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문제 정의
- 본 연구에서는 기관내 내독소를 투여하여 유발한 횐쥐의 급성폐손상 모델에서 기관내 surfactant의 치료 효과를 알아보고자 하였다. 기존의 연구에서는 주로 기계호홉이 필요한 중증의 급성폐손상를 대상으로 surfactant 효과를 살펴보았는데 비해, 본 연구에서는 아치사량의 내독소를 투여하여 기계호홉이 필요없는 경증의 급성폐손상을 유발한 후에 surfactant의 치료효과를 살펴보았다.
- 하지만 그 동안의 급성폐손상의 동물 모델에서는 기계호흡이 필요할 정도의 심한 폐손상을 유발하였던 경우가 많았으며, surfactant의 투여시기도 폐손상이 유발된 이후에 투여하는 경우가 대부분이었다. 본 연구에서는 내독소를 아치명적 농도의 내독소 주입으로 기계호흡이 필요하지 않는 횐쥐의 급성폐손 상 모델을 만든 이후에 이러한 경증의 급성 폐손상에 서도 surfactant가 치료효과를 발휘하는지를 살펴보고자 한 점과, 내독소 투여 직후와 4시간 이후에 기관 내로 surfactant를 투여하여 투여시기에 따른 치료 효과를 살펴본 점에서 나름대로의 의의가 있다고 사료된다.
- 급성호흡곤란증후군은 다양한 원인으로 유발된 폐포와 모세혈관 사이의 투과성 증가로 폐부종이 발생하여 저산소성 호흡부전이 유발되는 증후군으로, 여러 종류의 surfactant의 이상이 관찰되어 외부에서 기관을 통해 surfactant를 공급하는 치료방법이 많이 시도되었다. 본 연구에서는 흰쥐를 대상으로 기관내로 내독소를 주입하여 급성 폐손상을 유발한 다음 기관내로 surf actant 를 투여하여 치료효과를 알아보았다.
제안 방법
- 기관지폐포세척이 끝난 다음에 주사기로 10% 포르말린 용액을 연결튜브에서 io cm 정도 올라가는 지점까지 주입하여 폐내부를 고정시키고 파라핀에 심은 후 폐의 장축을 따라 절단하여 4 . 5 μm의 두께의 절편을 제작한 뒤 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 폐포의 염증과 폐포벽 두께의 변화를 관찰하였다.
- Pentothal sodium 으로 복강내 마취 후 소동물용 해부대에 흰쥐를 앙와위로 고정하고 목부위를 바깥쪽에서 강한 빛으로 조사한 상태에서 흰쥐의 혀를 forcep 으로 들어올려서 성대를 노출시킨 후 angiocath 튜브를 이용하여 약제를 투여하였다, 이후에는 약 30분 정도 쥐의 머리쪽을 약 45° 각도로 높인 비스듬한 판위에 엎드린 상태로 놓아서 주입한 내독소가 되도록이면 폐의 아래쪽에 흘러들어가도록 하였다.
- 본 연구에서는 기관내 내독소를 투여하여 유발한 횐쥐의 급성폐손상 모델에서 기관내 surfactant의 치료 효과를 알아보고자 하였다. 기존의 연구에서는 주로 기계호홉이 필요한 중증의 급성폐손상를 대상으로 surfactant 효과를 살펴보았는데 비해, 본 연구에서는 아치사량의 내독소를 투여하여 기계호홉이 필요없는 경증의 급성폐손상을 유발한 후에 surfactant의 치료효과를 살펴보았다. 또한 surfactant의 투여시기 를 내독소 투여 직후와 투여 수 시간 후로 나누어서 그 효과의 차이를 함께 평가하였다.
- 기존의 연구에서는 주로 기계호홉이 필요한 중증의 급성폐손상를 대상으로 surfactant 효과를 살펴보았는데 비해, 본 연구에서는 아치사량의 내독소를 투여하여 기계호홉이 필요없는 경증의 급성폐손상을 유발한 후에 surfactant의 치료효과를 살펴보았다. 또한 surfactant의 투여시기 를 내독소 투여 직후와 투여 수 시간 후로 나누어서 그 효과의 차이를 함께 평가하였다.
- 횐쥐 5마리를 한 군으로 모두 4개의 실험군으로 나누었다. 모든 실험군은 기관 내로 약제 투여전과 약 제 투여 4시간 후 그리고 약제투여 23시간 후(동맥 혈액채취검사 직전)에 체용적 변동기록기로 각각 20분 정도 폐역학 지표들을 측정하였으며, 마지막 체용적 변동기록기 측정 후에 동맥혈액가스검사와 기관지폐포세척술, 그리고 폐적출을 시행하였다. 제 1군은 대조군으로 기관내로 생리식염수를 2 ml/kg 의 용량으로 투여하고 30분 후에 다시 생리식염수를 기관내에 같은 용량으로 투여하였다.
- 모든 실험군은 기관 내로 약제 투여전과 약 제 투여 4시간 후 그리고 약제투여 23시간 후(동맥 혈액채취검사 직전)에 체용적 변동기록기로 각각 20분 정도 폐역학 지표들을 측정하였으며, 마지막 체용적 변동기록기 측정 후에 동맥혈액가스검사와 기관지폐포세척술, 그리고 폐적출을 시행하였다. 제 1군은 대조군으로 기관내로 생리식염수를 2 ml/kg 의 용량으로 투여하고 30분 후에 다시 생리식염수를 기관내에 같은 용량으로 투여하였다. 제2군은 내독 소투여군으로 기관내로 2.
- 5 mg/kg의 내독소를 2 ml/kg의 용량으로 투여하였고 30분 후에 생리식염 수를 기관내로 2 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 제 3군은 조기 투여군으로 기관내로 2.5 mg/kg의 내독소를 2 ml/kg의 용량으로 투여한 후에 30분 뒤에 15 mg/ml의 surfactant를 2 ml/kg의 용량으로 투여하였다. 제4군은 후기 투여군으로 기관내로 2.
- 제 1군은 대조군으로 기관내로 생리식염수를 2 ml/kg 의 용량으로 투여하고 30분 후에 다시 생리식염수를 기관내에 같은 용량으로 투여하였다. 제2군은 내독 소투여군으로 기관내로 2.5 mg/kg의 내독소를 2 ml/kg의 용량으로 투여하였고 30분 후에 생리식염 수를 기관내로 2 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 제 3군은 조기 투여군으로 기관내로 2.
- 5 mg/kg의 내독소를 2 ml/kg의 용량으로 투여한 후에 30분 뒤에 15 mg/ml의 surfactant를 2 ml/kg의 용량으로 투여하였다. 제4군은 후기 투여군으로 기관내로 2.5 mg/kg의 내독소를 2 ml/kg의 용량으로 투여한 뒤 5시간 뒤에 15 mg/nd의 surfactant를 2 ml/kg의 용량으로 투여하였다(Table 1).
- 횐쥐를 각각 5마리씩 네 군으로 나누어 제1군은 기관 내로 생리식염수를 30분 간격으로 주입하였고, 제2군은 기관내로 내독소를 주입한 이후 30분 뒤에 기관 내로 생리식염수를 주입하였으며, 제3군과 4군은 기관 내로 내독소를 주입한 후 각각 30분과 5시간 뒤에 기관 내로 surfactant를 주입하였다.
- 횐쥐의 배대동맥에서 동맥혈을 채취하여 동맥혈액 가스분석을 시행하였다.
- 흰쥐의 폐역학은 동물용 일실체용적 변동기록기(one chamber tody plethysmography : All medicus, Seoul, Korea)를 이용하여 호홈수, 홉기유량 그리고 기도저항의 지표인 Penli를 측정하였다(Fig. 1). 호흡신호의 분석은 20분간 안정상태에서 측정을 한 뒤에 나중 10분간의 측정값의 평균치를 취하였다.
대상 데이터
- 체중 330-360g의 수컷 Sprague-Dawley^l] 휜쥐를 대상으로 하였다. APF(animal pathogen free) 흰 쥐만을 이용하였으며, 실험전 1주일에 횐쥐를 전달받아 안정시킨 후에 실험에 이용하였다.
- 내독소는 E. coli 0114 : B4의 liWolysaccharide (Sigma Co. USA)를 이용하였다. 분말형태의 내독소를 생리식염수에 녹여서 2.
- 분말형태의 내독소를 생리식염수에 녹여서 2.5 mg/m!의 stock solu- tion을 만든 후에 기관에는 5 mg/kg의 용량으로 주입하여 급성 폐손상을 유도하였다* Surfactant는 natural bovine surfactant 추출물인 일본타나베 (田辺)제약의 Surfacten을 이용하였다. 120 이홍의 분말이 들어있는 vial에 8 ml의 37℃ 생리식염수 (warm saline)를 첨가하여 15 mg/ml의 부유액을 만들었으며 기관에는 30 mg/kg의 용량으로 투여하 였다.
- 체중 330-360g의 수컷 Sprague-Dawley^l] 휜쥐를 대상으로 하였다. APF(animal pathogen free) 흰 쥐만을 이용하였으며, 실험전 1주일에 횐쥐를 전달받아 안정시킨 후에 실험에 이용하였다.
데이터처리
- 통계처리는 SPSS for windows (release 8.0)을 이용하여 각 군 사이의 차이를 AN0VA를 이용하여 비교 분석하였다. 평균치들 간의 개별비교에는 Duncan 법과 Turkey 법을 모두 이용하였다.
- 1). 호흡신호의 분석은 20분간 안정상태에서 측정을 한 뒤에 나중 10분간의 측정값의 평균치를 취하였다.
이론/모형
- 동맥혈액 채취후에 횐쥐의 목부위를 절개하여 기관을 노출시키고, 노출된 기관연골륜 사이를 가로로 절개한 뒤 16 gauge의 angiocath tube를 밀어넣고 tube 끝에 3-way stopcock을 연결한 뒤 37 ℃ 정도로 데워진 생리식염수를 연결튜브의 10 cm 정도 높이까지 올라가서 정지할 때까지 주입하고 이를 회수하여 기관지 폐포세 척액을 얻었다. 기관지 폐포세척액 의 일부는 세포수측정 및 Wrighit-Giemsa 염색으로 세포분획을 측정하는데 이용하였고, 나머지는 Eppendorf tube에 1 ml씩 나눠서 담은 뒤 1, 200 rpm으로 10분간 원심분리시켜 세포성분을 가라앉힌 뒤, supernatant# 분리하여 TCA(tricholoroace- tate) 법으로 단백농도를 측정하였다.
- 0)을 이용하여 각 군 사이의 차이를 AN0VA를 이용하여 비교 분석하였다. 평균치들 간의 개별비교에는 Duncan 법과 Turkey 법을 모두 이용하였다. p- value가 0.
성능/효과
- 각 군의 기관지폐포세척액의 세포수(평균±표준편차)는 제 1군은 972 + 867, 제2군은 4, 880 + 472, 제 3군은 4, 632 + 2, 615, 제 4 군은 7, 230 ± 4, 414/mm3 으로 제1군에서 다른 군에 비해 의미 있게 낮은 수치를 보였으며(p<0.05) 세포분획상 다형백혈구가 차지하는 비율은 각각 93, 98, 95 그리고 96%로 각 군 사이에 의미 있는 차이는 없었다(Fig. 4).
- 기관지폐포세척액의 단백질농도 (평균±표준편차)는 제1군이 89+79, 제2군이 901+403, 제3군이 195 ±166, 그리고 제4군이 318±169 mg/ml로 제2군 에서 다른 군에 비해 유의하게 증가되어 있었다(P< 0.05) (Fig. 5).
- 기저상태 및 내독소 투여 4 시간 뒤의 홉기유량은 각 군 사이에 의미 있는 차이가 없었으나, 내독소 투여 23 시간 뒤에는 제1군의 흡기유량이 다른 군에 비해 유의하게 높은 값을 보였다(p<0.05)(Table 2) (Fig. 2).
- 이것은 내독소를 기관내로 투여한 횐쥐에서 내독소 투여 후 4시간과 23시간에 시행한 체용적 변동기록상 호흡수가 증가하고 흡기유량이 감소하여 급성 폐손상에서 보이는 빠르고, 얕은 호흡(rapid and shallow breathing)이 유발되었다는 점에서 확인할 수 있다. 또한 내독소 투여 후에 저산소증이 유발되고, 기관지 폐포세척액의 총단백질, 총세포수와 다형백혈구 비율이 증가하였으며 폐적출후 시행한 병리조직학적 검사상 폐포내의 다형백혈구를 위시한 염증세포침윤의 증가와 폐포벽의 비후소견이 나타난 점에서도 급성 폐손 상은 제대로 유발되었다고 판단된다. 다만 폐조직 소견에서 급성호흡곤란증후군에서 관찰할 수 있는 유리 질막의 형성은 관찰되지 않았는데, 이것은 아마도 본 연구에서 쥐를 회생하여 관찰한 시기가 내독소 투여 24시간 후였기 때문에 병리학적으로 유리질막의 형성이 관찰되는 섬유증식시기까지 병변이 충분히 진행되지 않았기 때문으로 생각된다.
- 본 연구에서는 의도한 바와 같이 기관내 내독소 투여로 흰쥐에서 급성 폐손상을 유발시킬 수 있었다. 이것은 내독소를 기관내로 투여한 횐쥐에서 내독소 투여 후 4시간과 23시간에 시행한 체용적 변동기록상 호흡수가 증가하고 흡기유량이 감소하여 급성 폐손상에서 보이는 빠르고, 얕은 호흡(rapid and shallow breathing)이 유발되었다는 점에서 확인할 수 있다.
- 본 연구의 결과에서 기관내 내독소를 투여로 유도된 횐쥐의 급성 폐손상에서 기관내 surfactant 투여는 주목할만한 치료효과를 나타내었다. 생리식염수만을 투여한 군에 비해서 surfactant를 투여한 두 군 (group 3 & 4)은 기도저항의 지표인 Penh의 감소, 동맥혈 산소분압의 개선, 기관지폐포세척액에서 단백 농도의 감소 그리고 정량화하지는 못했지만 폐병리의 호전 등의 소견이 나타났다.
- 생리식염수만 기관내로 주입한 제1군에 비해서 내독소를 기관내로 주입한 제2군과 3군, 4군에서는 호흡 수가 증가하고, 홉기유량이 감소하였으며, 기도저항을 나타내는 지표인 Penh은 제2군에서만 증가되었다. 동맥혈액산소분압은 제2군에서만 유의하게 감소하였다.
- 본 연구의 결과에서 기관내 내독소를 투여로 유도된 횐쥐의 급성 폐손상에서 기관내 surfactant 투여는 주목할만한 치료효과를 나타내었다. 생리식염수만을 투여한 군에 비해서 surfactant를 투여한 두 군 (group 3 & 4)은 기도저항의 지표인 Penh의 감소, 동맥혈 산소분압의 개선, 기관지폐포세척액에서 단백 농도의 감소 그리고 정량화하지는 못했지만 폐병리의 호전 등의 소견이 나타났다. 이러한 소견은 기관내 surfactant 치료 효과를 살펴본 기존의 급성폐손상의 동물모델 연구와 일치되는 결과이다36,37.
- 이상의 결과를 요약하면 기관내로 투여한 surfac- tant는 기관내 내독소의 투여로 유발된 횐쥐의 급성 폐손상에 의미있는 치료효과를 나타냈으며, 이번 연구로 사람의 급성 폐손상이나 급성호흡곤란증후군에 대한 surfactant 치료의 동물 실험적 근거를 마련했다고 사료된다.
- 폐병리의 소견을 보면, 제1군 횐쥐의 폐는 정상적인 소견을 보였으며, 제2군 횐쥐의 폐는 폐포내로 다형백혈구를 위주로 흐}는 심한 염증세포의 침윤과 함께 폐포벽이 두꺼워진 소견이 관찰되어 기관내로 투여한 내독소에 의해 급성폐손 상이 유발되었음을 확인하였다. 제3군과 제4군의 폐에서도 폐포의 염증세포 침윤과 폐포벽의 비후소견이 관찰되었으나 제2군 흰쥐의 소견에 비하여 훨씬 염증이 감소한 소견이 관찰되어서 surfactant의 치료가 병리학적인 호전도 유발할 수 있음을 알 수 있었다 (Fig. 6).
- 내독소와 surfactant를 투여 후에 흰쥐를 경사면에 머리를 높여 엎드리게하여 내독소나 surfactant가 주로 폐하부로 가도록 유도하였다. 폐병리의 소견을 보면, 제1군 횐쥐의 폐는 정상적인 소견을 보였으며, 제2군 횐쥐의 폐는 폐포내로 다형백혈구를 위주로 흐}는 심한 염증세포의 침윤과 함께 폐포벽이 두꺼워진 소견이 관찰되어 기관내로 투여한 내독소에 의해 급성폐손 상이 유발되었음을 확인하였다. 제3군과 제4군의 폐에서도 폐포의 염증세포 침윤과 폐포벽의 비후소견이 관찰되었으나 제2군 흰쥐의 소견에 비하여 훨씬 염증이 감소한 소견이 관찰되어서 surfactant의 치료가 병리학적인 호전도 유발할 수 있음을 알 수 있었다 (Fig.
후속연구
- 현재까지 동물에서 급성폐손상을 유발하는 방법은 본 연구에서 시도한 기관내 내독소 투여 이외에도, 기관내 세균의 투여, 생리식염수를 이용한 기관지폐포세 척술, 동맥 및 폐동맥을 통한 oleic acid 투여등의 다양한 방법이 있다. 따라서 기관내 내독소 투여가 다른 방법으로 유도된 급성폐손상에서도 효과를 발휘할 수 있는지에 대해서는 추가의 연구가 필요하다 하겠다. 또한 상기한 방법들이 반드시 실제적인 급성폐손상과 모든 면에서 일치되지는 않으므로 실제 상황에서도 치료 효과를 발휘할 수 있을지 확인이 필요하다.
- 또한 상기한 방법들이 반드시 실제적인 급성폐손상과 모든 면에서 일치되지는 않으므로 실제 상황에서도 치료 효과를 발휘할 수 있을지 확인이 필요하다. 또한 가장 중요한 사실로 본 연구에서는 동물을 대상으로 기관내 surfactant의 치료효과를 살펴보았기 때문에 궁극적으로는 사람의 급성폐손상에서도 의미 있는 효과가 있을지는 추후의 연구를 통해서 밝혀져야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 기관내 내독소 투여가 다른 방법으로 유도된 급성폐손상에서도 효과를 발휘할 수 있는지에 대해서는 추가의 연구가 필요하다 하겠다. 또한 상기한 방법들이 반드시 실제적인 급성폐손상과 모든 면에서 일치되지는 않으므로 실제 상황에서도 치료 효과를 발휘할 수 있을지 확인이 필요하다. 또한 가장 중요한 사실로 본 연구에서는 동물을 대상으로 기관내 surfactant의 치료효과를 살펴보았기 때문에 궁극적으로는 사람의 급성폐손상에서도 의미 있는 효과가 있을지는 추후의 연구를 통해서 밝혀져야 할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 기관내 surfactant의 투여 효과는 기관내 내독소 투여 직후와 투여 5시간 후에 모두 비슷한 정도로 나타났기 때문에 surfactant 투여 시기에 따른 차이를 확인하지 못하였다. 하지만 내독소 투여 후 5시간 후에도 치료 효과를 나타내기 때문에 기관 내 surfactant 투여는 급성폐손상이 어느 정도 진행한 경우에도 치료 효과를 발휘할 수 있을 것으로 사료 된다.
- , 최근에는 치료 성적도 많이 호전되었다". 하지만 그 동안의 치료성적의 호전이 급성호흡곤란증후군을 유발한 원인질환에 대한 치료방법의 개선 (특히 효과적인 광범위항생제의 개발)이나 보조적인 치료방법의 발전에 의하였던 점을 감안하면, 앞으로는 급성호흡곤란증후군 자체에 직접적인 효과를 나타내는 치료방법의 개발이 필요하다.
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