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문제 정의
- 내독소에 의해 유도된 폐장에서의 산소기 생성을 검사하기 위하여 조직 내 과산화수소의 생성을 검사하였다. 폐장조직을 적출 즉시 2.
- Surfactant의 주성분인 인지질은 PLA2의 기질로 작용하므로 PLA2의 작용에 의하여 surfactant로부터 PAF의 생성이 폐장의 부종, 호중구의 화학주성 및 폐포세포의 손상에 직접적으로 관여할 가능성이 있다. 본 연구에서는 내독소로 흰쥐에서 급성 폐손상을 유도하고 폐세척액 내의 surfactant를 분리하여, surfactant내의 PAF의 함량의 변화를 조사하여 surfactant내의 PAF함량의 변화가 급성 폐손상에 미치는 영향을 알아보려 하였다.
제안 방법
- BALF를 원심분리 하여 얻은 세포층을 0.1 ml의 생리적 식염수에 재 부유 시킨 후 이중 100 μl의 부유액을 cytospin을 이용하여 도말표본을 만든 후 Wright염색을 시행하였다.
- Evans Blue염색액을 이용하여 단백누출지수를 측정하였다 [10]. Evans Blue염색액(10 mg/0.5 ml/rat)을 외경정맥으로 투여하고 30 분 후에 실험동물을 치사 시킨 후 인산완충용액으로 관류하여, 폐장혈관 내의 혈액을 제거 하였다. 좌우의 폐장을 적출하고 무게를 측정하였다.
- Evans Blue염색액을 이용하여 단백누출지수를 측정하였다 [10]. Evans Blue염색액(10 mg/0.
- 1 ml의 생리적 식염수에 재 부유하여 hemocytometer를 이용하여 백혈구를 산정하고 이중 100 μl를 이용하여 cytospin을 시행하여 도말표본을 만들었다. 그 뒤 Wright염색 후, 분획검경(differential count)을 통해 호중구의 백분율을 계산, BALF내의 총 호중구의 수를 계산하였다.
- 10%의 중성 포르말린 액에 잠근 후 주사기로 조직이 담긴 밀폐된 용기에 공기를 주입하여 조직 내의 공기를 제거한 뒤 조직을 고정하였다. 그 뒤 세척, 탈수의 과정을 거친 뒤 paraffin에 포매하고, 미세절단기(Rechert-Jung 2040)로 박편을 제작하고 hematoxylin-eosin용액으로 염색 후 검경하였다.
- 그 후 18 G angiocatheter를 이용하여 기관지 내로 대조군에서는 0.5 ml의 생리적 식염수를, LPS투여군에서는 100 μg의 내독소를 0.5 ml의 식염수에 녹인 후 기도 내로 직접 분무(insufflation)하였다.
- 내독소 주입 5 시간 후 실험동물을 enflurane 및 xylazine으로 마취하여 치사 시킨 후 우측폐장을 절제하고, 무작위로 절편을 채취하였다. 10%의 중성 포르말린 액에 잠근 후 주사기로 조직이 담긴 밀폐된 용기에 공기를 주입하여 조직 내의 공기를 제거한 뒤 조직을 고정하였다.
- 5 ml의 식염수에 녹인 후 기도 내로 직접 분무(insufflation)하였다. 내독소 투여 5 시간 후에 실험동물들을 치사 시키고 시료를 채취하였다.
- 그 뒤 500 g에서 5 분간 원심분리 하여 chloroform층만 분리하고 질소가스 하에서 건조시켰다. 분리된 지질에서 인을 정량 하기 위하여 60% perchloric acid및 10 N 황산용액을 가하고 250℃ 이상의 silicon bath에서 유기물을 제거한 후 malachite green이 함유된 ammonium molybdate용액과 반응시켰다. 이때 발색의 정도를 파장 660 nm에서 UV-VIS spectrophotometer (Shimazu, Japan)를 이용하여 측정하여 인의 양을 알아낸 다음[5], Corbet 등의 방법[3]에 따라 인지질로 환산하였다.
- 이때 얻은 상등액은 40,000 g, 4℃에서 15 분간 (Beckman, USA) 원심분리 하여 high density surfactant (HDS) 및 low density surfactant (LDS)로 분리하였다[20]. 상등액(LDS) 및 침전층(HDS)은 다음과 같이 인지질을 분리, 측정하였다. 즉, 침전층에 1.
- 세포 침전층은 0.1 ml의 생리적 식염수에 재 부유하여 hemocytometer를 이용하여 백혈구를 산정하고 이중 100 μl를 이용하여 cytospin을 시행하여 도말표본을 만들었다.
- 실험동물에서 급성 폐손상을 유도하기 위하여 실험군을 대조군(Sham group)및 LPS투여군(LPS group)으로 구분하고 enflurane을 이용하여 마취시킨 뒤 목 부분을 정중절개 하여 기관지를 노출하였다. 그 후 18 G angiocatheter를 이용하여 기관지 내로 대조군에서는 0.
- 실험동물을 enflurane 및 xylazine으로 마취 후 치사시킨 다음 개흉술을 시행하고 Masterflex perfusion pump (Cole Parmer, USA)를 이용하여 폐장의 혈관을 관류하여 혈액을 제거하였다. 그 후 기도에 삽관 하여 6.
- 고정이 끝난 조직을 sodium cacodylate로 세척하고 ethanol-propylene oxide로 농도를 점차적으로 증가시켜 탈수한 후 epoxy-resin에 포매하였다. 열중합 시킨 block은 ultramicrotome (Recher Supernova)을 이용하여 60 nm의 초박 절편을 만들어 uranyl acetate만으로 염색하여 투과전자현미경(9H-600, Hitachi)으로 검경하였다.
- 탈수의 과정을 거친 후 원침관에 그대로 epoxy-resin을 부어 포매 하였다. 열중합 후 60 nm로 초절박편을 만들고 투과전자현미경으로 관찰하였다.
- 1 ml의 생리적 식염수에 재 부유 시킨 후 이중 100 μl의 부유액을 cytospin을 이용하여 도말표본을 만든 후 Wright염색을 시행하였다. 염색한 표본은 광학현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 관찰하고 촬영하였다.
- 0 ml의 foramide 용액에 담근 후 60℃에서 24 시간을 incubation한 후 foramide 용액을 분리하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도를 이용하여 Evans Blue염색액 표준용액을 이용한 표준곡선에서 foramide 용액에 추출된 Evans Blue염색액의 양을 계산하였다.
- 5 ml/rat)을 외경정맥으로 투여하고 30 분 후에 실험동물을 치사 시킨 후 인산완충용액으로 관류하여, 폐장혈관 내의 혈액을 제거 하였다. 좌우의 폐장을 적출하고 무게를 측정하였다. 그 후 5.
- 폐장의 미세구조 및 폐포 내의 surfactant를 관찰하기 위하여 폐장조직을 5% glutaraldehyde로 고정하고 밀폐된 용기 내에 공기를 주입하여 폐장조직 내의 공기를 제거 하였다. 전고정이 끝난 조직은 1.
- 그 후 ethanol-propylene 계열로 순차적으로 농도를 증가시켜 탈수한 뒤 epoxy-resin에포매하였다. 포매 된 조직은 37℃에서 12 시간, 60℃에서 24시간 열 중합 시키고 60-70 nm의 초절박편을 만든 뒤 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 뒤 투과전자현미경으로 관찰하였다. BALF내의 호중구는 BALF를 원심분리하여 얻은 세포층을 2.
대상 데이터
- 실험동물은 실험 전 12 시간 전까지 물과 사료를 충분히(ad libitum)공급하였다. 내독소(E.coli type: 0127;B8)및 기타 시약들은 특별한 언급이 없는 한 Sigma-Aldrich (St. Louise, MO, USA)제를 사용하였고 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)를 위한 TLC plate는 Fisher사(USA)제를 사용하였다.
- 실험동물은 체중 300 g 내외(주령 8주)의 Sprague-Dawley종 흰쥐, 수컷을 사용하였다(Sasco Korea). 실험동물은 실험 전 12 시간 전까지 물과 사료를 충분히(ad libitum)공급하였다.
데이터처리
- 모든 성적은 Non-paired, two tailed, Student t-test로 검정하였고 p<0.05를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- PAF 표준시료와 시료를 동시에 분리하여 시료에서 PAF가 함유된 silica gel을 긁어 내어 분리한 뒤 chloroform:methanol (v/v, 1:2)용액으로 PAF를 추출한 뒤 Hess 및 Derr의 방법[5]에 따라 인(phosphorus)의 양을 측정하였다.
- BALF를 상온에서 2,000 rpm, 10 분간 원심분리하여 얻은 상등액을 Brown 등의 방법[2]으로 BALF내 단백질함량을 측정하였다.
- LPS투여 5 시간 후 LPS에 의한 폐장 내 호중구의 침윤을 검사하기 위하여 Goldblum 등의 방법[4]에 따라 폐장의 myeloperoxidase (MPO)의 활성도를 측정하였다. -70℃에 동결된 조직을 20 mM의 인산완충용액에 녹인 후 분쇄하고 40,000 g, 4℃에서 30 분간 윈심분리(Beckman, USA)하였다.
- 이 BALF를 상온에서 2,000 rpm, 10 분간 원심분리 하여 상등액을 얻었다. Surfactant에 함유된 PAF의 정량을 위해서 4.0 ml의 BALF에서 Bligh와 Dyer의 방법[1]을 이용하여 지질을 추출하였다. 질소 하에서 완전히 건조된 지질을 1.
- 분리된 지질에서 인을 정량 하기 위하여 60% perchloric acid및 10 N 황산용액을 가하고 250℃ 이상의 silicon bath에서 유기물을 제거한 후 malachite green이 함유된 ammonium molybdate용액과 반응시켰다. 이때 발색의 정도를 파장 660 nm에서 UV-VIS spectrophotometer (Shimazu, Japan)를 이용하여 측정하여 인의 양을 알아낸 다음[5], Corbet 등의 방법[3]에 따라 인지질로 환산하였다.
- 상등액(LDS) 및 침전층(HDS)은 다음과 같이 인지질을 분리, 측정하였다. 즉, 침전층에 1.0 ml의 생리적 식염수를 가하여 재부유 시키고, 상등액과 이 부유된 침전층을 각각, Bligh및 Dyer의 방법[1]에 따라 인지질을 분리하였다. 분리된 surfactant 용액 1.
성능/효과
- 대조군에서의 HDS는 17.1±3.5였으나 LPS를 투여한 군에서는 9.1±2.0으로서 LPS를 투여한 군에서 낮았고(p<0.01), LDS는 대조군에서는 0.8±0.3, LPS투여군에서는 6.1±1.4로서 LPS 투여군에서 유의하게 높았다 (p<0.001).
- 1B). 대조군에서의 폐장 내 호중구는 세포질내의 입자들이 잘 보존되어 있고 위족이 관찰되지 않았으나(Fig. 2A) LPS를 투여한 흰쥐 BALF 내의 호중구는 세포질내의 과립이 고갈되어 있고 수많은 위족이 관찰되었다(Fig. 2B). 또한 폐장조직에서의 과산화수소는 대조군에서는 관찰되지 않았으나(Fig.
- LPS에 의한 급성 폐손상에서 PAF의 역할은 호중구의 침윤에 따른 호중구성 산소기의 생성 및 유착분자의 활성화에 따른 혈관내피세포의 손상이라고 알려져 있다[11]. 본 연구에서는 LPS에 의해 surfactant내의 PAF의 함량이 증가함을 보여 주고 있다. Surfactant의 주성분은 알려진 바와 같이 인지질이며 그 중에서도 dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC)이 주성분이며 폐장의 LPS에 의한 염증반응에 관여하는 phospholipase A2 (PLA2)의 기질로 작용한다[6].
- 폐모세혈관 에서의 단백질의 유출을 알아보기 위해 시행한 Evans Blue염색액 누출(μg of EBD/g of wet lung)실험에서 대조군은 7.0±3.4, LPS를 투여한 군에서는 10.7±2.5로서 LPS투여군에서 유의하게(p<0.01) 증가하였다.
- 폐장내의 호중구의 침윤을 나타내는 MPO의 활성도(U/g of wet lung)는 대조군에서 4.0±1.7이었고, LPS투여군에서는 39.2±6.8로서 LPS 투여군에서 현저히 높았다 (p<0.001).
- 폐포 내로의 호중구의 이동을 나타내는 BALF내의 호중구의 수(millions/two lungs)는 대조군에서 0.05±0.03, LPS투여군에서는 4.01±1.26으로서 LPS투여군에서 현저히 (p<0.001) 높았다(Table 3).
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