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문제 정의
- 이번 연구에서 우리는 선구-Ml RNA의 3' 말단을 가공하는 효소 활성을 가진 단백질을 정제하여 그 성질을 알아보고자 하였다. 이번에 정제한 Dps (DNA protection during starvation) 단백질은 세포에서 DNA와 결합하여 DNA를 보호하는 기능을 가진 것으로 알려져 있기 때문에,6,7 그것이 선구-Ml RNA의 가공에 관여하는 리보핵산 가수분해효소의 활성을 가진다는 것은 매우 특이한 사실이다.
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선구-Ml RNA를 가공하는 활성의 분석.
- 본 연구은 1997년 한국학술진흥재단의 공모과제 연구비로 연구되었으므로 이에 감사한다.
제안 방법
- 1 mM PMSF, 1 mM DTT) lOOmL을 넣고 잘 녹였다. 여기에 DNase 1(1 unit/μL) 30μL를 넣고 30분간 다시 저은 다음, Centricon A 8.24 로터로 6000 × g에서 15분간 원심분리히여 알루미나를 제거하고 상층액을 Beckman 초원심분리기로 30,000 × g에서 1 시간 원심분리해서 그 상층액을 모았다 (S30 분획). 열처리는 Lee 등의 방법에 따랐다.
- 용출한 단백질 분획들을 모아 최종농도가 20%가 되도록 황산 암모늄을 천천히 넣고 녹인 뒤 약 15분간 젓고 14,000 rpm에서 15분간 원심분리해서 침전물을 얻었다. 이렇게 해서 생기는 상층액에서 마찬가지 절차로 황산 암모늄 농도를 각각 40%, 60%, 80%로 높여서 침전물을 얻었다. 이들 중 60-80% 사이의 황산 암모늄 농도에서 생기는 침전물을 완충용액 B(30mM HEPES, 30 mM imidazole, pH 7.
- 7 mL을 관 크로마토그래피로 분리하였다. 분리한 분획들의 선구-Ml RNA 가공활성을 조사하였다. 용출한 분획 속에 들어있는 단백질의 종류를 알아보기 위해 분획들을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기 이동한다음 Coomassie blue 염료로 착색하여 단백질 띠들을 확인하고 이를 각 분획들의 선구-Ml RNA 가공활성과 비교하였다.
- 분리한 분획들의 선구-Ml RNA 가공활성을 조사하였다. 용출한 분획 속에 들어있는 단백질의 종류를 알아보기 위해 분획들을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기 이동한다음 Coomassie blue 염료로 착색하여 단백질 띠들을 확인하고 이를 각 분획들의 선구-Ml RNA 가공활성과 비교하였다.
- 가공효소로 작용하는 19-kD 단백질의 정체를 밝히기 위해서 아미노산 서열을 결정하였다. 먼저 단백질 분획을 미리 착색한 크기표지물과 함께 12.
- 가공효소로 작용하는 19-kD 단백질의 정체를 밝히기 위해서 아미노산 서열을 결정하였다. 먼저 단백질 분획을 미리 착색한 크기표지물과 함께 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기이동하여 분리하고 겔을 염색하지 않은 채 PVDF 막으로 단백질을 전기 이동법으로 옮기고, 이 막을 Coomassie blue염료로 염색하여 19-kD 위치의 단백질 띠를 오려내어 기초과학지원연구소 서울분소에 의뢰하여 10개의 아미노산 서열을 결정하였다. 결정한 아미노산 서열을 미국 NCBI Database에서 검색하여 단백질의 정체를 밝혔다.
- 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기이동하여 분리하고 겔을 염색하지 않은 채 PVDF 막으로 단백질을 전기 이동법으로 옮기고, 이 막을 Coomassie blue염료로 염색하여 19-kD 위치의 단백질 띠를 오려내어 기초과학지원연구소 서울분소에 의뢰하여 10개의 아미노산 서열을 결정하였다. 결정한 아미노산 서열을 미국 NCBI Database에서 검색하여 단백질의 정체를 밝혔다.
- dps 유전자는 PCR 빙법을 이용하여 클로닝하였다.9 BamHl 인식자리를 가지고 있는 S-CGGGATCCATGAGTACCGCTAAATTA-3'과 Hindm 인식자리를 가지고 있는 3'-CCCAAGCnTATTCGATGTTAGACTC-5을 사용하여 균주 W3110에서 얻어낸 대장균의 염색체 DNA 1μg을 20회의 PCR로 증폭하여 약 520개 염기쌍을 가진 생성물을 얻었다.
- 9 BamHl 인식자리를 가지고 있는 S-CGGGATCCATGAGTACCGCTAAATTA-3'과 Hindm 인식자리를 가지고 있는 3'-CCCAAGCnTATTCGATGTTAGACTC-5을 사용하여 균주 W3110에서 얻어낸 대장균의 염색체 DNA 1μg을 20회의 PCR로 증폭하여 약 520개 염기쌍을 가진 생성물을 얻었다. 이 생성물을 1.5% 아가로스 겔 전기이동법으로 분리 정제한 다음, 각각 20 unit의 BaznHI과 Hindill로 37℃(2에서 3시간 항온처리하였다. 미국 Qiagen사에서 구입한 pQE30 플라스미드를 마찬가지 방법으로 제한효소로 처리하여 이 생성물과 앞서 얻은 DNA 생성물을 2 unit의 DNA 연결효소로 4℃(2에서 하룻밤 처리하여 연결하였다.
- 5% 아가로스 겔 전기이동법으로 분리 정제한 다음, 각각 20 unit의 BaznHI과 Hindill로 37℃(2에서 3시간 항온처리하였다. 미국 Qiagen사에서 구입한 pQE30 플라스미드를 마찬가지 방법으로 제한효소로 처리하여 이 생성물과 앞서 얻은 DNA 생성물을 2 unit의 DNA 연결효소로 4℃(2에서 하룻밤 처리하여 연결하였다. 연결된 플라스미드를 Cohen 등의 방법10을 이용하여 대장균의 JM109 균주에 형질전환하였다.
- 연결된 플라스미드를 Cohen 등의 방법10을 이용하여 대장균의 JM109 균주에 형질전환하였다. 재조합 플라스미드에 연결된 dps 유전자는 DNA 염기서 열을 결정함으로써 확인하였다. 플라스미드에 연결된 dps 유전자 끝에는 여섯 개의 His 코돈이 연결되어 있으므로 dps 유전자의 발현으로 생성되는 재조합 Dps 단백질의 N-말단에는 6개의 His 잔기가 포함되게 된다.
- N-말단에 His 잔기들이 부착된 재조합 Dps 단백질을 정제하기 위한 Cu-IDA (copper-imidodiacetate) 컬럼은 Zachariou의 방법11을 변형하여 제조하였다. 재조합 Dps 단백질을 대량으로 얻기 위하여 50ng/mL 농도의 ampicillin 이 함유된 100mL의 LB 배지에서 형질변환된 JM109 세포를 600nm에서의 흡광도가 0.
- 파쇄액을 15,000 rpm의 속도로 20 분간 원심분리하여 얻은 상층액을 완충용액 C로 평형화한 Cu-IDA 수지 4mL이 채워진 관에 싣고 완충용액 C로 충분히 씻어주었다. Cu-IDA 수지에 결합한 Dps 단백질을 용리하기 위해서 완충용액 C에 최종농도가 각각 10 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 500 mM이 되도록 imidazole의 농도를 맞춘 용액을 차례로 사용하였다. 각 imidazole 농도의 용액으로 용리한 분획을 12.
- 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기이동하였다. 최종 정제된 재조합 Dps 단백질을 얻기 위해서 Cu-IDA에서 얻은 활성 분획을 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기이동한 다음, 겔을 염색하지 않고 원하는 재조합 Dps 단백질과 Dps 단백질 조각을 오려내어 완충용액 A를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 두어 용출하였다. 용출된 용액을 12.
- 5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기이동한 다음, 겔을 염색하지 않고 원하는 재조합 Dps 단백질과 Dps 단백질 조각을 오려내어 완충용액 A를 첨가하고 4℃에서 하룻밤 두어 용출하였다. 용출된 용액을 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기이동하여 단백질 띠를 확인하였고, 선구-Ml RNA 가공 활성을 분석하였다.
- Dps 단백질은 1992년 Kolter의 연구진에 의해 처음으로 보고되었고, 그 후 여러 연구들로 이 단백질이 DNA에 비특이적으로 결합하여 과산화 수소와 같은 산화제의 공격으로부터 DNA와 세포를 보호한다는 것이 알려졌다.6,7 Dps 단백질을 손쉽게 정제하기 위하여 N-말단에 6개의 His 아미노산이 결합되도록 dps 유전자를 클로닝하고, 재조합 Dps 단백질을 Cu-IDA 관 크로마토그래피로 정제하였다 (Fig. 3). 이때 Dps 단백이외에 전기이동 겔상에서 빨리 이동하는 단백질 조각을 관찰하였는데 이는 단백질 정제 과정에서 C-말단의 아미노산 잔기들이 분해된 Dps 단백질 조각으로 생각된다.
대상 데이터
- 가공효소의 분리에는 RNase I 에 결함이 있는 대장균 1500 균주를 사용하였다. 대강균 세포 15 g을 4℃로 냉각한 막자사발에서 30 g의 알루미나를 넣고 골고루 간 다음.
- 선구-Ml RNA 가공활성을 가진 단백질을 분리하기 위하여 S30 분획의 제조., 열처리, DEAE Sepharose 관 크로마토그래피, 황산암모늄 분별침전, Sephacryl S-200 관 크로마토그래피을 차례로 수행하였다.
- 선구-Ml RNA 가공활성을 가진 단백질을 분리하기 위하여 S30 분획의 제조., 열처리, DEAE Sepharose 관 크로마토그래피, 황산암모늄 분별침전, Sephacryl S-200 관 크로마토그래피을 차례로 수행하였다. Sephacryl S-200 관 크로마토그래피로 분리한 단백질 분획에서 선구-Ml RNA 가공 활성이 두드러지게 나타나는 단백질 분획에 약 19-kD 크기의 단백질이 특이하게 존재하는 것을 알았다 (Fig.
이론/모형
- 선구-Ml RNA의 제조와 32P 표지 그리고 선구-Ml RNA를 가공하는 활성의 분석은 김하동 등*의 방법에 따랐다.
- 24 로터로 6000 × g에서 15분간 원심분리히여 알루미나를 제거하고 상층액을 Beckman 초원심분리기로 30,000 × g에서 1 시간 원심분리해서 그 상층액을 모았다 (S30 분획). 열처리는 Lee 등의 방법에 따랐다. S30 분획을 50mL 시험관에 나누어 담고 62℃에서 15 분간 열처리를 했다.
- 미국 Qiagen사에서 구입한 pQE30 플라스미드를 마찬가지 방법으로 제한효소로 처리하여 이 생성물과 앞서 얻은 DNA 생성물을 2 unit의 DNA 연결효소로 4℃(2에서 하룻밤 처리하여 연결하였다. 연결된 플라스미드를 Cohen 등의 방법10을 이용하여 대장균의 JM109 균주에 형질전환하였다. 재조합 플라스미드에 연결된 dps 유전자는 DNA 염기서 열을 결정함으로써 확인하였다.
성능/효과
- 한편, 우리 연구진3은 선구一Ml RNA의 절단부위에 RNase E가 인식하는 연속부분 GAUUU에 돌연변이를 일으킨 다음 생체내에서 이 돌연변이체가 가공되는지를 조사한 결과, 그것은 가공되지 않거나 매우 약하게 가공되는 것을 관찰하였는데 , 이 결과는 RNase E가 어떤 방식으로든 선구-Ml RNA의 가공에 관여한다는 것을 뒷받침해주는 증거로 생각한다. 또한, 우리 연구진,은 최근에 선구-Ml RNA의 가공효소를 부분 정제하여 그 특성을 조사한 바 있는데, 이 부분 정제한 가공효소는 선구M1 RNA의 +378번의 G 자리와 +379번의 A 자리뿐 아니라, +383번의 A 자리도 절단한다는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들을 종합해보면 선구-Ml RNA의 가공은, Apirion의 연구진이 제안한 바와 같이,5 한 가지 효소로 일어나는 것이 아니라 여러 효소들의 복합체인 processosome으로 일어나는 것으로 생각된다.
- 또한, 우리 연구진,은 최근에 선구-Ml RNA의 가공효소를 부분 정제하여 그 특성을 조사한 바 있는데, 이 부분 정제한 가공효소는 선구M1 RNA의 +378번의 G 자리와 +379번의 A 자리뿐 아니라, +383번의 A 자리도 절단한다는 것을 관찰하였다. 이러한 결과들을 종합해보면 선구-Ml RNA의 가공은, Apirion의 연구진이 제안한 바와 같이,5 한 가지 효소로 일어나는 것이 아니라 여러 효소들의 복합체인 processosome으로 일어나는 것으로 생각된다.
- 9 BamHl 인식자리를 가지고 있는 S-CGGGATCCATGAGTACCGCTAAATTA-3'과 Hindm 인식자리를 가지고 있는 3'-CCCAAGCnTATTCGATGTTAGACTC-5을 사용하여 균주 W3110에서 얻어낸 대장균의 염색체 DNA 1μg을 20회의 PCR로 증폭하여 약 520개 염기쌍을 가진 생성물을 얻었다. 이 생성물을 1.
- 이때 Dps 단백이외에 전기이동 겔상에서 빨리 이동하는 단백질 조각을 관찰하였는데 이는 단백질 정제 과정에서 C-말단의 아미노산 잔기들이 분해된 Dps 단백질 조각으로 생각된다. 순수하게 정제한 재조합 Dps 단백질과 Dps 단백질 조각은 그림 4에서 볼 수 있는 바와 같이 선구-Ml RNA를 절단하는 활성을 가지고 있었다. Dps 단백질이 선구-Ml RNA를 절단하는 위치는 +382번의 U 자리이었다.
- , 열처리, DEAE Sepharose 관 크로마토그래피, 황산암모늄 분별침전, Sephacryl S-200 관 크로마토그래피을 차례로 수행하였다. Sephacryl S-200 관 크로마토그래피로 분리한 단백질 분획에서 선구-Ml RNA 가공 활성이 두드러지게 나타나는 단백질 분획에 약 19-kD 크기의 단백질이 특이하게 존재하는 것을 알았다 (Fig. 1). 이 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과, 그것은 Dps 단백질로 판명되었다 (Fig.
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