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문제 정의
- 암유전자의 활 성화나 종양억제유전자의 불활성화, 그리고 결과적인 유전적 불안정성의 증가는 폐암의 발암과정에서 일어 나는 주요한 사건이며 임상적으로 폐암이 진단되기까 지 10내지 20여 가지의 유전적 변화가 축적되는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 저자들은 비소세포폐 암에서 종양억제유전자인 p53과 FHIT의 돌연변이, FHIT 유전자의 전사체 이상 여부를 확인하고 종양억 제유전자부근에 위치하는 극소위성의 유전적 변화를 관찰하였다.
- 본 연구에서 저자들은 비소세포폐암의 분자유전학 적 특징을 알아보기 위하여 종양억제유전자인 P53과 FHIT의 돌연변이 여부를 확인하고 종양억제유전 자 부근에 위치하는 극소위성의 유전적 변화를 관찰하였다.
가설 설정
- A : N lane demonstrates two alleles of equal intensity, whereas T lane shows a shift in intensity to one dominant allele. B : T lane shows a generation of a novel allele. (N ; normal tissue DNA, T ; tumor tissue DNA)
제안 방법
- 1% Triton X-100, 5mM MgClz, 각 ImMdNTP, 20units RNase inhibitor, 15units AMV 역전사효소. 0, 5佬 oligo(dT)15, 1 傕 total RNA가 포함된 20必 용액을 30분 동안 42℃에서 반응시켜 보체 DNA(eDNA)를 합성하고, 95P에서 5분간 가열하여 역전사 효소를 비활성시킨 뒤, 이 cDNA 표본 2以 을 최종 부피가 30以 가 되 도록 PCR master mix를 첨가하였다. FHIT 유전자 의 exon 5~6를 걸쳐 있는 primer로 Plf/lr (sense : 5' - GAGAAAGAAGGTATCCTAGG - 3’ ; antisense : 5' - TGAGAGAGGTCCCATGA- AA2')을, 色xon6~9에 걸쳐 있는 primere P2f/ r (sense:5-ATGGGACCTCTCTCACCTTT-3, ; antisense : 5T - GCGGTCTTCAAACTGGTTGG - 3')을 사용하였다.
- 반웅조건은 9¥C에서 3분 동안 변성시키고 94Q에서 丄분간 denaturation 단계, 각 알맞은 온도에서 1분간 annealing 단계, 72V 에서 1분간 extension 단계를 주기로 하여 35 번 반복시행 시킨 후 72℃에서 7분동안 extension 반응을 추가로 시켰다. 8% non-denaturing acrylamide gel에 PCR 산물 10以 를 점적하여 250V로 15시간 동안 전기영동한 후, 은염색으로 발 색하여 band# 분석하였다.
- 0, 5佬 oligo(dT)15, 1 傕 total RNA가 포함된 20必 용액을 30분 동안 42℃에서 반응시켜 보체 DNA(eDNA)를 합성하고, 95P에서 5분간 가열하여 역전사 효소를 비활성시킨 뒤, 이 cDNA 표본 2以 을 최종 부피가 30以 가 되 도록 PCR master mix를 첨가하였다. FHIT 유전자 의 exon 5~6를 걸쳐 있는 primer로 Plf/lr (sense : 5' - GAGAAAGAAGGTATCCTAGG - 3’ ; antisense : 5' - TGAGAGAGGTCCCATGA- AA2')을, 色xon6~9에 걸쳐 있는 primere P2f/ r (sense:5-ATGGGACCTCTCTCACCTTT-3, ; antisense : 5T - GCGGTCTTCAAACTGGTTGG - 3')을 사용하였다. PCRe 94C 에서 1분, 50C에서 1분, 72℃에서 2분의 주기로 33회 반복 시행하고 72C 에서 7분동안 연장시켰다.
- FHIT 유전자의 exon 如9에 대해 Druck 등의 방법, , 으로 prim母'을 이용하여 (Tab!e 2) PCR을 시행하고 PCR 산물을 4 ℃ 30W로 3-4시간동안 전기영동한 후, 은염색으로 발색시켜 band틀 관찰하였다. PCR- SSCP에서 band를 감지할 수 없을 때는 ERCC I 유전자의 exon 4(5‘-CAGAGGGGCAATCCCGT- ACTT'와 /GCAGAGCTCATGAGGAAC* ; 118 bp) prim이.
- 반응조건은 9¥C 에서 5분 동안 변성시키고 94℃에서 1분간 denaturatiori 단계, 65℃ 에서 1분간 annealing 단계, 72笆에서 1분간 extension 단계를 주기로 하여 35번 반복시행 시킨 후, 추가로 72“C 에서 7분 동안 extension 반응을 하였다. PCR 산물 2以 에 loading dye (95% formamide, 20mM EDTA, 0.25% bromophenol blue, 0. 25% xylene cyanol) 2以 를 첨가하여 100 C 에서 5분간 변성시킨 후 재빨리 얼음에 넣어 반응산물을 처 리하였다. 다섯 배의 TBE(44.
- PCRe 94C 에서 1분, 50C에서 1분, 72℃에서 2분의 주기로 33회 반복 시행하고 72C 에서 7분동안 연장시켰다. RNA 에 대한 내부 대조군 인자로 &을 사용하였으며, PCR 반응 산물은 1-5% agarose g@l에 전기영동하여 ethidium bromide로 염색후 UV증]에서 관찰하였다.
- Exon 9인 경우는 3-globin(5, -CAACTTCAGTT- CACC-3 와 5'GAAGAGCCAAGGACAGGT- AC-3')을 사용하여 PCR을 하였다, PCR 은 94℃ 에서 30초, 57"C에서 30초, 72℃에서 1분을 주기 로 30번 시행하였다. SSCP상 정상조직에서 보이는 band와 다른 band는 잘라내어 Sequenase PCR product sequencing kit(Ame-rsham Life Science, Cleveland, U.S.A.)을 사용하여 염기서열 반응을 시 행하여 변화 여부를 확인하였다.
- Ltd, Tokyo, Japan)에 8시간 동안 노출시킨 후 현상하였다. SSCP상에서 변이 가 일어난 band 부위의 既1을 잘라내어 20以 멸균된 증류수를 넣고 80℃ 에서 15분 동안 반응시킨 다음 원심분리하여 상층액 중 10^ 를 취하여 위와 같은 방법으로 동위원소를 넣지 않고 PCR을 시행하여 PCR 산물을 Jetsofb gel extraction kit 시약 (GENOMED GmbH, Oeynhausen, Germany)으로 정제하여 염기서열 반응을 시켰다.
- 비소세포폐암으로 진단된 후 외과적 적출술을 시행받 은 환자 29명의 생검조직과 그에 대응하는 동일인의 정상조직을 대상으로 하였다. p53과 FHIT의 돌연변 이 여부는 PCR-SSCP, DNA 염기분석으로 확인하 였고 D3S1285, D9S171, TP53에서 극소위성 불안정 성과 이형접합성 상실은 PCR로 확인하였다. FHIT 유전자의 전사체 이상 여부 확인을 위해서는 RT- PCR을 사용하였다.
- 각 증폭된 DNA 산물은 Plf/lr과 P2f/2r 내부에 있는 primer (Si, 5'-GA GGACTCCGAAGAG- GTAGG3과 S2r, S'-GCAATAGCTCTTTTGC- TG-3”)를 가지고 Sequenase PCR product sequencing kit (Amersham Life Science, Cleveland, U.S.A.)를 사용하여 양쪽 가닥의 염기서열을 분석하였다.
- 세포 성장, 신호 전달 및 세포 주 기 조절에 관여하는 유전자들은 폐암으로의 발전 과정 중의 각기 다른 단계에서 손상을 받는다. 암유전자의 활성화나 종양억제유전자의 불활성화, 그리고 결과적 인 유전적인 불안정성의 증가는 폐암의 발암과정에서 일어나는 중요 사건으로 작용하며 임상적으로 폐암이 진단되기까지는 약 10내지 20여 가지의 유전적 변화가 축적되는 것으로 알려져 있다'% 본 연구에서 저자 들은 비소세포폐암에서 종양억제유전자인 P53과 FHIT의 돌연변이, FHIT 유전자의 전사체 이상 여부 를 확인하고 종양억제유전자부근에 위치하는 극소위 성의 유전적 변화를 관찰하였다.
대상 데이터
- LOH를 분석하기 위한 표지자(mark연「)로 FHIT 유 전자 부근(3pl4)에 있는 D3S12851, CDKN2 유전자 부근(9p21)에 있는 D9S171#, p53 유전자 부 근(17皿3)의 TP53을 선택하여 사용하였다. Primer fe- Bioneer(Bioneer Corp.
- 극소위성 표지자인 D3S1285, D9S171, TP53에 대한 분석은 각각 26예, 17예, 27예에서 가능하였다. D3S1285와 D9SW1에서 극소위성 불안정성은 각각 2예, 1예에서 관찰되었고 이형접합성 상실은 D3S1285, D9S171, TP53에서 각각 3예, 4예, 7예 관찰되었다.
- 비소세포폐암으로 진단된 후 외과적 적출술을 시행받 은 환자 29명의 생검조직과 그에 대응하는 동일인의 정상조직을 대상으로 하였다. 족직학적 분류는 WHO 분류체계'"어】, 병기는 TNM 분류체계“에 준하였다.
이론/모형
- 비소세포폐암으로 진단된 후 외과적 적출술을 시행받 은 환자 29명의 생검조직과 그에 대응하는 동일인의 정상조직을 대상으로 하였다. 족직학적 분류는 WHO 분류체계'"어】, 병기는 TNM 분류체계“에 준하였다. 모든 조직은 생검후 즉시 -70*C에 보관하였다.
- p53과 FHIT의 돌연변 이 여부는 PCR-SSCP, DNA 염기분석으로 확인하 였고 D3S1285, D9S171, TP53에서 극소위성 불안정 성과 이형접합성 상실은 PCR로 확인하였다. FHIT 유전자의 전사체 이상 여부 확인을 위해서는 RT- PCR을 사용하였다.
- Gilliland 등의 방법 技을 응용하여 reverse transcription system (PromegaTM, Madison Corp., U.S.A.) 을 사용하여 RT-PCR을 시행하였다. lOmM Tris- HCKpH 8.
- 염기서열 결정은 S귰등의 방법 '2으로 PCR에서 와 동일한 pFimer를 사용하여 Sequenase PCR product sequencing kit(Amersham Life Science, Cleveland, U.S.A.)를 이용하여 정제한 증폭산물의 염기서열을 결정하였다.
성능/효과
- 1) p53 유전자의 변이는 2예에서 관찰되었고 모두 exon 5에서 1개의 염기가 치환되는 점돌연변이였다.
- 2) 극소위성 불안정성은 D3S1285와 D9S1 기에서 각각 2예, 1예, 이형접합성 상실은 D3S1285, D9S171, TP53에서 각각 3예, 4예, 7예가 관찰되었다.
- 3) FHIT 유전자의 변이는 11예에서 관찰되었으며 이 중 6예는 exon 8의 codon 98에서 염기서열이 CAT가 CAC로 바뀌는 잠재적 치환이었다.
- 4) FHIT 유전자의 전사체 이상은 &actin이 제대 로 발현되는 15예중 4예에서 관찰되었으며 exon 6- 9의 결실로 확인되었다.
- 극소위성 표지자인 D3S1285, D9S171, TP53에 대한 분석은 각각 26예, 17예, 27예에서 가능하였다. D3S1285와 D9SW1에서 극소위성 불안정성은 각각 2예, 1예에서 관찰되었고 이형접합성 상실은 D3S1285, D9S171, TP53에서 각각 3예, 4예, 7예 관찰되었다. 극소위성 변이는 종양의 조직형에 따라서는 대세포암과 편평세포암에서 빈도가 높았으며 병기에 따른 빈도의 차이는 없었다(Table 4, Fig.
- FHIT 유전자에 이상이 있거나 결실이 있는 전사체를 보고자 RT-PCR을 시행한 결과 내부 대조군 인자인 步actin이 제대로 발현되는 15예중 4예에서 exon 6 -9의 해당부위에 결실이 관찰되었다(Fig. 9).
- FHIT 유전자의 변이를 확인하기 위해 exon 5, 6, 7, 8, 9을 PCR-SSCP을 시행한 결과 11예에서 변이가 관찰되었다. 변이가 있는 띠를 염기서열 분석한 결과 변이는 6예에서 동일하게 exon 8의 nucleotide 565, codon 98에서 염기서열이 CAT가 CAC로 바뀌었으나 아미노산 복제(histidine)에는 영향을 미치지 않는 잠재적 치환이었다(Fig.
- p53 유전자의 변이를 확인하기 위해 exon 5, 6, 7, 8 올 PCR-SSCP을 시행한 결과 29예중 2예에서 변이 가 관찰되었다. 변이는 으xon 5에서 나타났으며 모두 1개의 염기가 치환되는 점돌연변이였다.
- FHIT 유전자의 변이를 확인하기 위해 exon 5, 6, 7, 8, 9을 PCR-SSCP을 시행한 결과 11예에서 변이가 관찰되었다. 변이가 있는 띠를 염기서열 분석한 결과 변이는 6예에서 동일하게 exon 8의 nucleotide 565, codon 98에서 염기서열이 CAT가 CAC로 바뀌었으나 아미노산 복제(histidine)에는 영향을 미치지 않는 잠재적 치환이었다(Fig. 7, 8).
- 다양한 염색체 좌위에서 유전물질의 손실은 결과적 으로 이형접합성 상실을 유발하며 이는 다양한 인체 종양에서 발견되고 폐암을 포함한 많은 종양의 염색체 3p, 9p, 17p에서 혼히 발견된다11. 본 연구에서 염색체 3p, 9p, 17p에서 62%의 이형접합성 상실을 보였으 며 좌위별로는 각각 12%, 24%, 26%로 관찰되어 극 소위성 불안정성보다는 높은 빈도를 보였다. 이를 세 포형에 따라 나누었을 때 선암에 비해 대세포암과 편 평세포암에서의 빈도가 높았으며 이는 이전의 보고& 에서와 일치된 결과였다.
- 극소위성 불안정 성의 빈도에 대한 상기 차이는 각 연구에 사용된 극소 위성 표지자의 다양성 us?, 각 연구의 대상이 되었던 종양의 병기가 동일하지 않은 이유, 혹은 지리적 또는 인종적 차이로 생겼을 가능성泌 등을 고려해 볼 수 있 匸}. 본 연구에서는 각각 3p, 9p, 17p에 우]치하는 3개의 극소위성 표지자에 대한 불안정성이 8%의 빈도로 관찰되었으며 전자와 마찬가지로 단지 하나의 좌위에 국한되어 있었다. 이러한 결과는 폐암과 같이 외부적 노출과 관련된 종양에서 DNA mismatch 경로와 관 계되는 유전적 변이는 발암과정에 있어 단지 작은 역할을 함을 저】시하는 것으로 생각해 볼 수 있다旳.
후속연구
- 특히 극소위성의 분석은 편평세포암에서 종양표지자 로서의 역할이 기대된다. 이런 발암과정에 대한 이해는 예방, 진단 및 치료적 접근을 발전시키는데 도움을 줄 수 있을 것이고 향후 이들에 관한 기능적 연구들이 수행되어야 할 것이다.
- 이상으로 비소세포폐암 발생에 p53, FHIT 유전자 의 변이, 극소위성 불안정성 및 이형접합성 상실 등 다양한 분자유전학적 기전이 복합적으로 작용할 것으로 생각되며 이러한 발암과정에 대한 이해는 예방, 진 단 및 치료적 접근을 발전시키는데 도움을 줄 수 있을 것이고 향후 이들에 관한 기능적 연구들이 수행되어야 하겠다.
- 이상으로 비소세포폐암 발생에 p53, FHIT 유전자의 변이, 극소위성 불안정성과 이형접합성 상실 등 다양한 분자유전학적 기전이 복합적으로 작용할 것으로 생각되며 이번 연구에서 조사된 유전적 이상의 빈도는 앞서 발표된 서양의 연구결과와 대체적으로 일치한다. 특히 극소위성의 분석은 편평세포암에서 종양표지자 로서의 역할이 기대된다.
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