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문제 정의
- 본 연구에서는 항균활성이 우수한 회화나무 목부(임업연구원, 2000)로부터 물질을 단리하고 그 화학구조를 명확히 하였으며 단리물질의 항균활성을 조사하였다.
제안 방법
- SJD-5 분획물(29.17 g)을 DCM:MeOH(150:l~ 50:1, v/v)을 용출용매로 한 silica gel 칼럼(7.5X35 cm) 크로마토그라피를 이용하여 25 mL씩 530개로 분취 한 뒤 TLC 분석에 의해 17개의 분획물(SJD-5늬~ SJD-5-17)로 나누었다. SJD-5-3 분획에서 석출된 물질은 여과한 후(40 mg) benzene:EtOAc(7:l, v/v)을전개용매로 한 분취용 TLC로 분리 .
- SJD-5-13의 분획물에서 석출된 화합물을 여과하여 화합물 IV(23 mg) 를 단리하였다.
- 목재부후균 2종 및 표고해균 3종에 대하여 조사하였다. 그 결과 화합물 I 인 5, 7-dihydroxy-4, , 6-dimethoxyisoflavone 의 경우 lOQpg/mL의 농도에서 밤나무 동고병균인 C.
- 우수한 항균활성을 나타낸 회화나무 목부의 에탄올 추출물로부터 Sephadex LH-20과 silica gel column chromatography 등을 이용하여 4종의 isoflavonoid 화합물을 분리하였으며, 단리 물질에 대해서는 NMR 및 MS 등의 기기분석을 통하여 5, 7-dihydroxy-4', 6- dimethoxyisoflavon (irisolidone), 5, 7-dihydroxy- 4'-methoxyisoflavone (biochanin A), 7-hydroxy- 4'-methoxyisoflavone (formononetin), 7-hydroxy- 4'-inethoxyisoflavanone으로 각각 동정하였다. 이들 단리 물질의 항균활성을 조사한 결과 4종 공히 낮은 항균 활성을 나타내어 회화나무 목부의 높은 항균 활성은 본 실험에서 단리한 물질이외의 물질이 관여하는 것으로 추정되며 금후 관련물질의 탐색이 필요할 것으로 사료되었다.
- 위의 4개의 가용부 중 우선 디클로로메탄 가용부 (51.55 g)에 대해 MeOH:EtOH(l:l, v/v)을 용출 용매로 한 Sephadex LH-20 컬럼(7.0x65 cm) 크로마토그라피를 이용하여 16 mL씩 분취하여 550개의 분취물을얻었으며, 이들 분취물들은 TLC(silica gel 60 F254, 전개 용매: toluene-ethyl formate-formic acid = 5:4:l, v/v)에 전개시켜 UV (254 nm, 375 nm) 램프로 검색하여 9개의 분획물(SJDT~SJD-9)로 나누었다.
- 농축하였다. 이렇게 얻어진 EtOH 조추출물은 헥산(/Hiexane), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(BuOH)로 순차 연속 추출하여 용매분획을 실시하였다.
- SJD-5-3 분획에서 석출된 물질은 여과한 후(40 mg) benzene:EtOAc(7:l, v/v)을전개용매로 한 분취용 TLC로 분리 . 정제하여 황색의 분말인 화합물 I (8.0 mg)을 단리하였다.
대상 데이터
-
2.1 공시재료
공시수종으로는 1996년 7월 경상대학교 연습림(경남 산청군 시천면)에서 채취한 회화나무(수령: 20년, 흉고직경 : 9 cm)< 사용하였다.
- pini, Cryphonectria parasitica. 목재부후균인 Trametes versicolor, Tyromyces palustris, 표고해균인 Libertella betulina, Trichoderma viride, Tricho- derma harzianum을 사용하였다.
이론/모형
- 단리한 화합물의 질량(EI-MS)스팩트럼은 JEOL JMS-600W, 핵자기공명 (NMR) 스팩트럼 (@, 13C- NMR, "H COSY. NOESY, HMQC, HMBC)은 기초과학지원연구원 서울분소의 Varian UI 500을 이용하여 측정하였다.
- 항균활성검 정은 배지 점 적 법을 사용하여 균사 생장 억제율로 구하였다(이 등, 2000).
성능/효과
- 13C-NMR(DEPT) 스팩트럼에서는 총 17개의 탄소 시 그날이 나타났으며, 이 중 methoxyl기에 유래하는 탄소가 2개 , methine 탄소가 6개 , 그리고 quaternary 탄소가 9개임을 확인할 수 있었다. 3 180.
- 10의 singlet 시그날은 A환의 H-8의 methine proton에 귀속하였다. 그리고 3 3.79, d 3.80의 2개의 singlet 시그날은 methoxy]기에 유래하는 것으로 A환의 H-6와 B환의 H-4'로 각각 귀속하였는데, 이는 화합물I 의 NOESY 스팩트럼에서 H-3', H-5'와 C-4'의 methoxyl기와의 상관 peak와 HMBC 스팩트럼에서 C4'와의 교차 peak를 확인함으로써 methoxyl기가 C-4'에 존재함을 알 수 있었다.
- parasitica.에 대해 70.2%의 균사생장억제율을 나타내었으며, 작물병원균인 G. cingulata, F. oxysporum 및 표고해균인 T. viride, T. harzianum에 대해 30% 에서 40%의 억제율을 그리고 그 외의 공시균주에 대해서는 15% 전후의 억제율을 나타내어 높지는 않지만 항균 활성이 있는 것으로 판단되었다(Table 1). 이와 같이 isoflavanone구조인 화합물IV가 isoflavone구조인 화합물 I, II 및 m에 비해 상대적으로 활성이 높은 것은 flavanone 화합물이 flavone 화합물보다 항균 활성이 높다는 결과(Choi 등, 2001)와도 일치하는 것이다.
- parasitica.와 L. betulina 이외의 공시균주에 대해서는 낮은 억제율을 나타내었으며, T. versicolor의 생육도 억제하지 못하는 것으로 나타났다(Table 1). 특히, 화합물HI인 7- hydroxy-4'-methoxyisoflavone의 경우에는 100 pg/ mL의 농도에서 모든 공시균주에 대해 20%이하의 매우 낮은 균사생장억제율을 나타내어 항균활성이 없는 것으로 판단되었다(Table 3).
- parasitica.와 표고 해균인 L. betulina에 대해 각각 38.1%와 45.2%의 균사생장억제율을 나타내었을 뿐 그 외의 공시균주에 대해서는 10%전후의 매우 낮은 억제율을 나타내었으며, 백색부후균인 T. versicolor의 생육은 전혀 억제하지 못하는 것으로 나타났다(Table 3). 화합물II인 5, 7-dihydroxyl-4, -methoxyisofla- vone도 같은 경향을 나타내어 C.
- 이상의 결과로 화합물IV는 7-hydroxy-4'-methoxy- isoflavanone으로 동정하였다(Fig. 1).
- 이상의 기기 분석결과, 화합물IHe 7-hydroxy-4'- methoxyisoflavone, 즉 formononetin으로 동정하였다 (Fig.l).
- 이상의 기기분석결과, 화합물 I 은 5, 7-dihydroxy- 4', 6-dimethoxyisoflavone인 irisolidone으로 동정 되었다 (Fig. 1).
- 이상의 분석결과, 화합물Ⅱ는 5, 7-dihydroxyl-4'-methoxyisoflavoneel biochanin A로 동정하였다 (Fig. 1). 이는 Charles(1993)의 결과와도 일치하였으며 희화나무의 뿌리에서도 단리되었다는 보고가 있다.
- 이와 같이 isoflavanone구조인 화합물IV가 isoflavone구조인 화합물 I, II 및 m에 비해 상대적으로 활성이 높은 것은 flavanone 화합물이 flavone 화합물보다 항균 활성이 높다는 결과(Choi 등, 2001)와도 일치하는 것이다. 이상의 회화나무 목부로부터 분리된 4종의 화합물은 항균 활성이 낮은 것으로 나타났으며 이는 그 구조적인 특징에 기인하는 것으로 사료된다. 첫 번째 구조적인 특징은 isoflavonoid구조로, flavanone구조인 narin- genin(4, , 5, 7-trihydroxyflavanone) 보다 isoflavanone 구조인 genistein(4', 5, 7-trihydroxyisoflavanone)이 월등히 낮은 항균 활성을 나타낸 결과(Choi 등, 2001)에서 보는 바와 같이 4종 모두 isoflavonoid 화합물이므로 활성이 낮은 것으로 추측되었다.
- 이상의 회화나무 목부로부터 분리된 4종의 화합물은 항균 활성이 낮은 것으로 나타났으며 이는 그 구조적인 특징에 기인하는 것으로 사료된다. 첫 번째 구조적인 특징은 isoflavonoid구조로, flavanone구조인 narin- genin(4, , 5, 7-trihydroxyflavanone) 보다 isoflavanone 구조인 genistein(4', 5, 7-trihydroxyisoflavanone)이 월등히 낮은 항균 활성을 나타낸 결과(Choi 등, 2001)에서 보는 바와 같이 4종 모두 isoflavonoid 화합물이므로 활성이 낮은 것으로 추측되었다. 두 번째 특징은 methoxyl 기에 의한 것으로 naringenin(4', 5.
- 화합물HI의 13C-NMR 스팩트럼에서는 총 15개의 탄소 시그날이 나타났으며, 이 중 methine탄소가 8개, quaternary 탄소가 7개 있음을 알 수 있으며, 이 중 S 176.93의 시그날은 C-7에 귀속하였다.
- 회화나무 목부의 디클로로메탄 가용부로부터 얻어진 화합물 I 의 분자량은 EI-MS 스팩트럼에서 m/z 314로 나타났다.1H-NMR 스팩트럼에서 8 7.
후속연구
- 이들 단리 물질의 항균활성을 조사한 결과 4종 공히 낮은 항균 활성을 나타내어 회화나무 목부의 높은 항균 활성은 본 실험에서 단리한 물질이외의 물질이 관여하는 것으로 추정되며 금후 관련물질의 탐색이 필요할 것으로 사료되었다.
- 이상의 결과 본 실험에서 단리된 4종의 isoflavonoid 공히 낮은 항균활성을 나타내어 회화나무 목부의 높은 항균 활성(임업연구원, 2000)은 본 실험에서 단리한 물질 이외의 물질이 관여하는 것으로 추정되며 금후 관련물 질의 탐색이 필요할 것으로 사료되었다.
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