초록 ▼

4. 당해년도 중간결과 요약
ｏ 제1세부과제 : 차세대 염기서열분석법을 활용한 결핵균 신속동정법 개발
- 경기, 인천, 경북, 강원 지역 27개 농장 소 96두와 사슴, 야생 멧돼지 각 4, 3두로부터 총 170개 M. bovis균주를 분리하였음. 분리된 M. bovis에 대해 VNTR typing과 spoligotyping을 실시한 결과, 경기도 지역 3개 농장의 소 결핵병 감염우, 사슴, 야생 멧돼지 분리주는 spoligotype은 모두 SB0140였으며, A~C 농장에 모두 같은 지역 사슴, 야생멧돼지 균주와 동일한

4. 당해년도 중간결과 요약
ｏ 제1세부과제 : 차세대 염기서열분석법을 활용한 결핵균 신속동정법 개발
- 경기, 인천, 경북, 강원 지역 27개 농장 소 96두와 사슴, 야생 멧돼지 각 4, 3두로부터 총 170개 M. bovis균주를 분리하였음. 분리된 M. bovis에 대해 VNTR typing과 spoligotyping을 실시한 결과, 경기도 지역 3개 농장의 소 결핵병 감염우, 사슴, 야생 멧돼지 분리주는 spoligotype은 모두 SB0140였으며, A~C 농장에 모두 같은 지역 사슴, 야생멧돼지 균주와 동일한 VNTR pattern이 존재하였음. 새롭게 분리된 야생 멧돼지 분리주는 인접한 G 농장에 분리주와 VNTR pattern, spoligotype이 달랐으나, 포천 지역 분리 균주와 동일하였음. 이들이 역학적으로 관련이 있을 것으로 예상되므로 이들 균주를 대상으로 추후 pyrosequencing 등을 통해 target gene들의 polymorphism을 분석할 예정임.
- Pyrosequencing을 이용하여 glpK와 pykA 유전자 내 SNP를 분석하였음. M. bovis 분리 균주와 M. tuberculosis H37Rv의 염기서열이 일치하지 않아 구별 가능하였음. Direct primers를 이용하여 referencestrains 4주, 국내 분리주 2주의 ETR-D spacer sequence를 분석하였음. B-1595의 ETR-D는 691bp로 3개의 77bp repeat unit과 1개의 53bp repeat unit이 존재하고 75, 304번 위치에 SNP가 존재함. ETR-D 증폭산물의 크기를 통해 M. bovis BCG, M. tuberculosis H37Rv와 국내 분리주가 구별이 가능하였음. 다른 유전자 내 SNP를 추가 분석하여 신속 동정법을 보완할 예정임.

ｏ 제2세부과제 : 차세대 염기서열분석법을 활용한 결핵균 분자역학특성 분석
- Mycobacterium spp.는 세포벽의 특성으로 인해 DNA 추출이 어려우며 WGS 분석을 위해서는 높은 농도와 순도를 갖는 DNA 시료가 대량 요구되며 손상되지 않아야하므로 Mycobacterium spp.의 WGS를 위한 DNA 추출 방법을 정립하였음. DNA 추출 kit를 사용하고 신선한 균체를 이용하며, enzymatic lysis buffer에 Triton X-100을 첨가하고 RNaseA를 처리하여 고순도와 고농도의 DNA 추출이 가능하였음.
- WGS 마지막 단계인 PacBio 분석은 genomic DNA를 직접 sequencing하므로 보다 높은 quality의 DNA가 요구되어 농도와 순도를 높이기 위해 phenol:chloroform:isoamyl alcohol (PCI, 25:24:1)를 이용하여 DNA를 추출하는 새로운 방법을 정립하였음. 새로운 방법은 기존방법 보다 농도와 순도가 높았으며, 균체 양을 늘리고 elution volume을 줄여 최종적으로 26배 높은 농도의 DNA 추출이 가능하였음.
- PacBio 분석 시 많은 양의 DNA가 필요하기 때문에 대용량 추출을 위해 액체 배양하여 균체를 얻어 PCI를 이용하여 DNA를 추출하였음. 기존 방법에 비해 한 번에 많은 양의 DNA 추출이 가능함. 추출된 DNA는 시료기준에 적합하여 라이브러리 제작에 이용됨.
- M. bovis B-1595의 draft sequencing 결과, total sequencing coverage 697.89×, 전체 genome 사이즈 4.32Mb, 95개의 scaffold 내에 102개의 contig가 존재하는 형태로 assembly가 완료되었음. G+C content는 65.58%였으며 gene prediction 결과 4,228개 coding sequence가 규명되었음.
- M. bovis B-1595 유전체의 COG 분석 결과 가장 높은 비중을 차지하는 것은 지질 수송 및 대사 관련 유전자였음. M. bovis는 숙주 체내에서 지방산을 에너지원으로 사용하며 세포벽의 60% 이상이 지질로 구성되어 있기 때문에 지질 대사, 이동과 관련된 유전자가 중요할 것으로 사료됨.
- M. bovis B-1595와 AN5, AF2122/97, BCG Pasteur 1173P2, M. tuberculosis H37Rv를 comparative genomic analysis, ANI (average nucleotide identity) analysis 하였을 때, AN5, AF2122/97와 가장 근연도가 높아 99.97%의 유사도를 나타냈음. Clonality가 높은 균주들도 WGS가 구분 가능함이 확인되어 이것이 기존 분자역학 분석 기법보다 더 정교한 분석을 가능케 할 것으로 생각됨.
- M. bovis B-1595의 whole genome sequencing 결과, total sequencing coverage 146.4×, 전체 genome 사이즈 4.35 Mb, G+C content는 65.64 %였으며 4,257개의 protein, 45개의 tRNAs와 3개의 rRNAs 유전자를 보유함.
- M. bovis B-3222의 draft sequencing 결과, total sequencing coverage 186.21×, 전체 genome size 4.29 M, 89 개의 scaffold 내에 132 개의 contigs가 존재하는 형태로 assembly가 완료되었음. G+C 함량은 65.59%였으며 gene prediction 결과 4,160개 CDS가 규명되었음.
- M. bovis B-3222 균주를 대표적인 균들과 B-1595 (FLX sequencing)의 ORF를 통해 유사도를 비교하였을 때, 100% 일치하는 ORF가 가장 많은 strain은 B-1595 (90.29%), AN5 (84.34%), AF2122/97 (81.85%)순이었음.
- 추가로 진행된 M. bovis B-1595 (FLX sequencing)와 B-3222 (draft sequencing)을 포함하여 표준균주들과 ANI value를 토대로 계통도를 작성하였을 때, B-1595와 B-3222간의 유사도가 99.98%로 높았음.
- Whole genome alignment 결과, 현재 draft sequence에서는 CDS들의 순서가 모두 밝혀져 있지 않아 분석이 제한적이었음.
- Sanger seqeuncing method에 적합한 primer를 작성하여 M. bovis 국내 분리주 5주에 대해 15개 target gene의 SNP를 분석하였음. 영국에서 분리된 M. bovis 균주들의 분석 결과와 본 연구의 phylogeny를 비교 시,sublineage 6 보다 하위 단계에서만 일치하는 양상을 나타냄. 따라서 국내 균주의 특성에 맞게 SNP marker를 선정하여 보다 정교한 계통 분석이 가능함.
- 국내 분리 균주 M. bovis B-1595, B-3222와 M. bovis BCG를 비교하여 SNP/InDel 분석하였음. B-1595는 총 1374개의 SNPs가 있으며 1177개의 ORF, 197개의 intergenic region에 존재함. B-3222는 총 1213개의 SNPs가 있으며 1052개의 ORF, 161개의 intergenic region에 존재함.
- Mycobacterium spp.에서 virulence factors와 연관된 유전자 84 genic SNP site를 선정하여 비교하였음. B-1595, B-3222는 각 117, 107개의 SNPs가 존재하였고 두 분리 균주 간 SNPs 변화는 매우 유사하였음.특정 SNP site를 중점으로 국내 분리 균주들을 추가 분석할 예정임.

(출처 : 4. 당해년도 중간결과 요약 1p)

목차 Contents

• 표지 ... 1
• Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
• 1. 연구배경 ... 4
• 2. 연구최종목표 ... 5
• 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
• Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
• 1. 재 료 ... 6
• 2. 연구전략 및 방법 ... 6
• III. 연구결과 ... 7
• 1. 제1세부과제명 : 차세대 염기서열분석법을 활용한 결핵균 신속 동정법 개발 ... 7
• 2. 제2세부과제명 : 차세대 염기서열분석법을 활용한 결핵균주의 분자역학적 특성 분석 ... 16
• Ⅳ. 연구결과요약 ... 53
• Ⅴ. 금후 추진계획 ... 54
• Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 55
• Ⅶ. 연구사업 추진상 문제점 및 건의사항 ... 55
• Ⅷ. 주요연구과제 변경사항 ... 55
• 끝페이지 ... 55