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문제 정의
- 본 연구에서는 마우스를 대상으로 실시한 강제수영 모델에서 세포성 면역반응 뿐만 아니라 체액성 면역반 응의 변화도 관찰하였다. Porsolt 등7)이 제안한 CD 마 우스모델은 6분간 1회의 강제수영 중에 마지막 4분간의 부동시간을 측정하였으나, BALB/c 마우스는 동일한 조건에서 다양한 실험군에 따른 뚜렷한 차이를 관찰 하기 힘들었다.
- 없다. 이에 본 연구는 항우울제, 스트레스, 신경내분비계 및 면역계를 연결하는 상호관계에 대하여 이해의 폭을 넓히고, 이를 바탕으로 우울증을 진단 치료하는데 있어서 우울증과 연관된 면역능의 변화로 인한 신체질환을 이해하는데 일조를 하고자 한다.
- 약제 모두에서 대체로 투여량에 따라 마우스의 부동 시간이 감소하는 경향을 보였다. 특히 paroxetinee 10mg kg, sertralinee 20㎎/㎏의 농도에서 강제수영에 의한 부동시간의 유의한 감소(p<0.01)를 보였으므로, 이농 도와 투여시간을 약물투여의 최적조건으로 설정하여 강제수영과 약물투여에 따른 면역반응의 변화를 알아보기 위한 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 2% agarose gel상에서 전기영동 하여 결과를 관찰하였다. RT-PCR의 일관성을 평가하기 위한 internal standard로서 glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자 증폭을 같이 실시하였다.
- lOmM dNTPs 각 2pl, 20U/P1 RNase inhibitor lpl, 50U/ p]의 역전사효소 Ipl, 15pM oligo dT primer Ipl 첨가액을 95tJ에서 2분간 변성시키고, RNA 1.5pg을 혼합한 후, nuclease가 없는 증류수로 최종용량을 2μ1로 맞추어 RT-mixture를 제작하였다. 역전사효소반응은 42℃에서 60분 99P에서 5분, -4P에서 5분간 반응시켰다.
- 면역을 실시한 7일 후 채혈하여 혈청을 분리하였다. 강제수영은 면역 주사하기 전과 후로 나누어 시행하여 실험하였다. 혈청내 anti-rat RBC 항체가 는 직접 혈구응집법으로 측정하였다.
- 강제수영이 체액성 면역반응에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 rat RBC에 대한 항체 생성 반응을 직접 적혈구 응집법으로 측정하였다. 일차적으로 면역과정과 강제수영과의 상관관계를 알아보기 위하여 강제수 영을 실시한 뒤에 rat-RBC로 면역주사한 실험군과 면 역주사를 한 뒤 강제수영을 실시한 실험군의 항체 역가 를 대조군과 비교한 결과, 면역주사 전에 강제수영을 실시한 실험군에서만 항체 생성반응이 유의하게 증가 하였으며(Fig.
- 첫 번째 강제수영은 15분간 실시하였으며, 강제수영 실시 후에는 마른 수건과 드라이어로 물기를 제거한 뒤에 다시 케이지에 넣어주었다. 두 번째 강제수영은 24시간 뒤에 6분간 실시하였으며 , 부동상태 판정은 마지막 4분 동안에 측정한 부동 시간(immobility timeX 백분율로 계산하였다. 각각의 실험군에는 5마리 이상의 마우스를 이용하였으며, 실험의 공정성을 위하여 약물 투입과 강제수영을 각기 다른 실험자가 실시하였다.
- 약물 투여는 첫 번째 강제수영을 실시한 직후. 두 번째 강제수영을 실시하기 5시간 혹은 1시간 전에 실시하고, 각각의 경우에서 두 번째 강제수영에 따른 부동 시간을 측정하여 , 대조군에 비하여 유의하게 감소하는 약물 투여 조건을 설정하였다.
- 두 번째 강제수영을 실시한 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 기계적으로 파쇄한 후, 거즈로 여과하여 단일 세포현탄액을 만들었다. 원심분리한 세포현탄액을 0.
- 6, P, S), 약제 자체가 항체 생성에 미치는 영향은 없었다. 따라서 강제수영으로 증가한 항체 생성반응에 미치는 약제 의 영향을 알아보기 위한 실험에서는 강제수영과 약제 투여를 앞에서 설정한 조건으로 실시한 이후에 rat RBC로 면역 주사한 실험군에서 항체가의 변화를 측정하였다. Paroxetine의 경우 강제수영으로 중가한 항체 역가가 대조군과 비슷한 정도로 회복됨을 보여 주었으 며, sertraline의 경우에도 유의한 감소효과를 관찰할.
- Porsolt 등7)이 제안한 CD 마 우스모델은 6분간 1회의 강제수영 중에 마지막 4분간의 부동시간을 측정하였으나, BALB/c 마우스는 동일한 조건에서 다양한 실험군에 따른 뚜렷한 차이를 관찰 하기 힘들었다. 따라서 본 실험에서는 24시간 간격을 두고 2회의 강제수영을 실시하였으며, 두 번째 6분간 강제수영 중에 마지막 4분간의 부동시간을 측정함으로 써 적합한 모델을 구축할 수 있었다.
- .따라서 이후의 모든 실험은 첫 번째 강제수영을 하고 말린 다음과, 두 번째 강제수영 1시간 전에 복강 주사하는 방식으로 시행하였으며, 이와 같은 조건으로 투여한 paro- xetine과 sertraline의 농도에 따른 부동시간의 변화는 Fig. 3과 같이 나타났다.
- 살아있는 세포의 계수는 trypan blue dye exclusion 법을 사용하였다. 림프구 증식반응을 측정하기 위하여 96 well flat-bottom culture plate에 세포 현탁액을 well 당 2.5x105가 되도록 넣고, 자극제로 concanavalin-A(ConA) 혹은 lipopolysaccharide (LPS)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일간 배양하였다. 배양종료 18시간 전에 [3H]-methylthy- midine(C3H]-TdR ; Amersham, Bucks, UK)을 wo 11 당 0.
- 마우스는 10마리씩 한 케이지에 넣고 항온항습이 유지되는 사육실에서 사육하였다. 멸균된 수돗물과 동물사료(삼양유지사료 주식회사) 만공급하고 가능한 한 스트레스를 받지 않도록 하였으며, 오전 7시부터 오후 7시까지를 낮 주기로 적용시켰다.
- 25μCi씩 넣어 주었다. 배양종료 후 cell harve- ster(Skatron, Norway)로 세포를 glass filter paper에 수거한 뒤 liquid scintillation counter(Beckman, U. S.A.)로〔3H〕-TdR의 incorporation 정도를 측정하였다. 결과는 평균 c.
- 24시간 배양하였다. 배양한 세포를 수거하여 세척한 후, 세포 침사에 ImM disodium EDTA, 100 mM NaCl, ribonucleoside vanadyl complex(Sig- ma) 25pl 및 1% Nonidet P-40을 함유한 냉각된 10 mM Tris-HCKpH 8.0) 완충용액 25014을 가하여 진탕하고 얼음 위에 30~60초 방치한 다음, 12,000 xg로원심분리 하였다. 원심분리 한 상등액에 0.
- 본 실험에서는 먼저 마우스를 실험모델로 강제수영을 통한 우울증 유발 기준치를 설정하고, 강제수영으로 야기되는 체액성 및 세포성 면역반응의 변화를 알아보았다. 이어서, 현재 임상에서 우울증 치료제로 사용중인두 가지 항우울제 (paroxetine과 sertraHne) 의 강제수영으로 인한 마우스 부동시간과 면역변화에 대한 영향을 알아보았다.
- RNA pellet을 75% ethanol로 세척하고 건조시킨 다음, DE- PC-water에 녹였다. 분리한 RNA는 UV-spectroph- otometer(Pharmacia., U.S.A.)로 순도 및 농도를 측정하고, 1% agarose-formaldehyde gel 전기영동으로 확인하였다.
- 생체내 면역 반응 검사에서 나타난 강제수영 및 약제 에 의한 면역조절능을 보다 상세히 해석하기 위하여 ConA로 자극한 비장 림프구 배양 세포로부터 RNA를 추출하여 IL-2, IFN-gamma, LT, IL-4, IL-6 및 IL•- 10의 cDNA를 RT-PCR 법으로 증폭시켜 비교하여 보 았다. 강제수영을 실시한 마우스에서는 아무런 처치를 하지 않은 마우스에 비하여 IL-2 유전자 발현의 감소와 IL-4 유전자 발현의 증가를 선명하게 확인할 수 있었으 며, LT와 IFN-gamma 유전자 발현에는 차이가 없었 고, IL7과 IL-10 유전자의 발현은 관찰할 수 없었다 (lane 2, 3).
- )은 dimethyl sulfoxide에 녹인 후, 20ml/kg의 일정한 양을 마우스 복강 내에 주사하였다. 약물투여에 대한 대조군은 멸균된 증류수만을 주사하였다.
- 세포현탄액을 만들었다. 원심분리한 세포현탄액을 0.85% Na4Cl 용액으로 처리하여 적혈구를 용해하고 3회 세척한 다음, 25mM HEPES, 100units/ml penicillin, 10μg/ml streptomycin, 10% heat-inactivated fetal calf serum 이 첨가된 RPMI-1640 배양액 (Gibco, Renfrewshire, UK)으로 적당한 농도가 되 게 희석하였다. 살아있는 세포의 계수는 trypan blue dye exclusion 법을 사용하였다.
- 이어서, 현재 임상에서 우울증 치료제로 사용중인두 가지 항우울제 (paroxetine과 sertraHne) 의 강제수영으로 인한 마우스 부동시간과 면역변화에 대한 영향을 알아보았다.
- PCR의 조건은 9SC에서 3분간 1회 반응시켜 DNA를 변성시킨 뒤, 951 1분, 6013 1분, 7213 40~90초를 IcycleS. 총 35회 반응시키고, 최종적으로 72tJ에서 7분간 DNA 합성을 연장시킨 후 1.2% agarose gel상에서 전기영동 하여 결과를 관찰하였다. RT-PCR의 일관성을 평가하기 위한 internal standard로서 glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자 증폭을 같이 실시하였다.
- 강제수영은 면역 주사하기 전과 후로 나누어 시행하여 실험하였다. 혈청내 anti-rat RBC 항체가 는 직접 혈구응집법으로 측정하였다. 혈청을 56C 수조에 30분간 방치하여 비동화 시킨 후, 96 well round bottom micmplate에 5Q4씩 2배 계단회석하였다.
- 혈청내 anti-rat RBC 항체가 는 직접 혈구응집법으로 측정하였다. 혈청을 56C 수조에 30분간 방치하여 비동화 시킨 후, 96 well round bottom micmplate에 5Q4씩 2배 계단회석하였다. 혈청이 회석된 plate의 모든 well에 0.
- 혈청을 56C 수조에 30분간 방치하여 비동화 시킨 후, 96 well round bottom micmplate에 5Q4씩 2배 계단회석하였다. 혈청이 회석된 plate의 모든 well에 0.5% rat RBC 용액을 50μl씩 분주하고 실온에 하룻밤 방치하여 응집을 관찰하였다. 응집을 나타낸 최고 혈청 희석배수의 역수를 구한 뒤 log2를 취하여 항체가로 나타내었다.
대상 데이터
- 두 번째 강제수영은 24시간 뒤에 6분간 실시하였으며 , 부동상태 판정은 마지막 4분 동안에 측정한 부동 시간(immobility timeX 백분율로 계산하였다. 각각의 실험군에는 5마리 이상의 마우스를 이용하였으며, 실험의 공정성을 위하여 약물 투입과 강제수영을 각기 다른 실험자가 실시하였다.
- 생후 6~12주된 암컷 BALB/c 마우스(대한 실험동물센터)를 실험기간 내내 사용하였다. 마우스는 10마리씩 한 케이지에 넣고 항온항습이 유지되는 사육실에서 사육하였다.
데이터처리
- )로〔3H〕-TdR의 incorporation 정도를 측정하였다. 결과는 평균 c.p.m.±표준편차(SD)로 표시하였다.
- 이상의 실험에서 독립집단간의 평균차이 검정은 비모수 검증법인 Mann-Whitney U test를 이용하였으며, 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.
이론/모형
- 실험에 사용된 사이토카인 primer의 종류와 염기서열 및 cDNA 크기를 Table 1에 정리하였다. RT-PCRe GeneAmp PGR system 2400(Perkin Elmer)을 이용하였다.
- 미치는 영향을 보기 위하여 증식정도를 3H-않는 것으로 나타났다. 강제수영을 실시하고 약제를 투여한 실험군에서 paroxetine의 경우 ConA에 대한 비장 림프구 증식반응은 대조군과 비슷한 정도로 회복됨 thymidine incorporation assay 법으로 측정하여 대조군과 비교하였다. T 세포에 대한 mitogen인 ConA 와 B 세포 mitogen인 LPS 모두에서 강제수영을 실시한 실험군의 증식반응이 감소하였다.
- 사이토카인 발현 검사를 하기 위하여 RT-PCR 법을 사용하였다. 실험에 사용된 사이토카인 primer의 종류와 염기서열 및 cDNA 크기를 Table 1에 정리하였다.
- 85% Na4Cl 용액으로 처리하여 적혈구를 용해하고 3회 세척한 다음, 25mM HEPES, 100units/ml penicillin, 10μg/ml streptomycin, 10% heat-inactivated fetal calf serum 이 첨가된 RPMI-1640 배양액 (Gibco, Renfrewshire, UK)으로 적당한 농도가 되 게 희석하였다. 살아있는 세포의 계수는 trypan blue dye exclusion 법을 사용하였다. 림프구 증식반응을 측정하기 위하여 96 well flat-bottom culture plate에 세포 현탁액을 well 당 2.
성능/효과
- 15분간 1회의 강제수영으로도 개체간의 큰 차이 없이 비교적 일정한 부동시간의 분포를 얻을 수 있었지만, 2회의 강제수영에 의한 부동시간의 분포는 다양한 실험군에서 재현성이 높은 기준치를 나타내었다. 따라서 이후의 실험에서 강제수영으로 유발되는 부동 시간은 두 번째의 6분간 강제수영에서 마지막 4분 동안의 부동 시간을 백분율을 환산하여 나타내었다(Fig.
- 강제수영을 실시하고 약제를 투여한 실험군에서 paroxetine의 경우 ConA에 대한 비장 림프구 증식반응은 대조군과 비슷한 정도로 회복됨 thymidine incorporation assay 법으로 측정하여 대조군과 비교하였다. T 세포에 대한 mitogen인 ConA 와 B 세포 mitogen인 LPS 모두에서 강제수영을 실시한 실험군의 증식반응이 감소하였다. 특히 대조군에서을 보여 주었으나.
- 강제수영이 ConA와 LPS에 대한 비장 림프구 증식반응에 미치는 영향을 보기 위하여 증식정도를 3H-않는 것으로 나타났다. 강제수영을 실시하고 약제를 투여한 실험군에서 paroxetine의 경우 ConA에 대한 비장 림프구 증식반응은 대조군과 비슷한 정도로 회복됨 thymidine incorporation assay 법으로 측정하여 대조군과 비교하였다.
- LPS에 대한 비장 림프구 증식반응은 약간 증가되는 양상을 보였다. 반면 Sertraline의 경우에는 강제수영에 의하여 감소된 비장 림프구 증식증식반응이 가장 높게 나타난 농도(ConA 5pg/ml, LPS lOFg/ml)에서 강제수영 실험군의 유의한 감소를 관찰할 수 있었으므로(p<0Ol), 이 농도를 기준으로 약제의 효과를 알아보기 위한 실험을 진행하였다(Fig. 4. ) 강제수영을 실시하지 않은 상태에서 동일한 조건으로 약제만을 투여한 결과, ConA와 LPS에 대한 비장 림프구의 증식반응은 대조군과 별다른 차이는 없었다. 반응의 회복은 관찰할 수 없었다(Fig.
- 강제수영을 실시한 마우스의 면역반응의 변화를 관찰 한 결과 T 세포와 B 세포 모두 mitogen(ConA, LPS) 에 대한 세포증식반응은 감소되어 있어 다른 연구자들 의 보고와 일치하였다. 반면에 강제수영을 실시한 마우 스의 항체생성반응은 증가함을 보여 면역반응의 해리 현상이 일어남을 알.수 있었다.
- 본 실험에서 강제수영에 의한 면역변화를 회복하는데 있어 sertraline의 작용이 약하게 나타난 것은 IL-10유전자의 발현이 지속되었던 것도 한가지 원인으로 생 각할 수 있었다.
- 그러나 본 실험에서의 II广6 유전자의 발현의 의미는 이 실험만으 로 규명할 수 없었다. 본 실험에서 강제수영을 실시한 경우에는 약제에 의한 IL-6 유전자 발현이 없어지는 것을 관찰할 수 있었다. Sertralinee IL-10 유전자의 발 현도 유도하였으며, 이는 약제만을 주사한 경우뿐만 아니라 강제수영과 함께 약제를 투입한 경우에도 계속 관 찰할 수 있었다.
- 본 실험에서 나타난 강제수영에 의한 면역반응의해 리현상은 ConA로 자극한 림프구가 분비하는 사이토카 인을 분석한 결과 해석할 수 있었다. 즉, 강제수영을 실시한 마우스의 T 세포에서 IL-2 유전자는 발현이 감소 한 반면 IL-4 유전자는 발현이 증가되었음을 확인함으 로써 세포매개성 면역반응은 억제되고 체액성 면역반 웅은 증강되었음을 알 수 있다.
- 본 실험에서는 paroxetine 혹은 sertraline 자체는 림프구 증식반응과 항체 생성 반응에 영향을 주지 않았 으나, 사이토카인 발현에 있어서 특이한 점이 관찰되었다. 약제만을 주사한 경우 두 가지 모두 IL~6 유전자의 미약한 발현을 야기하였다.
- 본 실험에서도 강제수영에 의한 부동시간이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (selective serotonin reuptake inhibitx)r, SSRI)인 paroxetine과 sertraline에 의하여 용량에 비례하여 효과적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, 강제수영으로 유발되는 80%의 부동 시간을 우울상태 판정에 적합한 기준으로 설정했을 때, 두 가지 항우울제를 강제수영 24시간 및 1시간 전에 복 강 주사한 실험군에서는 모두 기준치에 못 미치는 부동 시간을 나타내었다.
- 항체 생성에 있 어서도 강제수영에 의하여 증가된 반응은 paroxetine 과 sertraline에 의하여 회복되는 것을 관찰할 수 있었 으며, 이것 역시 강제수영으로 인하여 증가된 IL-4 유 전자 발현이 감소되는 것으로 부분적인 해석이 가능하다. 상기의 실험성적들은 모두 sertraline에 비하여 paroxetine에서 높은 결과를 보였다.
- 약물을 주사하는 스케줄에 따른 부동시간의 변화 여부를 관찰하기 위하여 각기 다른 시간대(두 번째 강제수영 실시하기 24시간, 5시간 혹은 1시간 전)에 약물을 복강 주사한 결과, 1시간 전과 24시간 전에 주사를 시행한 경우에서 실험성적이 가장 뚜렷하였다. .
- .약제 모두에서 대체로 투여량에 따라 마우스의 부동 시간이 감소하는 경향을 보였다. 특히 paroxetinee 10mg kg, sertralinee 20㎎/㎏의 농도에서 강제수영에 의한 부동시간의 유의한 감소(p<0.
- 이상의 결과들을 종합하면 본 실험을 통하여 BALB/ c 마우스 강제수영에 따른 행동양상을 우울증의 동물실험 모델로 확인할 수 있었으며, 이에 따른 체액성 및 세 포성 면역반응의 해리현상을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 행동양상과 면역변화는 SSRI계 항우울제 (paroxetine과 sertraline)에 의하여 효과적으로 회복되었다.
- 강제수영이 체액성 면역반응에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 rat RBC에 대한 항체 생성 반응을 직접 적혈구 응집법으로 측정하였다. 일차적으로 면역과정과 강제수영과의 상관관계를 알아보기 위하여 강제수 영을 실시한 뒤에 rat-RBC로 면역주사한 실험군과 면 역주사를 한 뒤 강제수영을 실시한 실험군의 항체 역가 를 대조군과 비교한 결과, 면역주사 전에 강제수영을 실시한 실험군에서만 항체 생성반응이 유의하게 증가 하였으며(Fig. 6. FST ； p<0.01). 일단 면역과정이 시 작된 이후에는 강제수영이 항체 생성에 영향을 주지 않았다.
- 본 실험에서도 강제수영에 의한 부동시간이 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (selective serotonin reuptake inhibitx)r, SSRI)인 paroxetine과 sertraline에 의하여 용량에 비례하여 효과적으로 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, 강제수영으로 유발되는 80%의 부동 시간을 우울상태 판정에 적합한 기준으로 설정했을 때, 두 가지 항우울제를 강제수영 24시간 및 1시간 전에 복 강 주사한 실험군에서는 모두 기준치에 못 미치는 부동 시간을 나타내었다. 강제수영에 의한 ConA로 자극한 경우의 림프구 증식반응의 감소와 IL-2 유전자 발현의 감소는 paroxetine을 주사한 경우에 효과적으로 회복 된 반면, LPS로 자극한 경우에는 약제에 의한 회복을 관찰할 수 없었다.
- 본 실험에서 나타난 강제수영에 의한 면역반응의해 리현상은 ConA로 자극한 림프구가 분비하는 사이토카 인을 분석한 결과 해석할 수 있었다. 즉, 강제수영을 실시한 마우스의 T 세포에서 IL-2 유전자는 발현이 감소 한 반면 IL-4 유전자는 발현이 증가되었음을 확인함으 로써 세포매개성 면역반응은 억제되고 체액성 면역반 웅은 증강되었음을 알 수 있다.
- 첫 번째 강제수영에서 마우스는 초기 3분 가량 동안 탈출구를 찾으면서 격렬하게 수영하였으나, 이후로 머리만 물 표면위로 내밀고 단순하게 물위에 떠 있는 자세를 취하는 부동시간이 증가하면서 8분이 경과한 다음에는 80% 이상의 대부분의 시간을 부동자세로 유지하였다 (Fig. 1).
- 이와 같은 행동양상과 면역변화는 SSRI계 항우울제 (paroxetine과 sertraline)에 의하여 효과적으로 회복되었다. 특히 paroxetine의 효과적인 면역보호 기능을 확인할 수 있었으며, sertralinee 자체가 면역억제에 일부 관여하는 것으로 보였다. 이러한 연구를 통하여 항우울제, 스 트레스, 신경내분비계 및 면역계를 연결하는 상호관계에 대하여 이해의 폭을 넓히고, 향후 이를 바탕으로 우울증 의 병태생리와 이와 결부된 신체질환의 발현에 대한 연구를 하는데 일조를 할 것으로 생각되었다.
후속연구
- 우울증에 있어서도 신경내분비계의 변화뿐만 아니라 면역계의 변화가 여러 사람에 의하여 보고되었으나, 면역계의 변화는 조사대상 환자의 조건에 따라 일부 상이한 연구결과를 보이는 부분도 많으므로, 환자를 대상으로 정확한 임상 조사결과가 이루어지기 위하여 대규모의 전향성 및 후향성 조사가 필요하다.
- 특히 paroxetine의 효과적인 면역보호 기능을 확인할 수 있었으며, sertralinee 자체가 면역억제에 일부 관여하는 것으로 보였다. 이러한 연구를 통하여 항우울제, 스 트레스, 신경내분비계 및 면역계를 연결하는 상호관계에 대하여 이해의 폭을 넓히고, 향후 이를 바탕으로 우울증 의 병태생리와 이와 결부된 신체질환의 발현에 대한 연구를 하는데 일조를 할 것으로 생각되었다.
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