부루세라백신(RB51)의 안전성에 관한 연구 I. Brucella abortus RB51 백신균주의 생화학적 및 유전학적 성상비교 Studies on the safety of Brucella abortus RB51 vaccine I. Comparison of the biochemical and genetic characteristics of Brucella abortus RB51 vaccine strains원문보기
Biochemical and genetic analysis were carried out to investigate the potential recovery of pathogenecity or related mutations of Brucella abortus RB51 vaccine strains. RB51 strains were recovered from commercial vaccines, including related seed stocks from private companies in Republic of Korea, str...
Biochemical and genetic analysis were carried out to investigate the potential recovery of pathogenecity or related mutations of Brucella abortus RB51 vaccine strains. RB51 strains were recovered from commercial vaccines, including related seed stocks from private companies in Republic of Korea, strain from USA, a reference strain from C university and a field isolate (Daehungjin) from aborted dairy cow after RB51 vaccination were compared with two identified virulent wild strains (S2308 and a field strain isolated from dairy cow in Korea) at the same conditions. All the strains examined, except identified pathogenic strains, revealed the identical characteristics to the original RB51 in biochemical properties, antigen and bacteriophage typing. Outer membrane protein (OMP) profiles from strains of RB51 showed the same patterns with standard RB51 in SDS-PAGE. In addition, Western blotting with the brucella specific monoclonal antibody also indicated that all the vaccine strains were completely deficient in their LPS compared to the pathogenic Br abortus strains. The differences in DNA structures among strains were also possible to detect after PCR. All vaccine strains, except S19, S1119-3, S1075, S544 and Br suis, were amplified a 178bp DNA fragment of eri-gene, and 364bp of IS711 elements. In contrast, 498bp DNA product was only found with Br abortus. Overall evidences in the present study confirmed that the RB51 strains for vaccine production in Korea did not originated from the phenomena of possible recovery of pathogenicity or related to any potential mutation event at all.
Biochemical and genetic analysis were carried out to investigate the potential recovery of pathogenecity or related mutations of Brucella abortus RB51 vaccine strains. RB51 strains were recovered from commercial vaccines, including related seed stocks from private companies in Republic of Korea, strain from USA, a reference strain from C university and a field isolate (Daehungjin) from aborted dairy cow after RB51 vaccination were compared with two identified virulent wild strains (S2308 and a field strain isolated from dairy cow in Korea) at the same conditions. All the strains examined, except identified pathogenic strains, revealed the identical characteristics to the original RB51 in biochemical properties, antigen and bacteriophage typing. Outer membrane protein (OMP) profiles from strains of RB51 showed the same patterns with standard RB51 in SDS-PAGE. In addition, Western blotting with the brucella specific monoclonal antibody also indicated that all the vaccine strains were completely deficient in their LPS compared to the pathogenic Br abortus strains. The differences in DNA structures among strains were also possible to detect after PCR. All vaccine strains, except S19, S1119-3, S1075, S544 and Br suis, were amplified a 178bp DNA fragment of eri-gene, and 364bp of IS711 elements. In contrast, 498bp DNA product was only found with Br abortus. Overall evidences in the present study confirmed that the RB51 strains for vaccine production in Korea did not originated from the phenomena of possible recovery of pathogenicity or related to any potential mutation event at all.
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문제 정의
의문이 제기된 바도 있다. 본 연구에서는 국내 2개 동물약품제조사의 백신과 종균주, 미국백신, 백신 접종한 후에 유산한 젖소에서 분리한 RB51 균주 및 RB51 표준균주 등을 공시하여 각종 생화학적 성상, 균체 구조성분 및 유전자분석 비교시험을 실시하여 균주의 변이 여부를 규명하고자 하였다.
제안 방법
1%) 용액에서의 자가응집성, crystal violet 염색성 등의 일반성상을 Schurig et.,at3과 Manual4에 따라 A, M, R 항원형은 형별 인자혈청을 이용하여 응집반응으로, phage typinge Tbilisi (Tb), R, R/O bac- teriophage를 이용하여 용균성으로 시험하였다.
5℃에서 2분, 72C에서 2분간 35회 반복하여 증폭시 켰다. 72℃ 에서 5분간 final extension 후 증폭된 DNA 10μl를 2% agarose gel에서 전기영동하고 ethidium bromide로 염색한 다음 DNA band를 자외 선 조사하여 확인 및 사진 촬영하였다.
제조한 oligonucleotide primerfi] sequences는 Br abortus specific primer; 5-GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC-3', RB51/2308 primer; 5'-CCC CGG AAG ATA TGC TTC GAT CC-3', eri-gene primer 1; 5'-GCG CCG CGA AGA ACT TAT CAA-3', eri-gene primer 2; 5'- CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA-3', IS711 specific primer; 5'-TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT-3' 이다. PCR 반응용액은 60mM Tris-HCl(pH 9.0), 15mM (NH4)2SO4, 1.5mM MgCl2, 250pM 4-deoxynucleoside triphosphates, 5 primer cocktail(각 0.2pM Br abortus specific, RB51/2308, 2 eri-gene, IpM IS711-specific primer)로 조성하였다. PCR 반응용액 45pl당 limit의 Taq polymerase를 첨 가하고 PCR tube에 분주한 후 PCR 반응용액 25μ1당 2.
SDS-PAGE 및 Western blot 분석 : OMP 및 LPS 항원에 각각 동량의 2x Laemmli sample buffer를 넣어 혼합하고 1003 5분간 처리하였으며, 전기영동은 Hoefer Mighty Small H unit를 이용하여 12.5% acrylamide gel 에서 실시하였다. 항원전개가 끝난 후 OMP는 silver stain 하였고, LPS는 nitrocellulose membrane에 전사시켜 Br abortus LPS O-chain 특이 단크론항체로 하루밤 처리하고, 세 척 후 horseradish peroxidase anti-IgG conjugate와 1시간 반응시켜 세척 한 다음 4-chloro-l-naphthol로 발색시켰다.
균체 구조성분 분석 : 균체구조의 변이를 조사하기 위하여 균으로부터 추출한 외막단백질(OMP)의 전기영동 양상을 silver stain하여 비교분석한 결과는 Fig 1 및 2와 같다. Fig 1의 A사 백신주, 미국백신주, 분리주 대홍진, B사 종균주, A사 종균주, C대학 보유균주의 세포 외막단백질 양상이 RB51 표준주와 유사하였고 국내분리 병원성 부루세라 균주와 S2308주와는 부분적인 차이를 나타내었다.
부루세라 백신(RB51) 균주의 변이 및 병원성 복귀 여부 규명에 의한 안전성평가 시험의 일환으로 RB51 균주별(국내 A, B사 백신 및 종균주, C대학 보유균주, 미국 백신 주와 백신접종후에 유산한 젖소에서 분리한 균주) 생화학적 성상과 균체 구조성분 및 유전자분석 시험을 실시하였다.
반복수집 한 phenol층을 합하여 661 증류수로 5회 세척한 후에 LPS는 phenol층 5배 량의 찬 methanol 시 약(99:1, methanol: sodium acetate로 포화시 킨 methanol)을 가하여 4R 1시간동안 저으면서 phenol 층으로부터 추출하였다. 여기서 생긴 추출물을 원심수집하고 10ml 증류수에 녹여 하루밤 투석하여 동결건조하였다.2mg의 동결건조한 LPS를 1ml의 Tris buffer에 부유시 켜, 각 50μl의 DNase와 RNase(Sigma)를 넣고 37℃, 1시간반응시켰다.
균체는 4℃ 13, 000xg로 5분간 원심한 후에 증류수로 1회 더 세척하고 다시 45ml 증류수에 부유시켰다. 여기에 55ml 의 95% phenol을 가하고 68P, 40분간 세포를 처리하고 4t, 17, 000xg로 10분간 원심하여 phenol 층을 수집하고 50ml의 phenol을 세포부유액에 가하여 반복추출하였다. 반복수집 한 phenol층을 합하여 661 증류수로 5회 세척한 후에 LPS는 phenol층 5배 량의 찬 methanol 시 약(99:1, methanol: sodium acetate로 포화시 킨 methanol)을 가하여 4R 1시간동안 저으면서 phenol 층으로부터 추출하였다.
유전자 분석 : RB51 특이유전자 분석은 Bricker와 Hailing6, Bricker와 Hailing, 의 PCR 방법을 modify 하여 수행하였다. 즉, 부루세라균을 Brucella agar에서 37tJ, 48시간 배양하고 methanol-saline에 수집, 부유시켜 살균하였다.
마지막으로 4℃에서 300xg로 10분간 원심하고 상층액을 수집하여 동결건조하여 crude cell wall로 사용하였다. 이것의 일부를 투과율이 5%(525mm) 되 게 식 염수에 부유하고 sonic dismembrator(Fisher scien- tic)로 35% power에서 30초간 2회 sonication하여 동결건조하였다. 2.
즉, OMP를 추출하기 위하여 Trypticase soy agar(TSA) 에서 균을 37P, 48시간 배양하여 멸균증류수에 수집한 후 121℃, 15분간 autoclave 하였다. 여기에 초자구(0.
즉, 부루세라균을 Brucella agar에서 37tJ, 48시간 배양하고 methanol-saline에 수집, 부유시켜 살균하였다. Methanol을 제거하기 위하여 증류수로 1회 원심세척후균탁도를 600nm에서 0.
항균물질 감수성 시험 : 공시 균주를 Brucella broth에서 37P, 48시간 배양한 후 균 탁도를 MacFarland scale 0.5 되 게 조절 하고, Muller Hinton agar 평 판의 두께를 4mm로 하여 Ampicillin(AM, 10μg), Cephalothin(CF, 30μg), Cefazolin(CZ, 30μg), Chloramphenicol(CM, 30μg), dindamycin(CC, 2μg), Erythromydn(EM, 15μg), Gentamicin(GM, 10μg), Kanamydn (KM, 30μg), Nalidixic acid(NA, 30μg), Neomycin(NM, 30μg), Nitrofurantoin(F/M, 300μg), Streptomycin(SM, lOμg), Trimetho- prim/sulfamethoxazole(SXT, 1.25/23.75μg), Vancomycin(Va, 30μg) 등 14종의 항균제디스크(BBL)를 이용하여, WHO 표준법5에 따라 시험하였다.
대상 데이터
공시균주 : Br abortus RB51 균주로는 국내 A 및 B 제조회사의 종균주와 백신주, C대학교 보유균주, 백신 접종한 후에 유산한 젖소에서 분리한 균주(대홍진), 미국의 표준 균주 및 백신주(Professional Biological Company)# 공시하였고, 대조균주로 미국 국립동물질 병연구소 (National Animal Disease Center)에서 보유하고 있는 Br abortus S19, S1075, S544 및 Br 를 이용하였다.
1 % Tween 20)를 가하고 1003 5분간 boiling한 후에 20,000×g, 2분간 원심하여 상층액을 분리하여 PCR에 사용하였다. 제조한 oligonucleotide primerfi] sequences는 Br abortus specific primer; 5-GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC-3', RB51/2308 primer; 5'-CCC CGG AAG ATA TGC TTC GAT CC-3', eri-gene primer 1; 5'-GCG CCG CGA AGA ACT TAT CAA-3', eri-gene primer 2; 5'- CGC CAT GTT AGC GGC GGT GA-3', IS711 specific primer; 5'-TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT-3' 이다. PCR 반응용액은 60mM Tris-HCl(pH 9.
이론/모형
균체외막단백(OMP) 분리정제 : 공시균체로부터 지당체 및 외 막단백 추출은 Schurig et al의 방법에 따랐다. 즉, OMP를 추출하기 위하여 Trypticase soy agar(TSA) 에서 균을 37P, 48시간 배양하여 멸균증류수에 수집한 후 121℃, 15분간 autoclave 하였다.
지당체(lipopolysaccharide, LPS)가 결손된 백신 균주의 변이에 따른 LPS 재생성 유무를 조사하기 위하여 균으로부터 지당체(LPS)를 추출하고 LPS O-side chain 특이단크론항체를 이용하여 western blotting 법으로 시험한 결과는 Fig 3과 같다. RB51 표준균주와 A사 백신주, 미국 백신주, 분리주 대흥진, B사 종균주, A사 종균주, C 대학 보유균주 등의 RB51 균주에서는 지당체를 확인할 수 없었으나 국내분리 야외 병원성균주와 S2308에서는 뚜렷하게 지당체를 확인할 수 있었다.
성능/효과
유전자진단법으로 신속하면서도. 100%의 특이성과 민감성으로 부루세라 균종을 동정할 수 있다고 하였으며 , Bricker와 Hailing'은 Br abortus 특이 primer, RB51 특이유전자 및 eri-gene 특이 primer로서 부루세라 균종간은 물론 eri-gene이 없는 S19와도 감별이 가능하다고 하였다. Br abortus, RB51 및 eri-gene 특이primer를 이용한 PCR 시험결과 국내 A, B사의 백신주에서는 498bp의 Br abortus 특이유전자, 364bp의 RB51 특이유전자 및 178 bp의 eri-gene 특이유전자를 RB51 표준균주에서와 동일하게 검출할 수 있었으며, 다른 부루세라균종과도 명확하게 구별할 수 있었다.
100%의 특이성과 민감성으로 부루세라 균종을 동정할 수 있다고 하였으며 , Bricker와 Hailing'은 Br abortus 특이 primer, RB51 특이유전자 및 eri-gene 특이 primer로서 부루세라 균종간은 물론 eri-gene이 없는 S19와도 감별이 가능하다고 하였다. Br abortus, RB51 및 eri-gene 특이primer를 이용한 PCR 시험결과 국내 A, B사의 백신주에서는 498bp의 Br abortus 특이유전자, 364bp의 RB51 특이유전자 및 178 bp의 eri-gene 특이유전자를 RB51 표준균주에서와 동일하게 검출할 수 있었으며, 다른 부루세라균종과도 명확하게 구별할 수 있었다. 이에 따라 국내사용 RB51 백신 균주는 유전자 구조면에서도 정상적임이 확인되었으며, 이 multiplex-PCRe 앞으로 각종 가검물에서 분리되는 부루세라균의 신속, 정확한 동정에 유용하게 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
백신의 변이유무를 확인하기 위한 세포 외 막 단백(OMP) 분석시험 결과 단백구조 양상이 유사하였고, 지당체(LPS)는 병원성 부루세라균주 외에는 백신 및 종균주에서는 확인되지 않았다. Multiplex-PCR에 의한 유전자 분석결과 국내생산 백신 및 종균주에서 소부루세라균 특이유전자(498bp), eri 유전자(178bp) 및 RB 51 특이유전자(364bp)를 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 국내의 소 부루세라백신 생산용 종균주와 백신주는 Brucella abortus RB510]유전적으로 정상이고 균체 구조성분(OMP, LPS)의 변이는 없는 것으로 확인되었다.
시험한 결과는 Table 3과 같다. NA에는 A사 백신 주가 중등도의 감수성을 나타내었고 이외의 나머지 균주는 내성을 나타내었으며, CC에는 A사의 백신 주만이 감수성을 보였으며 B사 백신주, C대학 보유균주 그리고 미국백신주는 중등도의 감수성을 나타내었다. 이외 의 CF 둥 12종의 항균제 에는 모두 감수성을 나타내 었으나 AM, CF, CZ, NA, Va의 경우 A사 백신주의 억제 환이 다른 균주에 비하여 크게 나타났다.
Fig 3과 같다. RB51 표준균주와 A사 백신주, 미국 백신주, 분리주 대흥진, B사 종균주, A사 종균주, C 대학 보유균주 등의 RB51 균주에서는 지당체를 확인할 수 없었으나 국내분리 야외 병원성균주와 S2308에서는 뚜렷하게 지당체를 확인할 수 있었다.
반면에 RB51 표준 균주와 A사 백신주, B사 백신주에서는 Br abortus, RB51, eri 특이유전자 모두가 검출되었다. RB51 표준주, B사 백신주, A사 백신주, B사 종균주, C대학 보유주, A사 종균주, 미국 백신주, 대홍진에서는 498bp의 Br abortus 특이유전자, 364bp의 RB51 특이유전자 그리고 178 bp의 eri-gene 특이유전자가 모두 검출되었으나 야외분리 병 원성 균주에서는 364bp의 RB51 특이유전자가 검 출되지 않았고, 1119-3주에서는 RB51 및 eri 특이유전자가 검출되지 않았다.
백신을 접종한 임신소에서 유산이 발생하므로써 야기된 가장 큰 관심의 초점은 백신균주가 연속계대되어 변이가 일어나 LPS가 생성되므로서 병원성이 복귀되지 않았나 하는 것이었다. 공시균주에서 LPS룰 추출하고 western blotting으로 LPS 유무를 조사한 결과 표준 RB51 을 포함하여 국내 A, B사 백신주 및 종균주, C 대학 보유 균주 그리고 대홍진주에서는 LPS를 확인할 수 없었던 반면에 국내분리 부루세라 야외 병원성 균주와 S 2308에서는 전기영동상에서 넓게 확산되어 전개된 IPS 를 명확하게 확인할 수 있었다. 이에 따라 국내사용 백신 및 종균주는 변이에 의한 LPS 형성으로 병원성이 복귀한 것이 아니었음을 증명할 수 있었다.
균주별 생화학적 성상비교 : 국내 백신제조 A, B 사의 종균 주와 백신균주, 미국백신주, C대학 보유균주 그리고 백신 접종 후 유산한 젖소에서 분리한 균주(대홍진)에 대하여 그람염색상 등 28종의 형태학적, 생화학적 성상과 항원 형, 파지형을 비교한 결과 모든 성상이 Br abortus RB51 표준균주의 성상과 일치하였고 시험한 균주 간에도 차이가 없었다(Table 1, 2).
그람염색상 등 28종의 생화학적성상, 항원형 및 파지형 시험 결과 전반적인 성상이 표준균주의 성상과 일치하였고 균주간에도 동일하여 공시균주들은 RB51 임을 확인할 수 있었다. 백신의 변이유무를 확인하기 위한 세포 외 막 단백(OMP) 분석시험 결과 단백구조 양상이 유사하였고, 지당체(LPS)는 병원성 부루세라균주 외에는 백신 및 종균주에서는 확인되지 않았다.
그리고 BrsWs 에서는 Br abortus 와 RB51 유전자가 검출되지 않았으며 eri 유전자만을 검출할 수 있었다(Fig 4). 반면에 RB51 표준 균주와 A사 백신주, B사 백신주에서는 Br abortus, RB51, eri 특이유전자 모두가 검출되었다. RB51 표준주, B사 백신주, A사 백신주, B사 종균주, C대학 보유주, A사 종균주, 미국 백신주, 대홍진에서는 498bp의 Br abortus 특이유전자, 364bp의 RB51 특이유전자 그리고 178 bp의 eri-gene 특이유전자가 모두 검출되었으나 야외분리 병 원성 균주에서는 364bp의 RB51 특이유전자가 검 출되지 않았고, 1119-3주에서는 RB51 및 eri 특이유전자가 검출되지 않았다.
수 있었다. 백신의 변이유무를 확인하기 위한 세포 외 막 단백(OMP) 분석시험 결과 단백구조 양상이 유사하였고, 지당체(LPS)는 병원성 부루세라균주 외에는 백신 및 종균주에서는 확인되지 않았다. Multiplex-PCR에 의한 유전자 분석결과 국내생산 백신 및 종균주에서 소부루세라균 특이유전자(498bp), eri 유전자(178bp) 및 RB 51 특이유전자(364bp)를 확인할 수 있었다.
본 연구에서 A, B사의 RB51 백신주와 종균주, C 대학 보유 RB51 균주, 미국 RB51 백신주 그리고 백신접종후 유산한 젖소에서 분리한 RB51 균주(대홍진) 등에 대한 urease외 27종의 각종 성상을 시험한 결과 RB51 특이 성상인 R type 집락, 발육조건으로 CQ와 혈액성분 불요 구, 0.1% acriflavin 용액에서 응집, R 항원형, Tb- 파지형 등 모든 성상이 일치하여 이들 모든 균주는 RB51 균주임을 확인할 수 있었다.
W25,000- 30,0000)의 주요 단백질이 있으며 지당체가 없는 R type 부루세라균은 2, 3군을 공통으로 보유하고 있고 OMP의변이는 배양조건이 다른 상태에서 배양시 발생한다고 하였다. 본 연구에서 국내 A, B사의 백신주 및 종균주, C대학 보유균주, 대흥진주 그리고 미국백신주의 세포 외막단백질을 추출하여 silver stain으로 염색하여 단백질 양상을 비교한 바, 단백질 양상이 S2308과는 다소 차이를 보인 반면, RB51 표준균주와는 모두 일치하였고 R type 공통단백군인 2, 3군의 단백성분을 보유하고 있음이 확인되어 균체의 주요 구성분에 변이가 없었음을 확인할 수 있었다.
Multiplex-PCR에 의한 유전자 분석결과 국내생산 백신 및 종균주에서 소부루세라균 특이유전자(498bp), eri 유전자(178bp) 및 RB 51 특이유전자(364bp)를 확인할 수 있었다. 이상의 결과로 국내의 소 부루세라백신 생산용 종균주와 백신주는 Brucella abortus RB510]유전적으로 정상이고 균체 구조성분(OMP, LPS)의 변이는 없는 것으로 확인되었다.
NA에는 A사 백신 주가 중등도의 감수성을 나타내었고 이외의 나머지 균주는 내성을 나타내었으며, CC에는 A사의 백신 주만이 감수성을 보였으며 B사 백신주, C대학 보유균주 그리고 미국백신주는 중등도의 감수성을 나타내었다. 이외 의 CF 둥 12종의 항균제 에는 모두 감수성을 나타내 었으나 AM, CF, CZ, NA, Va의 경우 A사 백신주의 억제 환이 다른 균주에 비하여 크게 나타났다.
후속연구
AM 등 14종의 항균제에 대한 감수성 시험결과 대부분의 감수성 양상이 RB51 표준균주와 일치하였으나 A사 백신균주의 경우 NA와 CC에 대한 감수성에 다소 차이가 있었으며 AM 등 5종의 항균제 에 대한 발육억제환 직경이 다른 균주보다 크게 나타나 약제에 대한 감수성에 차이를 보였으며 이에 대한 원인규명 차원에서 균주의 유래 등 추가적인 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
Br abortus, RB51 및 eri-gene 특이primer를 이용한 PCR 시험결과 국내 A, B사의 백신주에서는 498bp의 Br abortus 특이유전자, 364bp의 RB51 특이유전자 및 178 bp의 eri-gene 특이유전자를 RB51 표준균주에서와 동일하게 검출할 수 있었으며, 다른 부루세라균종과도 명확하게 구별할 수 있었다. 이에 따라 국내사용 RB51 백신 균주는 유전자 구조면에서도 정상적임이 확인되었으며, 이 multiplex-PCRe 앞으로 각종 가검물에서 분리되는 부루세라균의 신속, 정확한 동정에 유용하게 적용할 수 있을 것으로 사료된다.
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