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문제 정의
- 본 연구에서는 우리나라 연안에 서식하는 연어류의 집단구조분석을 위한 기초자료를 얻기 위하여 미토콘드리아 ribosomal RNA (12S&16S)유전자 영역의 염기서열변이를 비교 · 분석하여 집단 내/집단간의 유전적 차이를 조사하고자 하였으며, 또한, 연어속에 속하는 세 종간의 유전적 유연관계 및 시마연어의 진화적인 위치를 파악하고자 하였으며, 이 영역에서의 유전적 표지인자 개발가능성과 그 효용성을 조사하고자 하였다.
가설 설정
- Sequence alignment of tRNAVal genes. Anticodon regions were shaded, b. The tRNAVal sequences represented in the cloverleaf form. Standard base-pairings (G • C or A • T) are indicated by dashes.
제안 방법
- 0.2~0.5 μg의 template DNA와 mitochondrial genome의 각 영역별로 적절한 primer 0.5μM ; 각각의 dNTP 0.2 mM ; 1×Ex TaqTM buffer(TAKARA); 1.25 units의 Taq DNA polymerase (Ex TaqTM, TAKARA)이 든 반응액을 총 50 μl되게 조성하여, PCR (polymerase chain reaction) 반응을 35회 반복하였다(94℃ 1분; 50~55℃, 1분; 72℃, 2분). PCR 반응 및 direct sequencing을 위해 6쌍의 primers를 제작하여 사용하였으며, 그들의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
- 증폭된 PCR단편은 QIAquick PCR Purification Kits(QIAGEN) 나 QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kits(QIAGEN) 을 사용하여 정제한 후, Table 1의 적절한 primer와 함께 cycle sequencing을행하였다. ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, USA)을 사용하여 96℃, 10초; 50℃, 5초; 55~60℃, 4분간의 반응을 25회 반복하였으며, 얻어진 exten sion products는 에탄올 침전시킨 후 automated DNA sequencer (ABI PRISM 377)로 전기영동하였다. 증폭된 PCR단편 각각의 염기서열은 forward와 reverse 양방향으로 대조 · 확인하였다.
- Direct sequencing에 의해 얻어진 미토콘드리아 rRNA 유전자 영역의 염기서열은 DNAS1S ver. 2.5 program (Hitachi Software Engineering Co., Ltd)으로 정렬하였으며, PHYLIP ver. 3.5c package (Felsenstein, 1993)를 이용하여 phylogenetic tree를 얻었다. Parsimony 분석에는 DNAPARS program을 사용하였으며, bootstrap은 1000회 반복하였다.
- 25 units의 Taq DNA polymerase (Ex TaqTM, TAKARA)이 든 반응액을 총 50 μl되게 조성하여, PCR (polymerase chain reaction) 반응을 35회 반복하였다(94℃ 1분; 50~55℃, 1분; 72℃, 2분). PCR 반응 및 direct sequencing을 위해 6쌍의 primers를 제작하여 사용하였으며, 그들의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
- 미토콘드리아 DNA 분리는 Chapman and Powers (1984)의 Non-idet 방법을 개량하여 사용하였다. 동결보존된 조직 1~5g을 0.
- 열목어를 비롯한 산천어, 시마연어, 연어, 무지개송어 등 우리나라 연어아과 어류의 집단구조분석을 위한 기초자료를 얻기 위하여, 미토콘드리아 ribosomal RNA 유전자 영역의 염기서열변이를 비교 · 분석하였다. 미토콘드리아 DNA의 12S rRNA(945 bases, 열목어의 경우 946 bases), Valine transfer RNA(72 bases), 및 16 S rRNA(1513 bases) 등 3개의 유전자 영역에 걸쳐, 최대 2531 bases의 염기서열을 PCR/direct sequencing하여 얻었는데, 모든 염기변이중 전이가 월등히 우세하게 나타났으며, 종내 · 종간변이 율은 모두 0.
- , Norwalk, USA)을 사용하여 96℃, 10초; 50℃, 5초; 55~60℃, 4분간의 반응을 25회 반복하였으며, 얻어진 exten sion products는 에탄올 침전시킨 후 automated DNA sequencer (ABI PRISM 377)로 전기영동하였다. 증폭된 PCR단편 각각의 염기서열은 forward와 reverse 양방향으로 대조 · 확인하였다.
- 증폭된 PCR단편은 QIAquick PCR Purification Kits(QIAGEN) 나 QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kits(QIAGEN) 을 사용하여 정제한 후, Table 1의 적절한 primer와 함께 cycle sequencing을행하였다. ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin-Elmer Corp.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 어류는 국립수산진흥원 양양내수면 연구소에 서 종보존용 친어로서 사육중인, 연어 (Oncor/iync/ius keta), 시마 연어(O. masou masou), 산천어 (O. masou ishikawae), 무지개송어(O. mykiss), 무지개송어의 알비노 변이체 및 열목어 (Brachymystax lenok) 6종이며, 냉동상태로 실험실로 운반한 후, 조직 (liver, brain, muscle)을 채취한 뒤 분석용 시료로서 -80℃ 에서 동결 · 보존하였다.
데이터처리
- 5c package (Felsenstein, 1993)를 이용하여 phylogenetic tree를 얻었다. Parsimony 분석에는 DNAPARS program을 사용하였으며, bootstrap은 1000회 반복하였다. Neighbor-Joining boostrap tree (1000회 반복)는 Kimura의 2 parameter matrix에 준해 NEIGHBOR program을 사용하였다.
- DNAML program을 통한 Maximum likelihood 분석에서는 global rearrangement option(7회)을 이용하였다. 위의 세가지 분석 모두에서 consensus tree를 얻어 그 topology를 비교하였다. DNA sequence similarity searches는 NCBI (the National Center for Biotechnology Information) 의 the BLAST network service를 통해 수행하였다.
이론/모형
- 위의 세가지 분석 모두에서 consensus tree를 얻어 그 topology를 비교하였다. DNA sequence similarity searches는 NCBI (the National Center for Biotechnology Information) 의 the BLAST network service를 통해 수행하였다. 본 연구에서 얻어진 염기서열은 모두 NCBI GenBank database에 등록되어있으며 (AF125508~AF125513), 따라서 변이가 나타나지 않은 위치에서의 염기서열은 본문에 게재하지 않았다.
- Neighbor-Joining boostrap tree (1000회 반복)는 Kimura의 2 parameter matrix에 준해 NEIGHBOR program을 사용하였다. DNAML program을 통한 Maximum likelihood 분석에서는 global rearrangement option(7회)을 이용하였다. 위의 세가지 분석 모두에서 consensus tree를 얻어 그 topology를 비교하였다.
- Parsimony 분석에는 DNAPARS program을 사용하였으며, bootstrap은 1000회 반복하였다. Neighbor-Joining boostrap tree (1000회 반복)는 Kimura의 2 parameter matrix에 준해 NEIGHBOR program을 사용하였다. DNAML program을 통한 Maximum likelihood 분석에서는 global rearrangement option(7회)을 이용하였다.
- 05ml의 TEK에 녹여 최종 농도 1%의 Non-idet으로 lysis하였다. 이후의 DNA 추출 과정은 Sambrook et al. (1989)의 일반적인 방법에 따랐으며, 분리된 DNA는 -20℃에서 보관하였다.
성능/효과
- 16S rRNA 유전자 영역에서 6종을 뚜렷히 구별하는 염기의 변이는 관찰되지 않았으나, 16번과 54번을 포함한 29개 위치에서 연 어속의 종들과 열목어속의 열목어는 확실히 구별되는 염기배열을 가지고 있었다. 반면, 연어속의 연어는 8개의 위치(44, 52, 236, 816, 829, 1126, 1191, 1258)에서 동속의 다른 두종과 구별되었으며, 특히 44번과 236번은 연어속에 속하는 3종 모두에서 차이를 나타내고 있다 (Table 4).
- 16S rRNA 유전자는 전체 영역중 5' 말단쪽의 염기서열 1513 bases를 얻었는데 (Table 4), 염기의 수적인 증감은 전혀 나타나지 않고 염기치환만이 나타나는데 전이의 빈도가 여전히 우세하나, 12S rRNA영역에 비해 전환의 빈도가 다소 높게 나타나고 있다. Brown et al.
- 2개의 ribosomal RNA 영역사이에 존재하는 Valine transfer RNA 영역은 72 bases의 염기로 구성되어 있었으며 (Fig. 2a), 이미 complete sequence가 밝혀진 다섯 종 (Carassius auratus, AB006953; Salmo salar, U12143; Oncorhynchus mykiss, L297 71; Crossostoma lacustre, M91245; Cyprinus carpio, X61010)을 outgrcmp으로 사용하여 similarity를 조사해 본 결과, 두 ribosomal RNA 영역보다 훨씬 더 보존적이었다. DNASIS program을 이용하여 tRNA 2차 구조를 그려본 결과 (Fig.
- 2a), 이미 complete sequence가 밝혀진 다섯 종 (Carassius auratus, AB006953; Salmo salar, U12143; Oncorhynchus mykiss, L297 71; Crossostoma lacustre, M91245; Cyprinus carpio, X61010)을 outgrcmp으로 사용하여 similarity를 조사해 본 결과, 두 ribosomal RNA 영역보다 훨씬 더 보존적이었다. DNASIS program을 이용하여 tRNA 2차 구조를 그려본 결과 (Fig. 2b), anticodon의 위치는 34번~36번(TAC)으로 나타났다. 한편, D.
- 미토콘드리아 12S rRNA 유전자의 complete sequence로 집단간의 변이를 분석한 결과, 조사한 Oncorhynchus속의 5종은 945 bases, Bracchymystax속의 열목어의 경우 946 bases의 크기를 가지고 있었다.
- 열목어를 비롯한 산천어, 시마연어, 연어, 무지개송어 등 우리나라 연어아과 어류의 집단구조분석을 위한 기초자료를 얻기 위하여, 미토콘드리아 ribosomal RNA 유전자 영역의 염기서열변이를 비교 · 분석하였다. 미토콘드리아 DNA의 12S rRNA(945 bases, 열목어의 경우 946 bases), Valine transfer RNA(72 bases), 및 16 S rRNA(1513 bases) 등 3개의 유전자 영역에 걸쳐, 최대 2531 bases의 염기서열을 PCR/direct sequencing하여 얻었는데, 모든 염기변이중 전이가 월등히 우세하게 나타났으며, 종내 · 종간변이 율은 모두 0.5%이하로 낮게 나타나, 다른 영역에 비해 rRNA 유전자 영역에서의 염기서열이 매우 보존적임을 보여주었다. 또한, 미토콘드리아 rRNA 유전자 염기서열은 연어류의 속 (genus)단계 이상에서 집단분류표지인자로 유용하게 쓰일 수 있으리라 사료되 어진다.
- 미토콘드리아 rRNA 염기서열자료를 기초로 구성된 phylogenetic tree를 통해 이들 종간의 진화적인 유연관계를 살펴본 결과, 시마연어가 무지개송어보다는 연어와 더 근연인 것으로 나타났으며, 열목어는 가장 유연이 먼 종임을 확인할 수 있었다.
- 16S rRNA 유전자 영역에서 6종을 뚜렷히 구별하는 염기의 변이는 관찰되지 않았으나, 16번과 54번을 포함한 29개 위치에서 연 어속의 종들과 열목어속의 열목어는 확실히 구별되는 염기배열을 가지고 있었다. 반면, 연어속의 연어는 8개의 위치(44, 52, 236, 816, 829, 1126, 1191, 1258)에서 동속의 다른 두종과 구별되었으며, 특히 44번과 236번은 연어속에 속하는 3종 모두에서 차이를 나타내고 있다 (Table 4).
- 본 연구에서 조사된 모든 영역에 걸쳐 나타난 대부분의 유전적 변이는, 열목어와 다른 종들사이를 뚜렷하게 구별해 주고 있다. 이것으로 미루어, 미토콘드리아의 rRNA 유전자는 연어아목에 있어서 속간의 차이를 나타내는 표지인자임은 분명하며, 그 상위분 류단계의 유전학적 비교에 있어서도 유용한 유전적 표지인자로 사용되어질 수 있으리라 사료되어진다.
- 본 연구에서는 미토콘드리아 DNA의 12S rRNA, Valine transfer RNA 및 16S rRNA 등 3개의 유전자 영역에 걸쳐, 최대 2531 basest 염기서열을 PCR/direct sequencing하여 얻었다 (Fig. 1).
- 시마연어와 산천어에서 조사된 종내 변이를 살펴보면, 1297번와 1324번의 두 위치에서 산천어에 비해 시마연어에서 집단내 다형 현상이 강하게 나타나는 것을 볼 수 있었으며, 무지개송어와 알비노에서는 795번 위치에서만 A—G전이로 인한 종내 변이가 관찰되었다 (Table 4). 이에따라 동종내에서의 염기치환율(%)은 0.
- 종내의 염기변이를 살펴보면, 시마연어와 산천어에서는 38번와 641번의 두 위치에서, 무지개송어와 알비노에서는 144번 위치에서 염기 변이가 관찰되었으며 (Table 2), 이로부터 구해진 염기치환율 (%)은 0.106~0.212% 이었다 (Table 3).
- 2b), anticodon의 위치는 34번~36번(TAC)으로 나타났다. 한편, D.H.U.영역과 T.W.C영역은 각각 10번과 25번사이, 48번과 64번사이였으며, 두 영역 모두에서 loop나 stem의 길이변화로 인한 종간 차이는 발견할 수 없었으나, 세 개의 염기치환이 조사되었다. 특히 20번 위치에서의 염기는 종에 따른 특이성을 보이고 있었다.
- 한편, 종간의 염기변이는 15쌍의 조합을 조사한 결과, 12~38개의 위치에서 염기치환이 나타났으며, 연어속에 속하는 종간에는 모든 염기치환이 전이 (transition)로 인한 것이었으며, 수적인 증감은 없었던 반면, 열목어속의 열목어와 연어속의 종간에는 4개의 염기치환이 전환(transversion)으로 인해 종간이 혹은 속간이 뚜렷하게 구별되었으며, 특히 308번 위치에서는 유전자의 삽입(insertion)이 관찰되었다. 이에 따른 염기치환율 (%)은 L270~4.
후속연구
- 이것으로 미루어, 미토콘드리아의 rRNA 유전자는 연어아목에 있어서 속간의 차이를 나타내는 표지인자임은 분명하며, 그 상위분 류단계의 유전학적 비교에 있어서도 유용한 유전적 표지인자로 사용되어질 수 있으리라 사료되어진다. 그러나, 종간 변이율이 5 %이하로 매우 낮게 나타나고 있어, mtDNA내 다른 유전자 영역에 비해 ribosomal RNA 영역에서의 염기서열이 매우 보존적이므로, 이 영역에서의 변이만을 기준으로 사용하는데는 많은 오류가 능성이 있으며, 다른 여러 가지 연구가 병행되어져야 할 것으로 사료된다.
- 5%이하로 낮게 나타나, 다른 영역에 비해 rRNA 유전자 영역에서의 염기서열이 매우 보존적임을 보여주었다. 또한, 미토콘드리아 rRNA 유전자 염기서열은 연어류의 속 (genus)단계 이상에서 집단분류표지인자로 유용하게 쓰일 수 있으리라 사료되 어진다.
- , 1996). 본 연구에서 조사된 12S rRNA와 tRNAVal 영역의 complete sequences와 16S rRNA의 염기서열은, 우리나라 연안에 서식하고 있는 연어류에 대한 최초의 자료로서, 연안어업자원의 “genetic information bank”의 의미에서 그 가치 가 매우 높으며, 다른 생물종들의 자료와 함께 mtDNA 염기서열을 이용한 앞으로의 여러 가지 연구에 기초가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 조사된 모든 영역에 걸쳐 나타난 대부분의 유전적 변이는, 열목어와 다른 종들사이를 뚜렷하게 구별해 주고 있다. 이것으로 미루어, 미토콘드리아의 rRNA 유전자는 연어아목에 있어서 속간의 차이를 나타내는 표지인자임은 분명하며, 그 상위분 류단계의 유전학적 비교에 있어서도 유용한 유전적 표지인자로 사용되어질 수 있으리라 사료되어진다. 그러나, 종간 변이율이 5 %이하로 매우 낮게 나타나고 있어, mtDNA내 다른 유전자 영역에 비해 ribosomal RNA 영역에서의 염기서열이 매우 보존적이므로, 이 영역에서의 변이만을 기준으로 사용하는데는 많은 오류가 능성이 있으며, 다른 여러 가지 연구가 병행되어져야 할 것으로 사료된다.
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