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문제 정의
- 특히 색소의 경우 모두 분자당 1개 또는 그 이상의 R-SO3-(sulfonyl group)과 R-COO(carboxyl group)을 가진 이은성 물질이므로 이온쌍 시약인 TBA-Br를 첨가하여 비극성이온쌍을 형성시켜 역상계칼럼으로 분리 가능하다. 따라서 본 연구에서는 이 방법을 적용하여 우리나라에서 허용된 8종(알루미늄레이크 포함 15종)의 색소를 분석하고자 HPLC의 분석조건 및 C18 cartridge에 의한 정제과정을 검토하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 사용이 허가된 타르색소 8종에 대하여 식품중의 추출방법과 정제과정, 이온쌍시약을 이용한 고속액체크로마토그래프(HPLC)의 측정 조건을 검토하고 여러 식품에 적용함으로써 재현성과 간편성, 회수율, 분리능이 우수한 분석법을 개발하여 미량의 색소가 함유된 식품 및 다양한 종류의 식품을 용이하고 신속하게 분석하고자 하였다.
제안 방법
- C18 cartridge는 보유, 세척, 용출과정에 물 및 메탄올 등의 용매를 사용하나 모든 색소의 경우 색소보유 및 용출이 곤란하였으므로 색소의 pH에 관한 영향에 착안하여 이온억제(ion suppression) 법을 응용하고자 산을 첨가하여 실험을 실시하였다.
- HPLC에서 각 색소의 분리능 및 분석시간에 영향을 주는 주요인인 컬럼과 이동상의 조성, 이온쌍 시약의 농도에 대한 실험을 실시하였다.
- 색소의 분석은 M510 solvent delivery system, 717 autosampler, 486 UV detector가 부착된 Waters 사의 high performance liquid chromatograph를 이용하였으며 분석조건으로서 칼럼 종류와 이동상의 조성(용매의 조성, 이온쌍시약의 농도 및 염농도)을 검토하였고 각 색소의 검량선 및 검출한계를 구하였다. 또 정제용 C18 카트리지의 색소보유에 관여하는 산의 영향을 검토하기 위해 시료용액 중 산 및 농도를 조사하고 카트리지에 유된 색소를 용출하기 위한 용매에 혼합 할 산의 종류와 농도를 검토하였다.
- 메탄올, 아세토니트릴 및 초산암모늄농도의 비율이 고정된 싱태에서 이온쌍 시약으로 tetrabutylammoni-um bromide(TBA-Br)을 사용하여 농도별로 머무름시 간(Rt)값과 분리능을 검토한 결과를 Fig. 1에 나타내었다. TBA-Br의 농도가 높아질수록 색소와의 비극성 이온쌍이 증가되어 각 색소의 머무름시간도 증가되었으나 각 색소별로 차이가 있어 0.
- 이동상의 용매조성을 설정하기 위해 물과 메탄올, 아세토니트릴의 조성을 검토한 바, 물과 메탄올의 혼합액 또는 물과 아세토니트릴의 혼합액을 이동상으로 사용하였을 때는 색소의 분리가 양호하지 못하였다. 물-아세토니트릴-메탄올 혼합액을 사용한 경우는 메탄올의 비율을 증가시킬 때 색소의 머무름시간(reten tion time) 을 감소시켜 분리를 어렵게 하였으므로 메탄올의 비율을 10%로 고정시키고 아세토니트릴과 물의 혼합비율을 변화시켜 각 색소의 머무름시간을 비교하였다. R3를 제외한 7종 색소는 물과 아세토니트릴의 혼합비를 62%: 28%로 조정하였을 때 분리가 가장 양호하였으나 키산틴계 색소인 R3는 이온쌍을 형성하는 정도가 다른 색소에 비해 매우 커서 비극성도가 높아지므로 62%: 28%에서는 넓은 형태의 피크를 나타내어 정확한 정성 및 정량이 곤란하였다.
- 색소의 분석은 M510 solvent delivery system, 717 autosampler, 486 UV detector가 부착된 Waters 사의 high performance liquid chromatograph를 이용하였으며 분석조건으로서 칼럼 종류와 이동상의 조성(용매의 조성, 이온쌍시약의 농도 및 염농도)을 검토하였고 각 색소의 검량선 및 검출한계를 구하였다. 또 정제용 C18 카트리지의 색소보유에 관여하는 산의 영향을 검토하기 위해 시료용액 중 산 및 농도를 조사하고 카트리지에 유된 색소를 용출하기 위한 용매에 혼합 할 산의 종류와 농도를 검토하였다.
- 잔류물이 여전히 착색되어 있을 경우 는 1 N 염산 10 ml를 가해 상기 조작을 반복하고 모든 물층을 합한다. 석유에테르 또는 에틸에테르를 가해 가끔 흔들어주면서 30분간 방치하고 석유에테르 또는 에틸에테르를 증발농축하여 제거하는 조작을 2회 반복하여 모든 추출액을 합하고 진한염산을 사용하여 0.5% 염산 농도로 조정한 후 물을 가해 일정량으로 하였다.
- 시료 약 10g(착색의 정도에 따라 2-10g)을 취하여 필요한 경우 2배량의 물로 회석하고 원심분리(3, 500 rpm, 15분간)하여 불용물을 제거한 후 진한염산을 가하여 전량에 대해 0.5% 염산농도로 조정하여 일정량으로 하였다. 알코올을 함유한 시료의 경우는 수욕상에서 알코올을 증발시키고 잔류물에 물을 가해서 감량을 보충한 액을 동일하게 조작하였다.
- 즉, 각 모델식품에 혼합색소 표준용액을 첨가하여 각각의 색소 농도가 1μg/ml 또는 10μg/g이 되도록 흡착시켰다. 시료별 전처리방법을 이용하여 각 모델식품으로부터 색소를 용출시킨 후 정제용 Cis cartridge(Sep-pak C18, Waters사)를 통과시켜 상기에서 설정된 고속액체 크로마토그래피의 측정조건에 따라 전성ㆍ정량분석을 실시하고 회수율을 구하였다.
- 시판되고 있는 청량음료 캔디, 추잉검, 과자, 아이스크림, 젤리 중 색소를 함유하지 않은 것을 모델식품으로 선택하여 각 색소의 회수율을 조사하였다. 즉, 각 모델식품에 혼합색소 표준용액을 첨가하여 각각의 색소 농도가 1μg/ml 또는 10μg/g이 되도록 흡착시켰다.
- 식품공전의 산성타르색소 시험법16의 시험용액 조제를 약간 변형하여 시료별로 아래의 전처리방법을 행한 후 Waters사제(미국) Sep-pak C18 cartridge에 통과시켜 정제하였다. Sep-pak C18 cartridge는 사용 전에 메탄올 10ml 및 0.
- 고속액체크로마토그래프(HPLC)의 측정조건을 설정하기 위해 컬럼 및 이동상 조성을 검토한 결과, 컬럼은 Nova-pak C18이 가장 척절하였다. 이동상은 8종 색소의 분리를 위해 0.01 M tetrabutylammonium bromide가 함유된 0.025 M 초산암모늄-아세토니트릴-메탄올의 각 농도비별 capacity factor를 비교하여 분리능이 가장 우수한 62:28:10으로 설정하였고 단, 적색3호는 50:40:10으로 설정하였다. 두 개의 이동상을 구배용매조성법(gradient mode)으로 하여 측정하였을 때 색소의 분리능이 가장 우수한 것으로 나타났다.
- 이상에서 Sep-pak C18 cartridge를 통과시켜 용출된 액은 증발농축하고 물을 가하여 R3를 제외한 7종 색소에 대한 HPLC용 시험용액 A로 하였으며, R3는 산성조건하에서 물에 용해되지 않고 침전되므로 다시 같은 수기에 0.1N 수산화나트륨을 가하여 R3에 대한 HPLC용 시험용액 B로 하였다. R3가 시험용액 A와 시험용액 B 모두에서 검출되는 경우는 합산하여 정량하였다.
대상 데이터
- Tetrabutyl-ammonium bromide(TBA-Br)는 Sigma사(미국) 제품을 사용하였으며 기타 시약은 모두 분석용 특급 시약을 사용하였다. 또한, 식용타르색소 표준품으로 Tokyo Kasei사(일본) 제품을 시욤하였으며 식용색소청색제 1호(B1, Brilliant Blue FCF), 식용색소청색제2호(B2, Indigocarmine), 식용색소녹색제3호(G3, Fast green FCF), 식용색소적색제2호(R2, Amaranth), 식용색소적색제3호(R3, Erythrosine), 식용색소적색체40호(R40, Allura Red), 식용색소황색제4호(Y4, Tar trazine) 및 식용색소황색제5호(Y5, Sunset Yellow FCF)에 물을 가하여 혼합색소표준용액(0.
- Tetrabutyl-ammonium bromide(TBA-Br)는 Sigma사(미국) 제품을 사용하였으며 기타 시약은 모두 분석용 특급 시약을 사용하였다. 또한, 식용타르색소 표준품으로 Tokyo Kasei사(일본) 제품을 시욤하였으며 식용색소청색제 1호(B1, Brilliant Blue FCF), 식용색소청색제2호(B2, Indigocarmine), 식용색소녹색제3호(G3, Fast green FCF), 식용색소적색제2호(R2, Amaranth), 식용색소적색제3호(R3, Erythrosine), 식용색소적색체40호(R40, Allura Red), 식용색소황색제4호(Y4, Tar trazine) 및 식용색소황색제5호(Y5, Sunset Yellow FCF)에 물을 가하여 혼합색소표준용액(0.1g/l)을 조제하였다.
- 컬럼의 carbon loading량에 따라 Nova-Pak C18(내경 3.9 mm X 길이 300 mm, 4 μm, carbon 7%), Zorbax ODS(내경 4.6 mm x 길이 250 mm, 7 μm, carbon 17 %), μ-Bondapak C18(내경 3.9 mmx 길이 300mm, 10 μm, carbon 10%)의 세 컬럼을 대상으로 혼합색소의 분리능에 미치는 영향을 검토한 바, μ-Bondapak C18(내경 3.9mmx 길이 300mm, 10μm, carbon 10%)은 R40과 R2의 분리가 어려웠으며 Zorbax ODS(내경4.6 mm x 길이 250 mm, 7 μm, carbon 17%)는 분리능은 양호하였으나 다소 압력이 높아지는 경향을 보였으므로 이들 단점의 보완이 가능한 Nova-pak C18(내경 3.9 mm X 길이 300 mm, 4 μm, carbon 7%)을 본 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 1. 고속액체크로마토그래프(HPLC)의 측정조건을 설정하기 위해 컬럼 및 이동상 조성을 검토한 결과, 컬럼은 Nova-pak C18이 가장 척절하였다. 이동상은 8종 색소의 분리를 위해 0.
- 2. Sep-pak C18 cartridge를 이용한 색소의 정제방법은 0.5% 이상의 염산농도에서 색소가 모두 보유되었으며 색소의 용출액으로 0.1%의 염산메탄올 혼합액이 가장 적절한 것으로 나타났다.
- 3. 분석대상식품에 인위적으로 첨가한 8종 식용타르색소의 회수율을 검토한 결과 청량음료 81.2-98.0 %, 캔디 80.6-96.1%, 추잉검 79.8-96.3%, 과자 76.5-91.7%, 아이스크림 79.9-93.8%, 젤리 78.6-94/7%로 모두 양호한 결과를 나타내었다. 색소별 검출한계는 식용색소 청색제1호(BI), 청색져]2호(B2), 녹색제3호(G3)는 0.
- 물-아세토니트릴-메탄올 혼합액을 사용한 경우는 메탄올의 비율을 증가시킬 때 색소의 머무름시간(reten tion time) 을 감소시켜 분리를 어렵게 하였으므로 메탄올의 비율을 10%로 고정시키고 아세토니트릴과 물의 혼합비율을 변화시켜 각 색소의 머무름시간을 비교하였다. R3를 제외한 7종 색소는 물과 아세토니트릴의 혼합비를 62%: 28%로 조정하였을 때 분리가 가장 양호하였으나 키산틴계 색소인 R3는 이온쌍을 형성하는 정도가 다른 색소에 비해 매우 커서 비극성도가 높아지므로 62%: 28%에서는 넓은 형태의 피크를 나타내어 정확한 정성 및 정량이 곤란하였다. 따라서 아세토니트.
- 1에 나타내었다. TBA-Br의 농도가 높아질수록 색소와의 비극성 이온쌍이 증가되어 각 색소의 머무름시간도 증가되었으나 각 색소별로 차이가 있어 0.005 M에서는 Y5와 Y4, R40과 R2의 분리가 어려웠으며 0.015M에서는 Y4와 R40의 분리가 되지 않았지만 0.010 M에서는 모든 색소에 대해 양호한 분리를 얻을 수 있었다. 한편 TBA-Br을 첨가한 이동상은 색소의 용출시간이 길어 분석에 장시간이 걸리는 단점이 있으므로 TBA- Br와 함께 초산암모늄를 혼합하여 pH 를 낮추면 분석시간을 단축시키고 좁은 피크를 얻을 수 있어 TBA- Br 첨가에 따른 단점을 보완할 수 있다.
- 025 M 초산암모늄-아세토니트릴-메탄올의 각 농도비별 capacity factor를 비교하여 분리능이 가장 우수한 62:28:10으로 설정하였고 단, 적색3호는 50:40:10으로 설정하였다. 두 개의 이동상을 구배용매조성법(gradient mode)으로 하여 측정하였을 때 색소의 분리능이 가장 우수한 것으로 나타났다.
- 색소의 용출액으로 물~메탄올의 혼합액을 사용하였을 경우 모든 색소가 용출되지 않았으므로 0.1-0.5% 의 염산-메탄올 혼합액에 따른 용출을 검토한 바, 0.1% 이상의 염산-메탄올 혼합액에서 색소가 전량 용출되었다.
- 식용타르색소를 함유하지 않은 청량음료, 캔디, 추잉검, 과자, 아이스크림, 젤리 등 6종에 대해 각각 10 μg/ml가 되도록 각 색소혼합액을 흡착시킨 후 상기에서 확립된 방법에 의해 3회 반복실험 하여 회수율을 측정한 결과는 Table 2와 같다 청량음료에 첨가된 색소의 회수율은 81.2-98.0%, 캔디 80.6-96.1%, 추잉검 79.8-96.3%, 과자 76.5-91.7%, 아이스크림 79.9-93.8%, 젤리 78.6-94.7%로 모두 양호한 결과를 얻었다. 과자류나 아이스크림은 시료에 흡착된 색소가 전처리과정에서 완전히 용출되지 않거나 C18 cartridge에 대한 보유가 양호하지 못했기 때문에 회수율이 다른 식품군에 비해 다소 낮았다.
- 이온강도가 낮은 초산을 이용하여 색소를 cartridge에 보유시켰을 때에는 모두 용출되었으므로 이온강도가 높은 염산에 의한 cartridge 색소 보유를 검토하기 위해 0.1-1.0%로 염산 농도를 변화시켰을 때 0.5% 이상의 염산농도에서 Sep-pak Ci8 cartridge에 모든 색소가 보유되었다.
후속연구
- 국내에서 사용이 허가된 식용타르색소 8종(알루미늄테이크 포함 15종)에 대한 식품중 정성ㆍ정량 분석 방법을 검토하여 Sep-pak C18 cartridge를 이용한 고속액체크로마토그래프(HPLC)법을 확립하였으며 시판 식품을 대상으로 본 방법을 적용한 결과 식용색소분석에 유용하게 활용될 수 있으리라 생각된다. 이상에서 검토한 결과는 다음과 같다.
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