Oligonucleotide chip을 이용한 Rifampin 내성 결핵균의 rpoB 유전자 돌연변이 검출 Detection of rpoB Gene Mutation in Rifampin-Resistant M. Tuberculosis by Oligonucleotide Chip원문보기
연구배경 : 결핵발병률과 다제내성 결핵균주의 증가로 효과적인 치료 및 관리를 위해 보다 신속하고 정확한 약제내성의 진단이 필요한 실정이다. 이에 다제내성 중요한 표지자인 rifampin 내성의 주요 기전인 rpoB 유전자 돌연변이 검출을 위해 기존의 직접 염기 서열분석과 최근 유전자 발현, 유전자 변이 및 다형성, 그리고 염기서열분석 등의 연구에 중요한 기술로 이용되어지는 oligonucleotide chip 기술을 이용하기 위한 간편하고 정확한 돌연변이 검출법을 개발하고자 시행하였다. 방법 : 본 연구에는 rifampin 내성 결핵 균주 28예와 10예의 감수성 균주 총 38예의 rifampin 내성 결해 균주를 선택하였고, wild type probe 6종류와 돌연변이 출현빈도가 높은 12종류의 probe를 제작하여 총 18 종류의 oligonucleotide probe를 고형지지체에 부착 시킨 저밀도 oligonucleotide chip을 제작하였으며 oligonucleotide chip을 이용한 rpoB 돌연변이 검출과 결과를 직접염기서열 분석 결과와 비교하였다. 결과 : Oligonucleotide chip 분석 결과 rifampin 감수성 균주에서 모두 각 codon의 wild type probe와 반응이 나타났으며, 내성 균주에서는 돌연변이가 나타난 codon을 제외한 codon 의 경우는 wild type probe와 반응이 일어났으며, 각 균주 별 돌연변이가 나타난 codon은 정확하게 그에 해당하는 돌연변이 probe와 반응함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 직접 염기 서열 분석 결과와 서로 일치함을 알 수 있었다. 또한 oligonucleotide chip 분석 결과와 염기서열 분석 결과에서 rpoB 유전자의 codon 531과 526에서 대부분 돌연변이가 검출되어 rpoB 유전자의 돌연변이 중 큰 비중을 차지함을 또한 알 수 있었다. 결론 : 결핵균의 rifampin 내성 획득에 중요한 기전인 rpoB 유전자의 돌연변이를 저밀도의 oligonucleotide chip을 이용하여 검출할 수 있었으며 향후 지속적인 개선에 의하여 항생제 내성 진단의 자동화를 위한 유용한 수단이 될 것으로 기대된다.
연구배경 : 결핵발병률과 다제내성 결핵균주의 증가로 효과적인 치료 및 관리를 위해 보다 신속하고 정확한 약제내성의 진단이 필요한 실정이다. 이에 다제내성 중요한 표지자인 rifampin 내성의 주요 기전인 rpoB 유전자 돌연변이 검출을 위해 기존의 직접 염기 서열분석과 최근 유전자 발현, 유전자 변이 및 다형성, 그리고 염기서열분석 등의 연구에 중요한 기술로 이용되어지는 oligonucleotide chip 기술을 이용하기 위한 간편하고 정확한 돌연변이 검출법을 개발하고자 시행하였다. 방법 : 본 연구에는 rifampin 내성 결핵 균주 28예와 10예의 감수성 균주 총 38예의 rifampin 내성 결해 균주를 선택하였고, wild type probe 6종류와 돌연변이 출현빈도가 높은 12종류의 probe를 제작하여 총 18 종류의 oligonucleotide probe를 고형지지체에 부착 시킨 저밀도 oligonucleotide chip을 제작하였으며 oligonucleotide chip을 이용한 rpoB 돌연변이 검출과 결과를 직접염기서열 분석 결과와 비교하였다. 결과 : Oligonucleotide chip 분석 결과 rifampin 감수성 균주에서 모두 각 codon의 wild type probe와 반응이 나타났으며, 내성 균주에서는 돌연변이가 나타난 codon을 제외한 codon 의 경우는 wild type probe와 반응이 일어났으며, 각 균주 별 돌연변이가 나타난 codon은 정확하게 그에 해당하는 돌연변이 probe와 반응함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 직접 염기 서열 분석 결과와 서로 일치함을 알 수 있었다. 또한 oligonucleotide chip 분석 결과와 염기서열 분석 결과에서 rpoB 유전자의 codon 531과 526에서 대부분 돌연변이가 검출되어 rpoB 유전자의 돌연변이 중 큰 비중을 차지함을 또한 알 수 있었다. 결론 : 결핵균의 rifampin 내성 획득에 중요한 기전인 rpoB 유전자의 돌연변이를 저밀도의 oligonucleotide chip을 이용하여 검출할 수 있었으며 향후 지속적인 개선에 의하여 항생제 내성 진단의 자동화를 위한 유용한 수단이 될 것으로 기대된다.
Background : Oligonucleotide chip technology has proven to be a very useful tool in the rapid diagnosis of infectious disease. Rifampin resistance is considered as a useful marker of multidrug-resistance in tuberculosis. Mutations in the rpoB gene coding $\beta$ subunit of RNA polymerase ...
Background : Oligonucleotide chip technology has proven to be a very useful tool in the rapid diagnosis of infectious disease. Rifampin resistance is considered as a useful marker of multidrug-resistance in tuberculosis. Mutations in the rpoB gene coding $\beta$ subunit of RNA polymerase represent the main mechanism of rifampin resistance. The purpose of this study was to develop a diagnosis kit using oligonucleotide chip for the rapid and accurate detection of rifampin-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Method : The sequence specific probes for mutations in the rpoB gene were designed and spotted onto the glass slide, oligonucleotide chip. 38 clinical isolates of Mycobacterium were tested. A part of rpoB was amplified, labelled, and hybridized on the oligonucleotide chip with probes. Results were analyzed with a laser scanner. Direct sequencing was done to verify the results. Result : The low-density oligonucleotide chip design어 to determine the specific mutations in the rpoB gene of M. tuberculosis accurately detected rifampin resistance associated with mutations in 28 clinical isolates. Mutations at codons 531, 526, and 513 were confirmed by direct sequencing analysis. Conclusion : Mutant detection using oligonucleotide chip technology is a reliable and useful diagnostic tool for the detection of multidrug-resistance in M. tuberculosis.
Background : Oligonucleotide chip technology has proven to be a very useful tool in the rapid diagnosis of infectious disease. Rifampin resistance is considered as a useful marker of multidrug-resistance in tuberculosis. Mutations in the rpoB gene coding $\beta$ subunit of RNA polymerase represent the main mechanism of rifampin resistance. The purpose of this study was to develop a diagnosis kit using oligonucleotide chip for the rapid and accurate detection of rifampin-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Method : The sequence specific probes for mutations in the rpoB gene were designed and spotted onto the glass slide, oligonucleotide chip. 38 clinical isolates of Mycobacterium were tested. A part of rpoB was amplified, labelled, and hybridized on the oligonucleotide chip with probes. Results were analyzed with a laser scanner. Direct sequencing was done to verify the results. Result : The low-density oligonucleotide chip design어 to determine the specific mutations in the rpoB gene of M. tuberculosis accurately detected rifampin resistance associated with mutations in 28 clinical isolates. Mutations at codons 531, 526, and 513 were confirmed by direct sequencing analysis. Conclusion : Mutant detection using oligonucleotide chip technology is a reliable and useful diagnostic tool for the detection of multidrug-resistance in M. tuberculosis.
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문제 정의
본 연구는 결핵균에서 rifampin 내성의 주된 기전으로 알려져있는 rpoB 유전자의 69 bp의 hotspot 부위를 표적 염기서열로 하여 중요 돌연변이 부위들을 prabe 제작하여 저밀도의 oligonucleotide chip을 제작하고, 이를 이용하여 rifampin 내성 결핵균의 진단법을 개발하고자 하였다. 그 결과를 직접염기서열분석 결과와 비교하여 확인함으로서 진단용 kit로서의 개발 가능성을 확인하였다.
. 본 연구에 이용된 oligonucleotide chip 기술은 국외에서는 Affymatrix에서 고밀도의 oligonucleo tide chip을 제작하여 연구결과를 보고하고 있으나 국내에서는 저밀도의 chip이지만 최신의 기술을 처음으로 적용하여 보고함에 그 의의를 둘 수 있을 것이다. 이러한 oligonucleotide chip 기술은 유전자 발현, 유전자 변이, 다형성(polymorphism), 그리고 DNA 염기서열분석 등의 연구에 활용 될 것으로 기대하고 있다.
결핵발병률과 다제내성 결핵균주의 증가로 효과적인 치료 및 관리를 위해 보다 신속하고 정확한 약제내성 의 진단이 필요한 실정이다. 이에 다제내성 결핵균의 중요한 표지자인 rifampin 내성의 주요 기전인 rpoB 유전자 돌연변이 검출을 위해 기존의 직접 염기서열분석과 최근 유전자 발현, 유전자 변이 및 다형성, 그리고 염기서열분석 등의 연구에 중요한 기술로 이용되어지는 oligonucleotide chip 기술을 이용하기 위한 간편하고 정확한 돌연변이 검출법을 개발하고자 시행하였다.
제안 방법
반응이 끝난 후 PCR 산물을 에탄올로 침전시킨 후 건조시켜 loading buffer인 formamide/50mM EDTA (5:1) 6 μl 에 녹여 90℃에서 2분간 변성시켰다. ABI 377A DNA sequencer에서 전기영동하고 염기서열 분석프로그램 으로 결과를 분석하였다.
DNA 염기서열 분석은 ABI 377A 자동염기서열분석기(PE Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였다. 주형 DNA 농도를 20 ng/μl, primer 농도를 1.
이상에서와 같이, oligonucleotide chip을 이용한 실험에서는 우선 rifampin 감수성 균주를 정확하게 검출할 수 있었으며, 내성 균주 역시 감수성 균주와 확실한 차이를 볼 수 있었다. Oligonulceotide chip을 이용한 내성 균주 검출 결과의 정확성과 정확한 돌연변이의 유형을 알아내기 위해 직접염기서열 결정을 실시하였다.
실험에 사용한 모든 primer는 Canada의 BioBasic사에 의뢰하여 Perkin-Elmer DNA synthesizer로 50 nmol 농도로 제작된 oligonucleotide를 사용하였다. PCR 반응물의 조성은 500 mM KCl, 100 mM Tris HC1 (pH 9.0), 1% Triton X-100, 0.2 mM deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dTTP and dCTP), 1.5 mM MgCl2, 10 pmol primer와 1 U Taq DNA polymerase (BioBasic Inc. Canada)로 구성되었고, template DNA 2 μl와 함께 총 25μl 가 되게 하였다. 이 혼합액을 94℃에서 3분간 반응시켜 충분히 변성시킨 후 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 1분 씩 35회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃예서 10분간 연장하였다.
PCR 산물과 probe와의 결합유무를 확인하기 위해, Cy5-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 SSC와 BSA(Bovine Serum Albumin)를 이용하여 희석한 후 약 40 μl 를 slide 에 분주하여 cover well 덮고 빛올 차단한 후 50℃에서 약 20분간 반응시켰다. 반응 후 slide를 2×SSC, 그리고 0.
이 혼합액을 94℃에서 3분간 반응시켜 충분히 변성시킨 후 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 1분 씩 35회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃예서 10분간 연장하였다. 반응이 끝난 후 2% agarose gel에 전기영동하여 157 bp의 PCR 산물을 확인하였다.
배양이 확인된 균주의 집락을 1백금이를 따서 미세원 심관에 넣고 InstaGene matrix (Bio-Rad Co. USA)를 200μl 가하여 부유 시킨 후 항온수조에서 56℃로 30분간 반응시키고 10초 동안 진탕 한 후 100℃에서 8분간 열처리하였다. 다시 10초간 진탕한 후 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 새 원심관으로 옮겨 -20℃에 보관하였다.
본 연구에 사용된 38검체 중 rifampin 내성인 28균 주와 감수성인 10검체를 대상으로 rpoB 유전자의 hot spot 부위를 rpo3과 rpo4 primer를 이용하여 codon 511에서 codon 533의 69 bp를 포함하는 157 bp를 증폭시켜 DNA 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 Table 2에 요약하였다.
본 연구에는 rifampin 내성 결핵 균주 28예와 10예의 감수성 균주 총 38예의 rifampin 내성 결핵 균주를 선택하였고, wild type probe 6종류와 돌연변이 출현빈도가 높은 12종류의 probe를 제작하여 총 18종류의 oligonucleotide probe를 고형지지체에 부착시킨 저밀도 oligonucleotide chip을 제작하였으며 oligonucleotide chip을 이용한 rpoB 돌연변이 검출과 결과를 직접염기서열 분석 결과와 비교하였다.
Sodium borohydride 용액으로 세척하고 다시 끓는 증류수에 세척하였다. 실온에서 0.2% SDS와 증류수를 이용하여 세척한 후 원심분리기를 이용하여 slide를 완전하게 건조시켜 oligonucleotide chip 제작을 완료하였다.
이미 보고된 rpoB 유전자에서의 돌연변이 출연빈도가 높은 염기서열을 바탕으로 돌연변이를 검출하는 12종류의 probe와 wild type을 검출하는 6종류의 probe를 고안하였다(Table 1). 19~22 mer의 18개의 probe를 BioBasic사에 의뢰하여 제작하였다.
DNA 염기서열 분석은 ABI 377A 자동염기서열분석기(PE Biosystems, USA)를 이용하여 분석하였다. 주형 DNA 농도를 20 ng/μl, primer 농도를 1.6 pmol로 하여 ABI prism BigDye terminator sequencing kit를 이용하여 반응시키고, 95℃에서 5분간 반응시킨 후, 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 70℃에서 4분씩 25회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃ 에서 10분간 연장시켰다. 반응이 끝난 후 PCR 산물을 에탄올로 침전시킨 후 건조시켜 loading buffer인 formamide/50mM EDTA (5:1) 6 μl 에 녹여 90℃에서 2분간 변성시켰다.
혼성화 과정에서 혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 DNA를 세척하기 위해 2×SSC(300mM NaCl, 30mM Na-Citrate, pH 7.0)/0.2% SDS 용액을 이용하여 cover slip을 제거한 후에 2×SSC/0.2% SDS 세척 용액과 2×SSC, 그리고 0.2×SSC 용액 순으로 slide를 세척하였다. 마지막으로 원심분리기를 이용하여 세척한 slide를 완전하게 건조시켰다.
대상 데이터
이미 보고된 rpoB 유전자에서의 돌연변이 출연빈도가 높은 염기서열을 바탕으로 돌연변이를 검출하는 12종류의 probe와 wild type을 검출하는 6종류의 probe를 고안하였다(Table 1). 19~22 mer의 18개의 probe를 BioBasic사에 의뢰하여 제작하였다. Probe는 spotting 용액인 3×SSC 용액에 30 pmol로 희석하여 96 well microplates에 옮겨서 Microspotting 용액을 첨가하여 섞어서 사용하였다, 이와 같이 제작된 각 프로브를 Fig.
부산대학교병원 및 국립마산결핵병원을 내원하여 결핵으로 추정되어 객담 항산균 도말 및 배양검사를 실시한 한자의 세균배양균주중에서 임의로 38예를 선택하였다. 28예는 rifampin 내성이며, 10예는 rifampin 감수성이었다.
Oligonucleotide chip이란 유전자 검색용으로써, 기존에 널리 이용되는 유전자 분석방법인 Southern 과 Northern blot의 문제점인 한번에 수십개 이상의 유전자들을 검색하기 어려운 점을 극복하기 위해 많은 종류의 probe를 고밀도로 고형지지체에 붙여놓은 것을 말한다. 본 연구에 이용된 oligonucleotide chip은 157 bp 내에서 결핵균의 rifampin 내성을 일으키는 rpoB 돌연변이 출현빈도가 높은 12가지를 포함하는 것으로 지금까지 보고된 rifampin 내성 결핵균의 90% 이상을 검출할 수 있도록 디자인되었다(Table 1). Fig.
본 연구의 oligonucleotide chip 분석에는 rifampin 내성 균주 28예와 감수성 균주 10예로서 모두 38예의 M. tuberculosis 균주를 사용 하였다. Oligonucleotide chip 실험결과 rifampin 감수성 균주 10예 모두에서는 Fig.
부산대학교병원 및 국립마산결핵병원을 내원하여 결핵으로 추정되어 객담 항산균 도말 및 배양검사를 실시한 한자의 세균배양균주중에서 임의로 38예를 선택하였다. 28예는 rifampin 내성이며, 10예는 rifampin 감수성이었다.
. 실험에 사용한 모든 primer는 Canada의 BioBasic사에 의뢰하여 Perkin-Elmer DNA synthesizer로 50 nmol 농도로 제작된 oligonucleotide를 사용하였다. PCR 반응물의 조성은 500 mM KCl, 100 mM Tris HC1 (pH 9.
데이터처리
2×SSC 용액을 사용하여 세척하였다. 분석을 위해 비공초점 레이져 스캐너(non-confoeoal laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 결과를 분석하였다. 이에 대한 예상결과 분석법을 Fig.
성능/효과
2). 12개의 돌연변이 probe에서 제외된 균주의 경우 해당하는 codon은 wild type과 돌연변이 probe 모두에서 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 직접 염기서열 분석 실험을 통해 그 결과가 일치함을 또한 확인할 수 있었다.
직접염기 서열 분석 결과 10예의 감수성 균주인 경우 돌연변이가 관찰되지 않은 정상 염기서열을 보였으며 이는 oligonucleotide chip 실험에 사용한 wild type의 균주와 정확하게 일치하였다. 28예의 rifampin 내성 균주의 직접염기서열 분석 결과 21.4%에 해당하는 6예에서는 H526Y 돌연변이가 검출되었으며 3예에서는(10.7%) H526D의 돌연변이를 나타냈다. 이는 Fig.
2). Codon 526에서의 또 다른 염기서열 분석 결과인 H526C 돌연변이는 Fig. 3G 실험에 사용한 균주로서 codon 526의 wild type probe와 5가지의 mutant type probe 어느 것과도 반응하지 않은 Fig. 2의 526 mutation 결과로서 chip 실험 결과와 직접염기서열 분석 결과가 일치하였다.
Oligonucleotide chip 분석과 직접 염기서열 분석 결과 rpoB 유전자의 돌연변이 양상을 살펴보면, 본 연구에서 rifampin 내성 결핵균주의 82%가 codon 531과 526에서 돌연변이가 검출되었다. Codon 531과 526게서의 돌연변이 빈도는 Table 3과 Fig. 4에 서처럼 보는 것처럼 기존의 돌연변이 빈도와 비교했을 때 codon 531의 serine이 leucine으로 치환된 경우가 39.3%를 나타냈으며 codon 526의 histidine이 tyrosine으로 치환된 경우는 21.4%, aspartic acid 로 치환된 경우는 10.7%를 나타내어 두 codon 531과 526의 3가지 돌연변이가 본 연구 rpoB 돌연변이의 71%를 차지하는 것으로 나타났다. codon 531과 526을 제외한 돌연변이 부위로는 codon 513에서 17.
4에 다타내었다. Codon 531의 S531L은 39.3 %로서 가장 높은 빈도를 나타냈으며, 다음으로는 codon 526의 H526Y의 21.4%가 높은 돌연변이 출현빈도를 보였다. 이는 이미 보고된 자료에서도 각각 39.
2의 예상 분석결과와 함께 알 수 있었다. Codon 531의 경우 codon 526의 경우에서 처럼 codon 531을 제외한 부분에서는 wild type probe가 반응하였으나 codon 531의 경우에는 역시 해당되는 염기서열이 존재하는 돌연변이 probe만이 반응하여 예상 결과분석 유형과 일치함을 알 수 있었다(Fig. 2). 12개의 돌연변이 probe에서 제외된 균주의 경우 해당하는 codon은 wild type과 돌연변이 probe 모두에서 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.
본 연구에 이용된 oligonucleotide chip은 157 bp 내에서 결핵균의 rifampin 내성을 일으키는 rpoB 돌연변이 출현빈도가 높은 12가지를 포함하는 것으로 지금까지 보고된 rifampin 내성 결핵균의 90% 이상을 검출할 수 있도록 디자인되었다(Table 1). Fig. 3의 결과에서 rifampin 감수성 균주에서는 각 codon의 wild type probe 만이 반응하였고, codon 526에 돌연변이가 있는 경우 codon 526을 제외한 다른 부위에서는 wild type probe가 발현되었으며 codon 526에서는 돌연변이 검출 가능한 5종류의 프로브 중 염기서열이 정확히 일치하는 하나의 probe와 반응하는 것을 Fig. 2의 예상 분석결과와 함께 알 수 있었다. Codon 531의 경우 codon 526의 경우에서 처럼 codon 531을 제외한 부분에서는 wild type probe가 반응하였으나 codon 531의 경우에는 역시 해당되는 염기서열이 존재하는 돌연변이 probe만이 반응하여 예상 결과분석 유형과 일치함을 알 수 있었다(Fig.
Oligonucleotide chip 분석 결과 rifampin 감수성 균주에서 모두 각 codon의 wild type probe와 반응이 나타났으며, 내성 균주에서는 돌연변이가 나타난 codon을 제외한 codon의 경우는 wild type probe와 반응이 일어났으며, 각 균주별 돌연변이가 나타난 codon은 정확하게 그에 해당하는 돌연변이 probe와 반응함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 직접 염기 서열 분석 결과와 서로 일치함을 알 수 있었다.
Oligonucleotide chip 분석과 직접 염기서열 분석 결과 rpoB 유전자의 돌연변이 양상을 살펴보면, 본 연구에서 rifampin 내성 결핵균주의 82%가 codon 531과 526에서 돌연변이가 검출되었다. Codon 531과 526게서의 돌연변이 빈도는 Table 3과 Fig.
tuberculosis 균주를 사용 하였다. Oligonucleotide chip 실험결과 rifampin 감수성 균주 10예 모두에서는 Fig. 2에서의 wild type 예상 분석결과 유형과 같이 probe rpo 511-WL, rpo 513-WQ, rpo 516-WD, rpo 522-WS, rpo 526-WH, 그리고 rpo 531-WS의 6종류의 wild type probe와 반응하여 rifampin 감수성 균주임을 확인할 수 있었다(Fig. 3A). 내성균주의 경우 Table 1과 Fig.
8%을 나타냈다. rifampin 내성 결핵균주의 80% 이상이 codon 531과 526에서 돌연변이가 분포한다 는 연구보고에서처6,10 본 연구에서도 82%가 이 부위에서 검출된 결과로 보아 rifampin 내성의 주 기전은 rpoB의 돌연변이 임을 알 수 있었으며 그 중에서도 codon 531과 526의 돌연변이가 큰 비중을 차지함을 알 수 있었다.
본 연구는 결핵균에서 rifampin 내성의 주된 기전으로 알려져있는 rpoB 유전자의 69 bp의 hotspot 부위를 표적 염기서열로 하여 중요 돌연변이 부위들을 prabe 제작하여 저밀도의 oligonucleotide chip을 제작하고, 이를 이용하여 rifampin 내성 결핵균의 진단법을 개발하고자 하였다. 그 결과를 직접염기서열분석 결과와 비교하여 확인함으로서 진단용 kit로서의 개발 가능성을 확인하였다.
3). 두 유형인 Fig. 3B와 C는 예상분석 결과인 Fig. 2에서처럼 각각 codon 526의 돌연변이 probs와 반응한 H526Y와 H526D 유형으로 나타났는데 Fig. 3C 의 경우는 codon 526의 mutant probe와는 정확하게 반응이 일어났으며 codon 531에서는 wild type과 mutant type probe 에서 모두 반응을 보였으나 wild type에서 보다 강하게, signal을 나타내어 mutant probe와는 비특이적인 반응이 일어난 것으로 추정되었다(Fig. 3B, C). 다른 2가지 유형은 Fig.
이러한 결과는 직접 염기 서열 분석 결과와 서로 일치함을 알 수 있었다. 또한 oligonucleotide chip 분석 결과와 염기서열 분석 결과에서 rpoB 유전자의 codon 531과 526에서 대부분 돌연변이가 검출되어 rpoB 유전자의 돌연변이 중 큰 비중을 차지함을 또한 알 수 있었다.
7%로 높은 돌연변이 출현빈도를 보이고 있음을 확인할 수 있었다. 보고된 자료와는 달리 본 실험에서는 codon 513의 Q513K가 10.7%로서 상당히 높은 빈도를 나타내었다(Table 2).
3B와 C에서 사용한 균주와 일치하는 것으로 oligonucleotide chip의 결과와 정확하게 일치함을 알 수 있었다. 본 연구의 돌연변이 출현빈도 중 가장 높은 39.3%와 3.6%를 차지한 S531L 의 돌연변이와 S531W 돌연변이 역시 Fig. 3D, E의 oligonucleo tide chip 결과와 일치하는 결과를 나타냈다. 다음으로 codon 513에 돌연변이가 일어난 경우로 Q513K와 Q513P가 각각 10.
7%) H526D의 돌연변이를 나타냈다. 이는 Fig. 3B와 C에서 사용한 균주와 일치하는 것으로 oligonucleotide chip의 결과와 정확하게 일치함을 알 수 있었다. 본 연구의 돌연변이 출현빈도 중 가장 높은 39.
이상에서와 같이, oligonucleotide chip을 이용한 실험에서는 우선 rifampin 감수성 균주를 정확하게 검출할 수 있었으며, 내성 균주 역시 감수성 균주와 확실한 차이를 볼 수 있었다. Oligonulceotide chip을 이용한 내성 균주 검출 결과의 정확성과 정확한 돌연변이의 유형을 알아내기 위해 직접염기서열 결정을 실시하였다.
12개의 돌연변이 probe에서 제외된 균주의 경우 해당하는 codon은 wild type과 돌연변이 probe 모두에서 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 직접 염기서열 분석 실험을 통해 그 결과가 일치함을 또한 확인할 수 있었다.
그 결과는 Table 2에 요약하였다. 직접염기 서열 분석 결과 10예의 감수성 균주인 경우 돌연변이가 관찰되지 않은 정상 염기서열을 보였으며 이는 oligonucleotide chip 실험에 사용한 wild type의 균주와 정확하게 일치하였다. 28예의 rifampin 내성 균주의 직접염기서열 분석 결과 21.
후속연구
결핵균의 rifampin 내성 획득에 중요한 기전인 rpoB 유전자의 돌연변이를 저밀도의 oligonucleo tide chip을 이용하여 검출할 수 있었으며 향후 지속적인 개선에 의하여 항생제 내성 진단의 자동화를 위한 유용한 수단이 될 것으로 기대된다.
본 연구에 이용된 oligonucleotide chip 기술은 국외에서는 Affymatrix에서 고밀도의 oligonucleo tide chip을 제작하여 연구결과를 보고하고 있으나 국내에서는 저밀도의 chip이지만 최신의 기술을 처음으로 적용하여 보고함에 그 의의를 둘 수 있을 것이다. 이러한 oligonucleotide chip 기술은 유전자 발현, 유전자 변이, 다형성(polymorphism), 그리고 DNA 염기서열분석 등의 연구에 활용 될 것으로 기대하고 있다.
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