLSM)을 이용하여 형광측정 및관찰을 수행하였다. 형광측정은 총 3번 측정하여 평균값을 계산하였다. 여기서 항온조에 넣어두는 이유는 정자가 체내 온도 조건에서 활동하기 때문에 동일한 조건에서 실험을 수행하기 위함이다.
성능/효과
- 4 (b)) 탈이온수를 떨어 뜨린 배출구에 상대적으로 적은 정자들이 있음을 확인할 수 있었다. 결국, 이 실험을 통해 제작된 마이크로칩 상에서 정자들이 농도 구배에 의한 주화성에 반응하는 것을 확인하였다.
- 각각의 확산계수는 용액을 물로 가정하고 37℃ 온도에서 계산된 값이다. 계산된 값으로 두 물질의 확산계수를 비교해보면 아세틸콜린의 확산계수가 Rhodamine B의 확산계수보다 약간 크지만 거의 비슷한 값을 가지는 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구에서 아세틸콜린대신 형광물질인 Rhodamine B를이용하여 화학적 유도물질이 마이크로채널 내에서 길이 방향으로 선형적으로 농도차가 형성되는지 정량적으로 측정하였고 그 결과는 Fig.
- 3(a)에서 보는 바와 같이, 5분 동안 형광물질의 확산시간을 준 후 형광현미경으로 관찰하였다. 그결과 모든 채널에서 형광물질의 농도 구배가 선형적으로 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 약 20분 후 다시 농도 구배를 형광현미경으로 관찰한 결과 비록 시간경과에 의해서 형광세기가 줄어들었다.
- 그결과 모든 채널에서 형광물질의 농도 구배가 선형적으로 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 약 20분 후 다시 농도 구배를 형광현미경으로 관찰한 결과 비록 시간경과에 의해서 형광세기가 줄어들었다. 이것은 형광현미경에서 조사된 레이저에 의해 발광된 형광물질이 갖고 있던 형광세기를 잃어버리면서 소멸하기 때문이다.
- 제작된 마이크로채널 내에서 농도구배가 선형적으로 형성됨을 형광실험을 통하여 확인하였고 유도물질인 아세틸콜린과 대조군으로 사용된 탈이온수를 이용하여 쥐 정자가 채널 내에 형성된 농도 구배에 대하여 주화성 반응을 보이는 것을 확인하였다. 그리고 제작된 마이크로칩 상에서쥐 정자를 이용하여 유도물질인 아세틸콜린의 농도에 따른 활동성 정자분리 실험을 수행한 결과 주화성을 일으키는 최적의 농도구배가 약 0.625 mg/ml/mm 임을 확인하였다. 제작된 마이크로칩은 배출구가 8개로 구성되어 있어 8가지 반응조건을 동시에 실험할 수있다.
- 따라서 본 연구에서 사용된 유도물질인 아세틸콜린과 형광물질인 Rhodamine B의 확산계수를 계산하여 보면 각각 약 5.71×10-10 m2 /s 과 4.132×10-10 m2 /s 이다.
- 이 결과로부터 본 연구에서 제작된 마이크로칩에서 주화성 반응을 일으키기 위한 길이방향으로의 선형적인 농도 구배가 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 따라서 유체의 흐름 상태에서 흐름방향의 수직으로의 확산을 이용하는 기존의 연구방법과는 달리, 제작된 마이크로 칩에서는 채널의 길이방향으로 단순한 화학물질의 특성인 확산작용에 의해 형성되는 농도구배를 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 4 (b)) 에는, 아세틸콜린을 떨어뜨린 배출구에 다른 배출 구에 비해 상대적으로 많은 정자들이 있음이 관찰 되었다. 따라서 정자들이 화학물질의 농도구배에 의한 주화성에 반응한다는 사실을 결과를 통해서 확인할 수 있었다. 그리고 두번째 경우와 반대인 경우, 즉 8개의 배출구 중 1곳에만 탈이온수를 떨어뜨리고 나머지는 1/16로 희석된 아세틸콜린을 떨어뜨린 경우(case#3 in Fig.
- 이것은 형광현미경에서 조사된 레이저에 의해 발광된 형광물질이 갖고 있던 형광세기를 잃어버리면서 소멸하기 때문이다. 따라서 형광세기가 줄어들기는 하였지만 채널길이 방향에 따라 형성된 농도 구배가 선형적으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3(b)).
- 이때 각 개체마다 추출한 정자의 밀도(정자 개체수/㎕) 차이에서 측정 오차가 기인 하였다고 추측 된다. 또한 실험시간이 지나면 지날수록 정자의 활동성이 떨어지는 것을 현미경 관찰로 확인할 수있었다. 이렇듯 시간에 따른 정자의 활동성 감소도 오차를 발생시키는 원인이라고 생각된다.
- 이러한 영향을 줄이기 위해 도착한 정자수의 퍼센트로 나타내었다. 실험결과, 아세틸콜린이 1/16 비율로 희석된 희석액을 떨어뜨린 배출구에서 다른 배출구에 비해 도착한 정자수가 상대적으로 많았다. 이것은 다른 배출구 농도들 보다 1/16 비율로 희석된 아세틸콜린이 투입된 배출구 농도에 의해 채널 내에 만들어진 농도구배가 쥐 정자의 주화성을 가장 강하게 유도함을 나타낸다.
- 625 mg/ml/mm가 된다. 실험결과, 유도물질 희석 비율이 증가함에 따라 쥐 정자의 주화성 반응도 증가한다. 하지만 농도구배가 0.
- 3(b)). 이 결과로부터 본 연구에서 제작된 마이크로칩에서 주화성 반응을 일으키기 위한 길이방향으로의 선형적인 농도 구배가 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 따라서 유체의 흐름 상태에서 흐름방향의 수직으로의 확산을 이용하는 기존의 연구방법과는 달리, 제작된 마이크로 칩에서는 채널의 길이방향으로 단순한 화학물질의 특성인 확산작용에 의해 형성되는 농도구배를 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
- 운동성 있는 정자의 분리를 위한 마이크로칩을 설계하고 제작하였다. 제작된 마이크로채널 내에서 농도구배가 선형적으로 형성됨을 형광실험을 통하여 확인하였고 유도물질인 아세틸콜린과 대조군으로 사용된 탈이온수를 이용하여 쥐 정자가 채널 내에 형성된 농도 구배에 대하여 주화성 반응을 보이는 것을 확인하였다. 그리고 제작된 마이크로칩 상에서쥐 정자를 이용하여 유도물질인 아세틸콜린의 농도에 따른 활동성 정자분리 실험을 수행한 결과 주화성을 일으키는 최적의 농도구배가 약 0.
후속연구
- 다만 시험관내 실험(in vitro assay)에 의해 각 동물종마다 소수의 물질이 보고되어있다.(1) 이러한 정자의 주화성과 주열성에 대한 연구를 통해 궁극적으로 인간 수정의 메커니즘을 밝힌다면, 불임부부의 수를 줄이고 더 나아가 건강한 후손을 얻을 수 있을 것이다.
- 마이크로 피펫을 이용하여 시료 일정량을 칩에 간단히 투입만 하면 채널 내에 길이방향으로 농도구배를 쉽게 형성시킬 수 있다는 장점이 있다. 본 연구에서 제안된 바이오칩은 체외수정을 위한 운동성 정자 분리법으로 유용하게 사용될 뿐만 아니라, 주화성을 이용한 세포 분리 분야에도 적용이 가능 할 것이다.
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