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문제 정의
- 본 연구는 염색체 1, 2, 4, 7, 8, 9 및 21번 염색체의 DNA probe를 이용하여 2Gy의 방사선을 조사한 후 기대치와 관찰치의 차이를 비교함으로서각 염색체의 방사선에 대한 감수성을 평가하여 궁극적으로 방사선 피폭시 생물학적 선량계로서 FISH기법의 타당성을 평가하고자 한다.
- 본 연구에서는 염색체의 방사선 감수성을 결정하기 위하여 실제 관찰된 염색체이상 빈도와 기대치를 비교하였다. 염색체 이상 빈도의 기대치는 Lucas (1992)에 의해 제안된 식에 따라 구하였다.
제안 방법
- 건강한 사람의 말초혈액을 선형 전자 가속기 (LINAC, Vnrian 6/100)로 에너지 6MV photon을 2Gy 조사(dose rate: 2.00Gy/min)하였다. 방사선 조사된 말초혈액 1㎖을 PHA 및 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI배지 9㎖에 넣고 5% CO2가 공급되는 배양기에서 48시간 배양하였다.
- 00Gy/min)하였다. 방사선 조사된 말초혈액 1㎖을 PHA 및 10% 우태아 혈청이 포함된 RPMI배지 9㎖에 넣고 5% CO2가 공급되는 배양기에서 48시간 배양하였다.
- 본 실험에서는 Spectrum Orange가 표지된 1, 2, 4 및 21번 각각의 염색체 DNA probe, 1, 2 및 4 번 염색체가 섞인 3중 DNA probe(Vysis)와 Spectrum Green이 표지된 7, 8 및 9번 WCP probe(Vysis)를 이용하여 제조회사의 지침에 따라 FISH를 수행하였다.
- 본 연구는 사람 림프구를 in uitro에서 2Gy의 방사선에 조사한 후 1, 2, 4, 7, 8, 9 및 21번 염색체 각각의 염색체이상 빈도의 관찰치와 Lucas 등 (1992)에 의해제안된 식에 따라 기대치를 구하여 염색체의 방사선 감수성을 비교하였다. 그 결과 1 번 및 4번 염색체의 경우 방사선 피폭 시 상호전좌 및 이동원염색체이상 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 높게 나타났다.
- 본 연구에서는 Tucker 등(1995)에 의해 제안된 명명법인 PAINT(Protocol Aberration Identification and Nomenclature Terminology) system근거하여 염색체 이상을 분류하는데 [14] 특히 교환형 염색체이상인 상호전좌(translocation:t)와 이 동원염색체(dicentric chromosome:dic)를 중점적으로 분석하였다.
- 즉 1, 2, 4, 7, 8, 9 및 21번 염색 체 각각 또는 1, 2, 4번 조합 염색체의 함량을 고려하여 F(G)값을 구해 교환형 염색체 이상의 기대치 Yi를 구한 후 실제 관찰치와 비교한다.
- 즉 1번 염색체 DNA 양8.15%, 2번 7.94%, 4번 6.29%, 7번 5.27%, 8번 4.77%, 9번 4.46% 및 21번 1.54% 모두 합친 값을 1로 보고 관찰된 모든 교환형 염색체 이상을 합한 수에서 각 염색체가 차지하는 DNA 양과 비례하여 염색체 이상의 기대치를 구한 후이를 관찰치와 비교하였다. 계산식은 다음과 같다.
- 즉 준비된 슬라이드를 37℃의 2xSSC(sodium chloride, Sodium citrate)용액에 15분씩 2번 방치한 후 Ethanol series(70, 85, 100%)를 수행하여 탈수과정을 거치도록 하였다. 탈수된 슬라이드는 73±1 ℃ 에서 5분간 70% formamide/2xSSC 용액에서 변성(denaturation) 시킨 후 상온에서 건조하였다.
- 형광현미경 (NIKON, BiophotX 이용하여 triple band filter 인 D/F/TXRD(DAPI/FICT/ Texase Red, Chroma Technology Corp. 61002) 로는 Spectrum Orange, Spectrum Green 및 DAPI 를 동시에 관찰하였으며, UV-2A filter(NIKON, DM400)로는 DAPI를 관찰하였다.
데이터처리
- 또한 실제 관찰된 염색체이상 빈도와 기대치 간 에차이의 유무를 비교하기 위하여 DNA 양을 고려하여 x2 test를 실행하였다.
이론/모형
- Observed and expected frequencies of radiation-induced translocations in each chromosome. Expected values were calculated according to Lucas's formula(1992).
- 염색체 이상 빈도는 painting된 특정 염색체에서만 나타나기 때문에 이 염색체가 전체 유전체 상에서 차지하는 비율을 계산[6, 15]하여 보정하게 되면 전체 유전체에서의 염색체 이상 빈도를 계산할 수 있는데 [13, 16], 염색체 이상 빈도의 기대치는 Lucas(1992)에 의해 제안된 식에 따라 구하였다 [6],
- 염색체 이상 빈도의 기대치는 Lucas (1992)에 의해 제안된 식에 따라 구하였다.
성능/효과
- 1, 2, 4, 7, 8, 9, 및 21번 염색체가 전체 유전체 상에 차지하는 DNA 양은 38.38%로 상호 전좌의 경우 Fg=64.7%, 이동원 염색체의 경우 Fg= 36.37%로 산출되었다. 1번 및 4번 염색체의 경우 상호전좌와 이동원 염색체의 관찰치가 기대치보다 더 높게 나타났으며 이와 반대로 7, 8 및 9번 염색체의 경우 상호전좌와 이동원 염색체의 관찰치 모두 기대치보다 낮게 나타났다.
- 1번 및 4번 염색체의 경우 상호전좌와 이동원 염색체의 관찰치가 기대치보다 더 높게 나타났으며 이와 반대로 7, 8 및 9번 염색체의 경우 상호전좌와 이동원 염색체의 관찰치 모두 기대치보다 낮게 나타났다. 1, 2, 및 4번 염색체 3종을 조합했을 때 전체 유전체상에 차지하는 DNA 양은 22.34%로 상호 전좌의 경우 Fg= 71.7%, 이 동원염색체의 경우 Fg=37.37%로 산출되었다. 상호전좌의 경우 관찰치와 기대치는 세포 100개당 25.
- 1, 2, 및 4번 염색체의 3중 DNA probe를 이용하여 방사선 피폭시 염색체 이상 빈도의 관찰치와기대치를 조사한 결과 상호전좌 및 이 동원 염색체 모두 유의한 차이를 보이지 않고 있다. Gebhart 등(1996)은 염색체 1, 2 및 4번 염색체를 동시에 관찰한 결과 방사선 피폭 시 관찰치와 기대치 간에 차이가 없다고 보고하고 있에22] 본 연구 결과와 일치하는 양상을 보이고 있다.
- 37%로 산출되었다. 1번 및 4번 염색체의 경우 상호전좌와 이동원 염색체의 관찰치가 기대치보다 더 높게 나타났으며 이와 반대로 7, 8 및 9번 염색체의 경우 상호전좌와 이동원 염색체의 관찰치 모두 기대치보다 낮게 나타났다. 1, 2, 및 4번 염색체 3종을 조합했을 때 전체 유전체상에 차지하는 DNA 양은 22.
- 방사선 감수성을 비교하였다. 그 결과 1 번 및 4번 염색체의 경우 방사선 피폭 시 상호전좌 및 이동원염색체이상 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 높게 나타났다. 반면에 2, 7, 8, 9 및 21번 염색체의 경우 상호 전좌 및 이동원염색체 이상 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 낮게 나타나 1번 및 4 번 염색체가 다른 염색체에 비해 방사선 감수성이 상대적으로 높게 나타났다.
- 비교하였다 [7]. 그 결과 관찰치와 기대치 간에 차이가 나타났는데 1, 2, 3, 6, 및 7 번 염색체에서는 상호 전좌 및 이동원염색체 모두관찰치가 DNA 양을 감안하여 환산한 기대치보다 더 낮게 관찰되었으나 4번 염색체의 경우 관찰치가 기대치보다 더 높게 관찰되었다. 그러나 Boei 등(1997)은 1번 및 4번 염색체의 경우 관찰치가기대치보다 더 높게 나타났다고 하는[8] 등 특정염색체마다의 방사선 감수성은 연구자에 따라 각기 다른 결과가 보고되고 있다 [10-11].
- 반면에 2, 7, 8, 9 및 21번 염색체의 경우 상호 전좌 및 이동원염색체 이상 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 낮게 나타나 1번 및 4 번 염색체가 다른 염색체에 비해 방사선 감수성이 상대적으로 높게 나타났다. 또한 1, 2, 4, 7, 8, 9 및 21번 염색체 간에 일어나는 교환형 염색체이상의 확률을 이들 염색체들의 DNA 양이 전체에서 차지하는 비율인 38.38%를 1로 보고 각 염색체의 DNA 양을 비례적으로 환산하여 구한 기대치와 관찰치를 비교한 결과 역시 1번 및 4번 염색체의 경우 상호 전좌 및 이동원 염색체 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 높게 나타났으며 2, 7, 8, 9 및 21 번 염색체의 경우 상호 전좌 및 이동원염색체 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 더 낮게 나타났다. 염색체의 방사선 감수성은 연구자마다 차이를 보이고 있는데 Natarajan 등(1992)은 x선 및 중성자에 의한 상호전좌빈도가 1번 염색체의 경우 기대치보다 관찰치가 더 많이 나타났다고 보고하고 있으몌 1], Boei 등(1997)도 x선에 의한 상호전좌 및이동원염색체 빈도가 1번 및 4번 염색체의 경우 기대치보다 관찰치가 더 많이 관찰되었다고 보고하고 있에 8] 본 연구와 일치하는 양상을 보이고있다.
- 2배 더 많이 관찰되었다. 또한 acentric fragment의 경우 1, 2 및 4번 염색체 각각에서 세포 100개당 1.76, 4.48 및 4.99개를 나타내어 DNA 양을 감안한다고 하더라도 2번 및 4번 염색체의 경우 1번 염색체보다 더 많은 acentric fragment의 빈도를 나타내었다.
- 그 결과 1 번 및 4번 염색체의 경우 방사선 피폭 시 상호전좌 및 이동원염색체이상 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 높게 나타났다. 반면에 2, 7, 8, 9 및 21번 염색체의 경우 상호 전좌 및 이동원염색체 이상 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 낮게 나타나 1번 및 4 번 염색체가 다른 염색체에 비해 방사선 감수성이 상대적으로 높게 나타났다. 또한 1, 2, 4, 7, 8, 9 및 21번 염색체 간에 일어나는 교환형 염색체이상의 확률을 이들 염색체들의 DNA 양이 전체에서 차지하는 비율인 38.
- 2로 역시 거의 차이가 없게 나타났다. 표 4에서 보는 바와 같이 1, 2, 4, 7, 8, 9 및 21번 염색체 간에 일어나는 교환형 염색체이상의 확률을 이들 전체 DNA 양 38.38%를 1로 보고 각 염색체의 DNA 양을 비례적으로 환산하여 구한 기대치와 관찰치를 비교한 결과 역시 표3에서 보이는 결과와 같이 1번 및 4번 염색체의 경우 상호전좌 및 이동원염색체 빈도 모두 관찰치가 기대치보다 높게 나타났으며 2, 7, & 9 및 21번 염색체의 경우 상호 전좌 및 이동원 염색체 빈도 모두 관찰치가기대치보다 더 낮게 나타났다(상호전좌 : z2=65.65, df=6, p<0.001, 이동원염색체:/=25.07, df=6, p<0.001).
후속연구
- 2)에 군집되어 있어 이들 부위에 손상 부위가 많이 모여있다고 알려져 있는 더)[12], 이러한 비활성 DNA로 이루어져 있는 heterochromatin 부위는 활성 DNA 부위보다 DNA 손상회복이 잘 일어나지 않기 때문에 방사선 피폭 시 손상 정도가 염색체이상으로나타난다고 할 수 있다. 4번 염색체의 경우 CpG island가 부족하여 이 부분에 분포하는 염색체 손상 부위를 회복시키는 데 관여하는 전사 유전자가 상대적으로 낮게 분포하기 때문에 방사선 감수성이 높을 것이라고 설명할 수 있으나[20] 아직까지확실하지 않아 이에 대한 연구가 좀 더 수행되어야 할 것이다.
- 있기 때문이다 [12]. 그러므로 각 염색체들이 염색체 교환을 형성할 때 참여도가 DNA 양과 비례하지 않기 때문에 이들 염색체의 조합을 잘 선택해야만 전체 유전체 내의 빈도(genomic frequency) 를 예측할 수 있을 것이다. 즉각 염색체마다의방사선에 대한감수성의 차이를 감안하여 둘 또는 3개이상의 다중염색체 probe를 이용함으로써 전체유전체 상에서의 염색체이상 빈도의 정확성을 향상시키는 것이 방사선에 대한 생물학적 선량계로서의 타당성이 증대될 수 있을 것이다.
- 그러나 Boei 등(1997)은 1번 및 4번 염색체의 경우 관찰치가기대치보다 더 높게 나타났다고 하는[8] 등 특정염색체마다의 방사선 감수성은 연구자에 따라 각기 다른 결과가 보고되고 있다 [10-11]. 따라서 DNA 양에 기초한 Lucas 공식에서 제시한 가정, 즉 절단점은 염색체의 DNA양에 비례해 무작위하게 분포한다는 가정에 대하여 실증적 연구가 수반되어야 할 것이라고 판단된다.
- 따라서 본 연구 결과 방사선에 의한 염색체이상빈도의 관찰치와 기대치 간에 차이가 있어 각 염색체들이 염색체 교환을 형성할 때 참여도가 DNA 양과 비례하지 않을 수도 있기 때문에 이들 염색체의 조합을 잘 선택해야만 방사선 피폭시 발생하게 되는 염색체 이상 빈도의 정확성을 향상시킬 수 있을 것이며, 궁극적으로 FISH기법의 방사선에 대한 생물학적 선량계로서의 타당성을 검증할 수 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구 결과 방사선 피폭시 1번 및 4번 염색체가 다른 염색체에 비해 염색체 이상 빈도의 관찰치가 기대치보다 더 많이 나타났으며, 이 동원 염색체 및 acentric fragment의 빈도가 특정 염색체에서 증가하는 양상을 나타내어 이 부분에 대한 연구가 수반되어야 할 것으로 판단된다.
- 이와 같은 결과를 통해 이동원 염색체 및 acentric fragment는 특정 염색체에 특이적으로 더 많이 생성된 것을 관찰하였지만 이를 확인하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
- 그러므로 각 염색체들이 염색체 교환을 형성할 때 참여도가 DNA 양과 비례하지 않기 때문에 이들 염색체의 조합을 잘 선택해야만 전체 유전체 내의 빈도(genomic frequency) 를 예측할 수 있을 것이다. 즉각 염색체마다의방사선에 대한감수성의 차이를 감안하여 둘 또는 3개이상의 다중염색체 probe를 이용함으로써 전체유전체 상에서의 염색체이상 빈도의 정확성을 향상시키는 것이 방사선에 대한 생물학적 선량계로서의 타당성이 증대될 수 있을 것이다.
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