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문제 정의
- 본 연구에서는 본태성 수전증 환자의 대부분이 가족력이 있다는 것을 기초로 하여 본태성 수전증 환자의 미토콘드리아 DNA 전체를 보기위해 유전자 간의 거리가 짧은 것은 일반적인 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였으며, 유전자간의 거리가 5kb 이상인 것은 일반 PCR로는 관찰할 수 없어 Long and Accurate PCR(LA PCR)을 수행하였다. 두가지 PCR을 통해 본태성 수전증 환자의 미토콘드리아 DNA에서 구조적 이상이 발생하였는지를 밝히고자 하였다.
- 본 연구에서는 본태성 수전증 환자에서 미토콘드리아 기능 장애에 대하여 연구를 수행하였다. 미토콘드리아 기능장애에 따른 여러 질환들을 알아보면, 미토콘드리아 뇌척수질환(mitochondrial encephalomyelopathy)은 원형 호흡계 질환(prototypic respiratory chain disease)이다13).
- 또한 사람이 활동하는데 필요한 에너지원인 ATP를 합성하고 전달하는 기능을 갖고 있으므로 유전질환과 연관된 운동질환의 연구 대상이 될 수 있다. 본 연구에서는 이러한 점을 고려하여 미토콘드리아 DNA 전체를 분석한 것이다. 파킨슨병, 헌팅톤병, 다발성 전신성 위축(multiple system atrophy), 이긴장증에 대한 생화학적 연구를 통해 뇌조직, 혈소판, 근육, 림프구에서 산화적 인산화 반응의 효소 결실에 대한 결과가 보고되었다13).
제안 방법
- 1/3 16S rRNA와 complexⅠ의 ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, 3/4 ND5 유전자와 complexⅣ, complexⅤ의 유전자들의 결실을 관찰하기 위한 LA PCR(3번과 8번 primer)를 수행하였다(Fig. 3-A). 본태성 수전증 환자 모두 0.
- ComplexⅢ부위의 cytochrome b 유전자의 결실이 있는 지를 알아보기 위해 3가지 PCR을 수행하였다. 첫 번째로 COⅠ 유전자에서 미토콘드리아 DNA 끝부위까지 증폭한 PCR (5번과 9번 primer)에서 정상인은 12kb가 증폭되었지만 9명의 환자들 모두 0.
- 이상의 결과를 통해서 본태성 수전증 환자들의 ND1, ND2 유전자에서도 결실이 발생됨을 관찰하였다. ComplexⅣ 부위의 결실을 자세히 알아보기위해 COⅠ에서 1/3 ATPase 6/8까지 PCR(5번과 7번 primer)을 수행하였다(Fig. 2-D). 본태성 수전증 환자들은 극미량의 2.
- ND1, ND2, COⅠ, COⅡ 유전자에서의 전반적인 결실을 관찰하기 위한 PCR(3번과 7번, 4번과 7번 primer)을 수행 하였다. 1/3 16S rRNA에서 1/3 ATPase 6/8까지 증폭한 PCR(3번과 7번 primer) 결과에서, 정상인은 5.
- 65μg에서 증폭시켰다. PCR Thermal Cycler(Phamarcia, LKB)를 이용하여 94℃에서 1분간 변성 시키고, 94℃에서 40초간 denaturation, 67℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분간 polymerization을 30 cycle 시행하고 최종적으로 72℃에서 15분 동안 extension 반응을 수행하였다. 증폭후, PCR 반응 산물 10μl는 ethidium bromide가 들어 있는 1% agarose gel로 전기영동 하여 확인하였다.
- 65μg에서 증폭시켰다. PCR Thermal Cycler(Phamarcia, LKB)를 이용하여 94℃에서 1분간 변성시키고, 98℃에서 20초간 denaturation, 68℃에서 20분간 annealing을 14 cycle를 실행한 후, 98℃에 20초간 denaturation, 68℃에서 20분 15초간 polymerization을 16 cycle 시행하고 최종적으로 72℃에서 15분 동안 extension 반응을 수행하였다. 증폭후, PCR 반응 산물 10μl는 ethidium bromide가 들어 있는 1% agarose gel로 전기영동하여 확인하였다.
- 1-A)를 축출하였다. Total DNA에서 미토콘드리아 DNA의 결실을 관찰하기 위해 미토콘드리아 specific primer 9개를 제작하여 16회의 PCR과 LA PCR(Fig. 5)를 통해 미토콘드리아 DNA 전체를 분석하였다(Fig. 6).
- 대조군과 실험군의 전혈에서 total DNA(Fig. 1-A)를 축출하였다. Total DNA에서 미토콘드리아 DNA의 결실을 관찰하기 위해 미토콘드리아 specific primer 9개를 제작하여 16회의 PCR과 LA PCR(Fig.
- 본 연구에서는 본태성 수전증 환자의 대부분이 가족력이 있다는 것을 기초로 하여 본태성 수전증 환자의 미토콘드리아 DNA 전체를 보기위해 유전자 간의 거리가 짧은 것은 일반적인 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였으며, 유전자간의 거리가 5kb 이상인 것은 일반 PCR로는 관찰할 수 없어 Long and Accurate PCR(LA PCR)을 수행하였다. 두가지 PCR을 통해 본태성 수전증 환자의 미토콘드리아 DNA에서 구조적 이상이 발생하였는지를 밝히고자 하였다.
- 본 연구에서는 일반적인 PCR과 2kb 이상을 증폭시키는 LA PCR를 사용하여 본태성 수전증 환자의 미토콘드리아 DNA 전체를 분석하였다. LA PCR를 수행하는 과정에서 본태성 수전증 환자들이 정상인보다 미토콘드리아 DNA 양이 적어 2차 PCR를 실행한 결과를 살펴보면, D-loop 부위와 COⅠ부위만 결실되지 않았지만 파킨슨병과 헌팅톤병 등 퇴행성 신경질환에서 공통적으로 발견되는 5kb 결실이 관찰되었고13), 그 외에도 complex Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ부위의 여러 유전자에서도 결실이 관찰되었다(Fig.
- 9kb이하의 미토콘드리아 절편이 관찰되었다. 이 결과에서 complexⅠ의 ND3 부위에서 ND5 유전자 사이에서의 결실을 관찰하였다.
-
1. DNA 정제
정상인(대조군)과 9명의 본태성 수전증 환자(실험군)에서 60ml의 혈액을 취하여 3,500rpm에서 15분간 원심 분리시킨 다음 buffy coat층을 떼어내어 축출용액(100mM Tris·Cl, 50mM EDTA, pH 8.0, 20mg/ml RNase A)에 넣고 파이펫팅을 한다. Buffy coat층이 든 축출용액을 37℃에서 1시간 정도 incubation한 다음 100mg/ml proteinase K를 넣은 후 65℃에서 1시간 정도 놓아둔 후 TE(10mM Tris·Cl, 1mM EDTA, pH 8.
- PCR Thermal Cycler(Phamarcia, LKB)를 이용하여 94℃에서 1분간 변성 시키고, 94℃에서 40초간 denaturation, 67℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분간 polymerization을 30 cycle 시행하고 최종적으로 72℃에서 15분 동안 extension 반응을 수행하였다. 증폭후, PCR 반응 산물 10μl는 ethidium bromide가 들어 있는 1% agarose gel로 전기영동 하여 확인하였다. Direct sequencing에 쓰이는 primer는 PCR에서 미토콘드리아 DNA를 증폭시키는데 쓰이는 것과 동일한 primer(Table 1)를 사용하였다.
- PCR Thermal Cycler(Phamarcia, LKB)를 이용하여 94℃에서 1분간 변성 시키고, 94℃에서 40초간 denaturation, 67℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분간 polymerization을 30 cycle 시행하고 최종적으로 72℃에서 15분 동안 extension 반응을 수행하였다. 증폭후, PCR 반응 산물 10μl는 ethidium bromide가 들어 있는 1% agarose gel로 전기영동 하여 확인하였다. Direct sequencing에 쓰이는 primer는 PCR에서 미토콘드리아 DNA를 증폭시키는데 쓰이는 것과 동일한 primer(Table 1)를 사용하였다.
대상 데이터
- 2명(2번, 9번)의 환자는 다른 6명보다 결실이 적게 일어난 것을 관찰할 수 있었다. 1번 환자는 전체 크기의 5.5kb는 증폭되지 않았지만 3개(1.9kb, 1.5kb, 0.9kb)의 미토콘드리아 DNA 절편이 관찰되었다. 1번 환자는 다른 8명의 환자보다 더 많은 결실이 발생되는 것을 관찰하였다.
성능/효과
- 1번 환자는 다른 8명의 환자보다 더 많은 결실이 발생되는 것을 관찰하였다. 1/2 ND1에서 1/3 ATPase 6/8 부위를 증폭시킨 PCR(4번과 7번 primer)결과에서 4명의 본태성 수전증 환자(3번, 6번, 7번, 8번)는 극미량의 5kb 미토콘드리아 DNA 절편과 결실되고 남은 0.4kb 절편이 관찰되었다. 3번 환자는 0.
- 3-B). 1/2 ND1에서 3/4 ND5 부위를 증폭한 결과(4번과 8번 primer)에서 3번 환자는 극미량의 9kb 미토콘드리아 DNA 절편과 1.2kb 이하의 미토콘드리아 DNA 절편들이 관찰되었고 8명의 환자는 1.2kb이하의 미토콘드리아 DNA 절편이 관찰되었다(Fig. 3-C). 두 LA PCR 결과(5번과 8번, 4번과 8번 primer)를 통해서 본태성 수전증 환자들은 ND1∼ND2, ND3∼ND5 유전자 사이에서 결실 발생을 다시 한 번 증명되었다.
- ND1, ND2, COⅠ, COⅡ 유전자에서의 전반적인 결실을 관찰하기 위한 PCR(3번과 7번, 4번과 7번 primer)을 수행 하였다. 1/3 16S rRNA에서 1/3 ATPase 6/8까지 증폭한 PCR(3번과 7번 primer) 결과에서, 정상인은 5.5kb 모두 증폭되었지만 본태성 수전증 환자 8명(1번 환자 제외) 모두 공통적으로 5.5kb와 0.9kb 미토콘드리아 DNA 절편만 증폭되었다(Fig. 2-E). 8명중 6명은 두 개의 미토콘드리아 DNA 절편이 증폭되었지만 2번 환자는와 9번 환자 모두 4개(2번 환자：5.
- 4-C). 16회의 LA PCR 결과에서 본태성 수전증 환자는 미토콘드리아 DNA의 여러 유전자 사이에서 다량의 부분적 결실이 발생하고 있다는 것이 관찰되었다.
- 2-E). 8명중 6명은 두 개의 미토콘드리아 DNA 절편이 증폭되었지만 2번 환자는와 9번 환자 모두 4개(2번 환자：5.5kb, 1.9kb, 1.5kb, 0.9kb, 9번 환자：5.5kb, 2.7kb, 1.5kb, 0.9kb)의 절편이 증폭되었다. 2명(2번, 9번)의 환자는 다른 6명보다 결실이 적게 일어난 것을 관찰할 수 있었다.
- 5kb내에서 com-plexI의 ND1, ND2 유전자와 16S rRNA 부위를 제외한 COⅠ유전자 부위만을 증폭시켰다(5번과 6번 primer). COⅠ 부위를 분석한 결과를 보면, 정상인과 9명의 본태성 수전증 환자는 모두 2kb 정도 모두 증폭되었다. 물론, 본태성 수전증 환자들은 2차 PCR를 수행하여 얻은 결과이다 (Fig.
- COⅠ에서 3/4 ND5 유전자까지 증폭시킨 결과(5번과 8번 primer)에서는 8명의 본태성 수전증 환자들 모두 3개의 공통절편(8kb, 2.6kb, 1.4kb)이 관찰되었다. 9번 환자는 전체크기 8kb절편을 제외한 2개의 공통절편이 증폭되었다(Fig.
- 9kb 미토콘드리아 DNA 절편이 관찰되었다. COⅠ유전자만 증폭시킨 결과(Fig. 2-B)를 통해 9명의 본태성 수전증 환자들은 결실되지 않은 미량의 COI 유전자 부위가 정상인과 동일하게 2kb 증폭되었지만, COⅠ부위에서 1/3 ATPase 6/8 부위까지의 결과에서 2kb의 결실이 나타나므로 COⅠ, CO Ⅱ, 1/3 ATPase6/8 사이에서도 결실이 발생된다는 것을 관찰하였다.
- 2-B). COⅠ유전자에 대한 분석을 통해 본태성 수전증 환자들은 complexⅠ부위의 ND1, ND2 유전자와 16S rRNA 부위에서 결실이 발생된 것임을 알 수 있었다. 16S rRNA를 제외하고 1/2 ND1에서 COⅠ유전자까지 약 3.
- 1-B). ComplexⅠ의 ND1, ND2 유전자와 complex Ⅳ의 COⅠ 유전자의 결실을 알아보기 위한 PCR 결과를 보면(3번과 6번 primer), 정상인은 약 4.5kb 정도 모두 증폭되었지만 5명의 본태성 수전증 환자(2번, 3번, 5번, 6번, 7번)는 미량의 4.5kb 절편과 약 1.5kb이하의미토콘드리아 절편이 증폭되었다. 나머지 환자들은 1.
- 4-A). LA PCR 을 행한 총 크기에서 cytochrome b 유전자를 제외한 부위는 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경질환에서 관찰되는‘공통 결실(common deletion)’이 포함하고 있는 부분인 PCR결과에서 본태성 수전증 환자 역시 이 부위에서 다량의 결실이 발생하고 있는 것을 관찰하였다. 두 번째로, 1/2 ND1 유전자에서 미토콘드리아 DNA 끝부위까지 증폭한 결과(4번과 9번 primer)에서 정상인은 12.
- 본 연구에서는 일반적인 PCR과 2kb 이상을 증폭시키는 LA PCR를 사용하여 본태성 수전증 환자의 미토콘드리아 DNA 전체를 분석하였다. LA PCR를 수행하는 과정에서 본태성 수전증 환자들이 정상인보다 미토콘드리아 DNA 양이 적어 2차 PCR를 실행한 결과를 살펴보면, D-loop 부위와 COⅠ부위만 결실되지 않았지만 파킨슨병과 헌팅톤병 등 퇴행성 신경질환에서 공통적으로 발견되는 5kb 결실이 관찰되었고13), 그 외에도 complex Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ부위의 여러 유전자에서도 결실이 관찰되었다(Fig. 6). 본 연구 결과를 통해 본태성 수전증 환자들의 미토콘드리아 복합체 결실로 미토콘드리아 기능에 장애가 발생하여 질환이 더욱 악화시킬 수 있다는 것을 관찰하였다.
- 3-C). 두 LA PCR 결과(5번과 8번, 4번과 8번 primer)를 통해서 본태성 수전증 환자들은 ND1∼ND2, ND3∼ND5 유전자 사이에서 결실 발생을 다시 한 번 증명되었다.
- 3-E). 두 개의 LA PCR(Fig. 3-D, E)결과를 분석하면, D-loop 부위와 COⅠ유전자는 결실이 거의 없으므로 16S rRNA, complex Ⅰ부위의 ND1과 ND2, complexⅣ 부위의 COⅡ 그리고 complexⅤ의 ATPase 6/8 유전자에서 결실이 발생되고 있음을 알 수 있었다. 미토콘드리아 처음 부분부터 3/4 ND5 유전자까지 증폭시킨 결과(1번과 8번 primer)에서는 6번 환자만이 극미량의 13kb 절편과 결실되지 않고 남은 1.
- 2-F). 두 개의 LA PCR를 통해 16S rRNA 부위보다 ND1, ND2 유전자사이에서 결실이 더 많이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다.
- LA PCR 을 행한 총 크기에서 cytochrome b 유전자를 제외한 부위는 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경질환에서 관찰되는‘공통 결실(common deletion)’이 포함하고 있는 부분인 PCR결과에서 본태성 수전증 환자 역시 이 부위에서 다량의 결실이 발생하고 있는 것을 관찰하였다. 두 번째로, 1/2 ND1 유전자에서 미토콘드리아 DNA 끝부위까지 증폭한 결과(4번과 9번 primer)에서 정상인은 12.8kb가 증폭되었으나 6번 환자만 극미량의 12.8kb 절편과 0.9kb 절편이 관찰되었다(Fig. 4-B). 9명의 환자 모두 0.
- 미토콘드리아 DNA의 처음 부분부터 COⅡ 유전자까지 증폭시킨 PCR(1번과 6번 primer)에서 2명의 환자(6번, 8번)는 극미량의 7.5kb 절편과 2.3kb이하의 미토콘드리아 DNA 절편이 증폭되었고 9명 모두 전반적으로 2.3kb 이하의 많은 미토콘드리아 DNA 절편이 관찰되었다(Fig. 3-D). 미토콘드리아 처음 부분부터 1/3 ATPase 6/8 유전자까지 증폭한 PCR(1번과 7번 primer) 결과에서 3명의 환자(6번, 7번, 8번)가 미량의 8.
- 6). 본 연구 결과를 통해 본태성 수전증 환자들의 미토콘드리아 복합체 결실로 미토콘드리아 기능에 장애가 발생하여 질환이 더욱 악화시킬 수 있다는 것을 관찰하였다.
- 본태성 수전증이 미토콘드리아의 기능장애에 의해 발생된다고 말할 수는 없지만, 병이 진전된 상태에서 미토콘드리아를 분석한 결과에서 거의 모든 유전자 부위에서 부분적으로 다량의 결실이 발견된 것으로 보아, 미토콘드리아의 한 유전자의 결실로 인해 에너지의 흐름이 차단되어 다른 복합체의 유전자 결실이 발생되고 시간이 경과됨에 따라 다량의 결실이 더욱 많이 발생될 것이라고 사료된다.
- 9kb의 공통절편이 관찰되 었다. 세 번째는, 1/3 16S rRNA에서 미토콘드리아 DNA 끝 부위까지 증폭한 PCR(3번과 9번 primer)에서 정상인은 13kb가 증폭되었으나 9명의 환자 모두 0.9kb 이하의 많은 절편이 관찰되었다(Fig. 4-C). 16회의 LA PCR 결과에서 본태성 수전증 환자는 미토콘드리아 DNA의 여러 유전자 사이에서 다량의 부분적 결실이 발생하고 있다는 것이 관찰되었다.
- 2-C). 이상의 결과를 통해서 본태성 수전증 환자들의 ND1, ND2 유전자에서도 결실이 발생됨을 관찰하였다. ComplexⅣ 부위의 결실을 자세히 알아보기위해 COⅠ에서 1/3 ATPase 6/8까지 PCR(5번과 7번 primer)을 수행하였다(Fig.
- ComplexⅢ부위의 cytochrome b 유전자의 결실이 있는 지를 알아보기 위해 3가지 PCR을 수행하였다. 첫 번째로 COⅠ 유전자에서 미토콘드리아 DNA 끝부위까지 증폭한 PCR (5번과 9번 primer)에서 정상인은 12kb가 증폭되었지만 9명의 환자들 모두 0.9kb 이하의 절편 또는 primer 근처의 결실로 인하여 절편을 관찰할 수 없었다(Fig. 4-A). LA PCR 을 행한 총 크기에서 cytochrome b 유전자를 제외한 부위는 파킨슨병을 포함한 퇴행성 신경질환에서 관찰되는‘공통 결실(common deletion)’이 포함하고 있는 부분인 PCR결과에서 본태성 수전증 환자 역시 이 부위에서 다량의 결실이 발생하고 있는 것을 관찰하였다.
후속연구
- 미토콘드리아 DNA는 DNA 보수 기전의 결핍과 빠른 전도율을 갖고 있으며 히스톤이 결핍되어 free radical을 포함한 내·외인성 독성물질에 의한 파괴와 돌연변이 발생이 빈번하며, 가장 특징적인 것은 거의 독점적으로 모계 유전되므로 가계력을 갖는 유전질환에 대한 연구가 가능하다는 것이다. 또한 사람이 활동하는데 필요한 에너지원인 ATP를 합성하고 전달하는 기능을 갖고 있으므로 유전질환과 연관된 운동질환의 연구 대상이 될 수 있다. 본 연구에서는 이러한 점을 고려하여 미토콘드리아 DNA 전체를 분석한 것이다.
- . 본태성 수전증 환자에서 codon의 반복이 발생되는지를 확인해보고 가능한 이런 자료를 근거로 가계도를 작성해야 할 것이며, 정확한 병의 발병원인에 대한 연구가 수행되어야 할 것이다.
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