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문제 정의
- 그러므로 국내에서 소에서만 발병한 구제역 바이러스가 돼지에도 전파되어 감염될 수 있는지 여부를 검증하고자 충북 충주의 한우(Korean native cow)에서 분리한 구제역 바이러스를 미국의 플럼아일랜드 동물 질병 연구소(Plum island animal disease center; PIADC)에 의뢰하여 이종동물(異種動物)간의 바이러스 특성 및 병원성을 파악하고자 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 면역염색”을 실시하였다. 1차 항체로서 구제역 혈청형 중 0 serotype에 specific하게 반응하는 Polyvalent GP serum(PIADC; APHIS)을 1:200으로 희석하여 16시간 감작시킨 후 biotinylated goat anti-rabbit linking serum을 30분간 반응시 킨 다음 alkaline(±osphatase conjugated-®- 20분간 처리 후 발색하여 Mayer's hema- toxylin으로 대조 염색하여 광학 현미경 상에서 관찰하였다.
- 구강의 혀에서도 발굽의 진피와 마찬가지로 기저막 (basa] membrane) 유래 구강 각질세포(oral keratinocytes) 스 전파를 모두 확인하였다(Fig lb). 감염 3일째 3두 중 가장 심한 증상을 보인 돼지 중 1두률 부검 하였다. 부검소견은 발굽, 구강의 혀, 그리고 후지의 피부에 수포 형성 외 하악 임파절의 종대가 관찰되었을 뿐 특이한 소견은 관찰할 수 없었다.
- 구제역 항체를 가지고 있지 않은 12개월령의 소 (Holstein) 1두에다 감염조직에서 분리한 바이러스액을 intradermolingual에 접종하여 질병전파 유무를 관찰하였다.
- 구제역 항체를 가지고 있지 않은 다른 12개월령의 소 1두와 4주령의 자돈 5두를 비접종군으로 사용하여 접종된 소로부터 접촉 감염 및 비접촉 감염에 의한 구제역 전파 그리고 그 질병의 임상증상 여부를 관찰하였다.
- 국내발생 구제역외 in vivo 내 병원성 연구를 위하여 소로부터 전파된 비접촉군 B 칸의 돼지 4두 중 가장 임상 증상이 심한 1두를 선택하여 H-E 및 Alkaline phosphatase 면역염색”을 실시하였다. 1차 항체로서 구제역 혈청형 중 0 serotype에 specific하게 반응하는 Polyvalent GP serum(PIADC; APHIS)을 1:200으로 희석하여 16시간 감작시킨 후 biotinylated goat anti-rabbit linking serum을 30분간 반응시 킨 다음 alkaline(±osphatase conjugated-®- 20분간 처리 후 발색하여 Mayer's hema- toxylin으로 대조 염색하여 광학 현미경 상에서 관찰하였다.
- 국가방역에 많은 혼선을 가져왔었다. 그래서 돼지 감염 가능성에 대한 과학적이 근거를 제시함으로써 이러한 혼선방지와 질병 이해에 도움을 주고자 국내 발생 구제역 분리주중 충북 충주의 한우에서 분리한 바이러스로 인공 감염시킨 소와 접촉 및 비접촉군 돼 지에서의 국내 구제역 바이러스 전파(傳播) 유무를 확인하였다. 감염이후 국내 구제역 바이러스가 다른 병원성이 높은 다른 주와 마찬가지로 인공 접종한 소와 직접 접촉한 돼지에서 감염 2일째 전형적인 구제역 임상 증상을 보였다.
- 그리고 각 well 당 100 W의 IBRS-2(Instituto Biologico Rim Suino pig kidney-2) cells(4X105 cells/m/)를 다시 분주하였다. 분주한 plate# 습도와 5% COj 분압이 유지되는 인큐베이터에서 3일간 배양 후 crystal violet로 염색한 다음 현미경상에서 CPE를 관찰하였다. 혈청중화항체m titer 는 Karber”의 방법에 따라 50% endpoint에서 결정하였다.
- 본 실험에서도 마찬가지로 소에서 돼지로 전파된 돼지의 혀와 발굽 조직에서 일반적인 현미 경적소견은 진피의 유극충을 구성하고 있는 각질세포의 감염으로부터 시작된다. 사실 이러한 현미경적 소견은 단지 구제역에만 국한되어 볼 수 있는 소견뿐만이 아니라 여러가지 수포성 질병인 수포성 구내염(vesicular stomatitis virus; VSV), 돼지수포병 (swine vesicular disease; SVD) 그리고 돼지수포성농창(vesicular exanthema of swine; VSE) 둥에서도 흔히 볼 수 있는 현미 경적소견으로서 구제역과 감별 진단에 어려움이 있다% 그래서 본 실험에서 구제역 혈청형중 O형에 특이하게 반옹하는 기니픽 항혈청을 이용하여 면역조직실험을 병행하였다. 일반적으로 감염초기(병변초기)의 혀와 발굽에서 아주 강하게 양성반응을 보인 반면 병변이 보다 더 진행된 곳에서는 양성반웅이 점점 약한 반응을 보였다.
- 칸막이로 나누어져 있는 동일 사육실(A: 왼쪽칸, B : 오른쪽칸) 내에 A 칸에는 국내 구제역 바이러스를 접종한 소 1두와 미접종 소 1두 및 돼지 1두를 접촉감염군으로 동거 사육시켰다. b 칸에는 미접종 돼지 4두만 비접촉 군으로 사육시켰다(Table 1)
- 공시 바이러스로 사용하였다. 항체가 측정을 위하여 접촉 및 비접촉 감염군으로 부터 0, 4, 7, 10, 14, 21 및 28째 각각 소와 돼지로부터 채혈한 혈청을 Ease's minimum essential medium(EMEM)에 1:20 부터 1:640 까지 희석하여 96 well에 50 W 분주한 후 각각의 다른 4 종류의 O type 바이러스를 100 TCIDsodtfTCIDso/SO ul 로 회석하여 50 W 씩 균일하게 분주한 다음 plate를 360 rpm에서 30초간 원심한 후 37℃에서 1시간 배양하였다. 그리고 각 well 당 100 W의 IBRS-2(Instituto Biologico Rim Suino pig kidney-2) cells(4X105 cells/m/)를 다시 분주하였다.
대상 데이터
- 구제역 바이러스(FMDV)의 혈청형(serotype O)에 따른 항체를 검사하기 위하여 4종류의 서로 다른 유럽, 아시아 및 남미 FMDV 혈청형인 0, Lombaidy(isolated from France), 0 Taiwan/97, Oj Campos(isolated from Brazil) 및 Q Manisa(isolated from Turkey) strains을 각각 공시 바이러스로 사용하였다. 항체가 측정을 위하여 접촉 및 비접촉 감염군으로 부터 0, 4, 7, 10, 14, 21 및 28째 각각 소와 돼지로부터 채혈한 혈청을 Ease's minimum essential medium(EMEM)에 1:20 부터 1:640 까지 희석하여 96 well에 50 W 분주한 후 각각의 다른 4 종류의 O type 바이러스를 100 TCIDsodtfTCIDso/SO ul 로 회석하여 50 W 씩 균일하게 분주한 다음 plate를 360 rpm에서 30초간 원심한 후 37℃에서 1시간 배양하였다.
- 국내 구제역 바이러스 분리주중 충청북도 충주 (serotype 0, Chungju isolate)의 한우에서 채취한 수포 및 조직표본을 공시재료로서 실험에 사용하였다. 먼저 구제역에 감염된 조직을 5m/의 MEM(minimal essential media) 조직 배양액에 부유시켜 호모게나이저를 이용하여 조직을 마쇄한 후 3000rpm에서 5분간 원심한 그 상충액을 0.
- 공시재료로서 실험에 사용하였다. 먼저 구제역에 감염된 조직을 5m/의 MEM(minimal essential media) 조직 배양액에 부유시켜 호모게나이저를 이용하여 조직을 마쇄한 후 3000rpm에서 5분간 원심한 그 상충액을 0.2 um filter를 이용하여 여과시킨 후 그 여과액 O.5m/(lXlO75TCID5o/mZ)< 접종 실험 재료로써 사용하였다.
이론/모형
- 분주한 plate# 습도와 5% COj 분압이 유지되는 인큐베이터에서 3일간 배양 후 crystal violet로 염색한 다음 현미경상에서 CPE를 관찰하였다. 혈청중화항체m titer 는 Karber”의 방법에 따라 50% endpoint에서 결정하였다.
성능/효과
- 1. 국내 구제역 바이러스 접촉군에서 소보다도 오히려 돼지에서 보다 빠르고 전형적인 임상증상을 나타내었다.
- 2. 비접촉 감염군인 돼지에서도 마찬가지로 3일째 4 두중 3두에서 전형적인 구제역 임상증상을 확인하였으며 7일째 나머지 1마리에서도 구제역 증상이 확인됨으로써 국내 바이러스가 다른 virulence가 높은 구제역과 같이 야외 돼지밀집사육지역에 노출되었을 때 경제적 손실을 예상할 수 있었다.
- 3. In vivo 내 면역조직화학 실험을 통해서 발굽, 혀 그리고 편도 등에서 조직변화 및 전형적인 구제역 양성반웅 세포를 관찰할 수 있었다.
- 4 종류의 서로 다른 subtype O FMDV 중 소와 돼지의 혈청 반응 모두 0( Manisa 주에서 비교적 높은 항체 가를 나타냄으로써 국내 FWV가 다른 유럽 및 남미의 구제역 subtype 보다도 아시아형 중에서도 Q Manisa 주에서 유사한 항원성(antigenicity)을 나타내었다. 이러한 결과에서 국내 백신주 선정에 있어서도 01 Manisa 주를 백신 antigen으로 선정한 구제역 백신은 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 Oi Campos 나 OW97 등을 antigen으로 사용한 백신보다도 효력 측면에서 볼 때 더욱 효과적일 것이다.
- 4. 혈청중화항체 실험을 통하여 국내 분리주가 다른 구제역 바이러스 subtype들에 비해서 특히 Q Manisa 주와 유사한 항원성을 가지고 있다는 것이 증명되었다.
- 요약한 것이다. 감염 24시간째 침울, 식욕부진 및 미약한 유연이 관찰되었으며 48시간째는 심한 유연과 수포 형성을 혀에서 관찰할 수 있었다. 그러나 비강 및 발굽에서의 수포형성은 관찰할 수 없었다.
- 그래서 돼지 감염 가능성에 대한 과학적이 근거를 제시함으로써 이러한 혼선방지와 질병 이해에 도움을 주고자 국내 발생 구제역 분리주중 충북 충주의 한우에서 분리한 바이러스로 인공 감염시킨 소와 접촉 및 비접촉군 돼 지에서의 국내 구제역 바이러스 전파(傳播) 유무를 확인하였다. 감염이후 국내 구제역 바이러스가 다른 병원성이 높은 다른 주와 마찬가지로 인공 접종한 소와 직접 접촉한 돼지에서 감염 2일째 전형적인 구제역 임상 증상을 보였다. 같은 돈방에 있는 인공 접종한 소와 직접 접촉한 미접종 돼지에서의 임상증상을 비교해 볼 때 미접종 돼지에서 더욱 뚜렸한 증상을 관찰할 수 있었다.
- 그러나 14일째 이후 하강하기 시작하였으며 소에서는 28일째까지 비교적 높은 항체가를 계속 유지하였다. 국내 분리 구제역 바이러스는 4종류의 FMDV 0 subtype중 14일째 다른 유럽 및 남미 등의 subtype O 형에 비하여 아시아 subtype O 중의 하나인 01 Manisa 주에서 가장 높은 바이러스 항체 가를 나타내었다.
- 양성반응을 관찰할 수 있었다. 발굽에서 전형적인 양성반웅의 세포는 주로 감염 초기 그리고 병변이 시작되는 부위의 각질세포에서 강한 양성반응을 관찰할 수 있었으며 , 또한 모구의 외근초세포(external root sheat of hair follicle)에서 구제역 바이 러스에 대한 강한 양^반응을 관찰할 수 있었다(Fig 3a, 3b). 혀에서도 마찬가지로 감염초기 유극충의 기저막 주위에서 감염이 시작되어(Fig 3c) 점차 병변이 확대되어 주위의 각질 세포에서 강한 양성반응을(Fig 3d) 보인 반면 수포를 형성한 병변일수록 면역염색성은 점차 약하게 관찰되었다(Fig 3e).
- 4 종류의 서로 다른 subtype O FMDV 중 소와 돼지의 혈청 반응 모두 0( Manisa 주에서 비교적 높은 항체 가를 나타냄으로써 국내 FWV가 다른 유럽 및 남미의 구제역 subtype 보다도 아시아형 중에서도 Q Manisa 주에서 유사한 항원성(antigenicity)을 나타내었다. 이러한 결과에서 국내 백신주 선정에 있어서도 01 Manisa 주를 백신 antigen으로 선정한 구제역 백신은 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 Oi Campos 나 OW97 등을 antigen으로 사용한 백신보다도 효력 측면에서 볼 때 더욱 효과적일 것이다. 한편, 국내 구제역 바이러스들은 서로 유전자 구조는 동일하거나 유사하다고 생각되나 야외에서 일어날 수 있는 백신효력 등과 관련된 국내 구제역 바이러스에 대한 세부적인 특성은 앞으로도 지속적인 연구를 통하여 규명되어야 할 것이다.
- 발생하였다. 이후 충남 홍성 및 보령, 경기 화성 및 용인, 충북 충주 둥 총 6개 지역 15개 사육농가에서 만이 구제역 양^으로 판정되었고 돼지 사육 농가에서의 발생은 한 건도 확인되지 않았다.
- 우선 인공감염 시킨 소(Bov#l)에서 감염 4일째부터 바이러스 항체가를 검출할 수 있었다. 접촉 및 비접촉 감염군의 소와 돼지에서 중화항체가는 7일째부터 상승하기 시작하였으며, 특히 접촉 감염군의 소 (Bov#2>와 돼지 (SW#7)에서 각각 채혈 7일째 감염 및 비접촉 감염군에 비하여 높은 항체가를 나타내었다. 그러나 일반적으로 모든 군에서 7일째부터 항체가가 상숭하기 시작하여 14일째 모든 O type 바이 러스에 대한 중화항체 최고치를 유지하였다(Fig 4a, 4b).
- 그러나 비강 및 발굽에서의 수포형성은 관찰할 수 없었다. 접촉군 소에서 감염 4일째부터 전형적인 임상증상이 구강에서 관찰되었고(Fig la), 발굽에서는 돼지의 병변에 비해서 미약한 육안적 소견만 나타내었다.
후속연구
- 그외 몽골리아 그리고 북한과 인접해 있는 러시아의 우수릴스크(UssuHysk)지방의 프리몰스키 (Primorsk*, )영역에서 잇따른 구제역이 발생한 것으로 보아 우리나라에도 앞으로 구제역 발생 빈도는 앞으로 한층 높아질 가능성을 배제하지 않을 수 없다. 그러므로 이 질병에 대한 연구는 지속적으로 진행되어야 할 것이다.
- 예를 들면 백신생산 및 백신주 선정에 있어서 무엇보다도 중요한 것은 야외주와 백신주 간의 밀접한 항원성 관계가 있어야 하며, 백신주의 안정성 또한 신중히 고려해야만 한다. 그리고, 대량 생산을 위한 세포배양 시 바이러스의 성장특성을 고루 갖추었을 때 최대한의 백신 효력을 얻을 수가 있을 것이다. 그렇지만 여전히 동물에 따라서는 백신 접종 후 일정한 혈중 항체가를 유지시키기 위해서는 2회에서 3회까지 추가 접종이 요구되기 때문에, 이 질병을 근절하기 위해서는 많은 시간과 노력이 소요됨을 알 수 있다.
- 이러한 결과에서 국내 백신주 선정에 있어서도 01 Manisa 주를 백신 antigen으로 선정한 구제역 백신은 본 실험의 결과로 미루어 볼 때 Oi Campos 나 OW97 등을 antigen으로 사용한 백신보다도 효력 측면에서 볼 때 더욱 효과적일 것이다. 한편, 국내 구제역 바이러스들은 서로 유전자 구조는 동일하거나 유사하다고 생각되나 야외에서 일어날 수 있는 백신효력 등과 관련된 국내 구제역 바이러스에 대한 세부적인 특성은 앞으로도 지속적인 연구를 통하여 규명되어야 할 것이다.
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