FISH기법 및 단세포전기영동기법을 이용한 저선량 방사선에 의한 DNA 상해 및 염색체이상 평가 Assessment of DNA damage and Chromosome aberration in human lymphocyte exposed to low dose radiation detected by FISH(fluorescence in situ hybridization) and SCGE(single cell gel electrophoresis)원문보기
단세포전기영동법은 저선량 방사선에 의한 DNA손상을 민감하게 측정할 수 있는 방법으로 그 활용성이 증대되고 있다. 또한 각 염색체에 특이한 DNA probe를 이용하는 FISH기법은 염색체의 구조적 변화를 측정하는 매우 효과적인 방법으로서 그 유용성이 증대되고 있는 추세이다. 본 연구에서는 저선량 방사선의 측정을 위한 생물학적 선량계로서 FISH 기법과 단세포전기영동법의 활용가능성을 조사하고자 하였다. 5, 10, 30, 및 50 cGy의 저선량 방사선 조사에 의한 염색체이상빈도는 상호전좌의 경우 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.0375, 0.0407, 0.0727 및 0.0814로 나타났으며, 이동원염색체의 경우 0.0125, 0.0174, 0.02291, 및 0.0407로 나타나 선량 증가에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 $5{\sim}50cGy$의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 FISH 기법은 저선량 방사선 피폭시 염색체이상을 보다 정확하고 쉽게 관찰할 수 있으며, 단세포전기영동법은 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있어 저선략 방사선 피폭 시 유용한 생물학적 선량계로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
단세포전기영동법은 저선량 방사선에 의한 DNA손상을 민감하게 측정할 수 있는 방법으로 그 활용성이 증대되고 있다. 또한 각 염색체에 특이한 DNA probe를 이용하는 FISH기법은 염색체의 구조적 변화를 측정하는 매우 효과적인 방법으로서 그 유용성이 증대되고 있는 추세이다. 본 연구에서는 저선량 방사선의 측정을 위한 생물학적 선량계로서 FISH 기법과 단세포전기영동법의 활용가능성을 조사하고자 하였다. 5, 10, 30, 및 50 cGy의 저선량 방사선 조사에 의한 염색체이상빈도는 상호전좌의 경우 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.0375, 0.0407, 0.0727 및 0.0814로 나타났으며, 이동원염색체의 경우 0.0125, 0.0174, 0.02291, 및 0.0407로 나타나 선량 증가에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 $5{\sim}50cGy$의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 FISH 기법은 저선량 방사선 피폭시 염색체이상을 보다 정확하고 쉽게 관찰할 수 있으며, 단세포전기영동법은 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있어 저선략 방사선 피폭 시 유용한 생물학적 선량계로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Comparative study was performed for the assessment of DNA damage and Chromosomal aberration in human lymphocyte exposed to low dose radiation using fluorescence in situ hybridization(FISH) and single cell gel electrophoresis(SCGE). Chromosomal aberrations in human lymphocytes exposed to radiation at...
Comparative study was performed for the assessment of DNA damage and Chromosomal aberration in human lymphocyte exposed to low dose radiation using fluorescence in situ hybridization(FISH) and single cell gel electrophoresis(SCGE). Chromosomal aberrations in human lymphocytes exposed to radiation at doses of 5, 10, 30 and 50cGy were analysed with whole chromosome-specific probes by human chromosome 1, 2 and 4 according to PAINT system. FISH with chromosome-specific probe has been used to be a valid and rapid method fer detection of chromosome rearrangements induced by low dose radiation. The frequencies of stable translocation per cell equivalents were 0.0116, 0.0375, 0.040f, 0.0727 and 0.0814 for 0, 5, 10, 30 and 50cGy, respectively, and those of dicentric were 0.00, 0.0125, 0.174, 0.0291 and 0.0407 respectively. Radiation induced DNA damage in human lymphocyte in a dose-dependent manner at low doses from 5cGy to 50cGy, which were analysed by single tell gel electrophoresis(SCGE). From above results, FISH seemed to be useful for radiation biodosimetry by which the frequencies of stable aberrations in human lymphocyte can be observed more easily than by conventional method and SCGE also seemed to be sensitive method f9r detecting DNA damage by low dose radiation exposure, so that those methods will improve our technique to perform meaningful biodosimetry for radiation at low doses.
Comparative study was performed for the assessment of DNA damage and Chromosomal aberration in human lymphocyte exposed to low dose radiation using fluorescence in situ hybridization(FISH) and single cell gel electrophoresis(SCGE). Chromosomal aberrations in human lymphocytes exposed to radiation at doses of 5, 10, 30 and 50cGy were analysed with whole chromosome-specific probes by human chromosome 1, 2 and 4 according to PAINT system. FISH with chromosome-specific probe has been used to be a valid and rapid method fer detection of chromosome rearrangements induced by low dose radiation. The frequencies of stable translocation per cell equivalents were 0.0116, 0.0375, 0.040f, 0.0727 and 0.0814 for 0, 5, 10, 30 and 50cGy, respectively, and those of dicentric were 0.00, 0.0125, 0.174, 0.0291 and 0.0407 respectively. Radiation induced DNA damage in human lymphocyte in a dose-dependent manner at low doses from 5cGy to 50cGy, which were analysed by single tell gel electrophoresis(SCGE). From above results, FISH seemed to be useful for radiation biodosimetry by which the frequencies of stable aberrations in human lymphocyte can be observed more easily than by conventional method and SCGE also seemed to be sensitive method f9r detecting DNA damage by low dose radiation exposure, so that those methods will improve our technique to perform meaningful biodosimetry for radiation at low doses.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구는 FISH 기법과 단세포전기영동법을 저선량 방사선 측정을 위한 생물학적 선량계로서의 활용가능성을 조사하기 위해 시행되었다. 단세포 전기영동법은 저선량 방사선에 의한 DNA손상을 민감하게 측정할 수 있는 방법으로 그 활용성이 증대되고 있으며, 각 염색체에 특이한 DNA probe를 이용하는 FISH 기법은 염색체의 구조적 변화를 측정하는 매우 효과적인 방법으로서 그 유용성이 증대되고 있는 추세이다.
본 연구에서는 FISH 기법과 단세포전기영동법을 저선량 방사선의 측정을 위한 생물학적 선량계로서의 활용가능성을 조사하고자 한다.
, 1988)[6, 8], 전체의 comet 길이, head 직경과 tail 길이에 대한 비, tail moment, 그리고 Comet moment를 들 수 있는데 최근에는 현미경에서 관찰한 영상을 PC에 저장하여 특별히 제작된 program을 이용하여 분석하는 방법이 시도되고 있다. 본 연구에서는 head로부터 tail까지의 길이로서 DNA의 이동 정도를 파악하였다. 최근의 연구에서 상기 기술한 측정 방법 어느 것이나 이용될 수 있다고 보고되고 있으며, 오히려 일부 연구자들이 이용하는 comet moment를 측정 시에는 다른 측정법에 의한 자료도 병기하도록 권고하고 있다[12].
제안 방법
1, 2, 4 염색체가 동시에 Spectrum Orange로 표지된 DNA probe(WCP 1, 2, 4, Vysis)를 73±1 ℃에서 5분간 변성시킨 후, hybridization시키기 전까지 45-50℃의 slide warmer에 놓아두었다.
건강한 사람의 말초혈액을 선형 가속기(LINAC, Varian 6/100)로 에너지 6MV x선을 5 cGy, 10 cGy, 30 cGy, 50 cGy 조사(dose rate: 2.00 Gy/min)하였다.
방사선 조사된 말초혈액 1m를 PHA 및 1% 우태아 혈청이 포함된 RPMI배지 9ml에 넣고 5% CO2가 공급되는 배양기에서 48시간 배양한 후 염색체 표본을 작성하였다.
방사선이 조사된 림프구는 4℃에서 보관하면서 방사선 조사 즉시 ficoli을 이용하여 림프구를 분리 하였다.
본 실험에서는 Spectrum Orange가 표지된 1, 2, 4번 염색체의 WCP probe(Vysis)를 이용하여 직 접법에 의해 FISH를 수행하였다.
본 연구에서는 Singh 등(1994)의 개량한 방법에 의해 단세포전기영동법을 수행하였는데, 즉 전기영동 시 이용한 buffer에 8-hydroxyguanosine과 dinmethylsulphxide를 첨가하여 free radical에 의한 DNA 상해를 방지하여 기저 상해수준을 낮추고자 하였으며, 전기영동 후 중화과정을 거치고 ethanol을 1시간 처리함으로서 각 세포의 DNA를 슬라이드에 침착시킴으로서 형광현미경으로 관찰 시 편리하게 하였다[15].
본 연구에서는 Tucker 등(1995a)에 의해 제안된 명명법인 PAINT(Protocol Aberration Identification and Nomenclature Terminology) system에 근거하여 염색체 이상을 분류하였으며[13], 염색체 이상 빈도는 painting된 특정 염색체에서만 나타나기 때문에 이 염색체가 전체 genome 상에서 차지하는 비율을 계산하여[1, 14], 보정하여 전체 genome에서의 염색체 이상 빈도를 계산하였다[3-4]. 본 연구에서 사용한 염색체 1, 2, 4번의 경우 전체 genome 상에서 차지하는 DNA의 비율이 22.
형광현미경(NIKON, E600)을 이용하여 triple band filter인 D/F/TXRD(DAPI/FICT/Texase Red, Chroma Technology Corp. 61002)로는 Spectrum Orange 및 DAPI를 동시에 관찰하였으며, UV-2A filter(NIKON, DM400)로는 DAPI를 관찰하였다.
)로 염색하였다. 형광현미경을 사용하여 이미지분석프로그램(Image Pro Plus 3.0)을 통해 60개의 세포를 선택하여 DNA 손상정도를 head를 포함한 tail의 길이로 분석하였다[8].
데이터처리
0 통계패키지를 이용하여. 상호전좌 및 이동원염색체 빈도의 선량-반응 곡선을 추정하였으며, DNA 손상정도를 살펴보기 위해 KruskaU-Wallis analysis를 실행하였다.
이론/모형
단세포전기영동법은 Singh 등(1994, 1995)의 방법에 준하여 시행하였다[15-16].
림프구에 5, 10, 30, 및 50 cGy의 저선량의 방사선을 조사한 경우 염색체 이상빈도는 표1, 그림 1 및 그림 2와 같다. 본 실험에서는 1, 2, 4번 염색체의 probe를 동시에 이용한 FISH기법을 활용하였다. 5 cGy에서 50 cGy의 저선량 방사선에 의한 이동원염색체 및 상호전좌 등의 염색체이상빈도는 선량에 따라 직선적으로 증가하였다.
성능/효과
5 cGy - 50 cGy의 저선량 조사 후 단세포전기영동을 통해 DNA 상해정도를 살펴본 결과 선량이 증가함에 따라 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다(Y=39.764+72.9X, r2=0.1620, X: 선량(Gy), Y: tail length(μm))(표 2, 그림 3과 4).
본 실험에서는 1, 2, 4번 염색체의 probe를 동시에 이용한 FISH기법을 활용하였다. 5 cGy에서 50 cGy의 저선량 방사선에 의한 이동원염색체 및 상호전좌 등의 염색체이상빈도는 선량에 따라 직선적으로 증가하였다. 즉 관찰된 상호전좌의 빈도는 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.
5, 10, 30, 및 50cGy의 저선량 방사선 조사에 의한 염색체이상빈도는 상호전좌의 경우 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome 상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.0375, 0.0407, 0.0727 및 0.0814로 나타났으며, 이동원염색체의 경우 0.0125, 0.0174, 0.02291, 및 0.0407로 나타나 선량 증가에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 5 ~ 50cGy의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해 정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다.
0407로 나타나 선량 증가에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 5 ~ 50cGy의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해 정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 FISH 기법은 저선량 방사선 피폭 시 염색체 이상을 보다 정확하고 쉽게 관찰할 수 있으며, 단세포전기영동법은 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있어 저선량 방사선 피폭 시 유용한 생물학적 선량계로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
933, X: 선량(Gy), Y: cell equivalait당 이동원염색체의 빈도)을 보여주었다. 또한 color junction의 빈도도 선량에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 상호전좌 빈도와 이동원염색체 빈도의 비(t/dic)는 5cGy에서 3, 10cGy에서 2.
본 연구결과 50 cGy 이하의 저선량의 방사선조사에 의해 상호전좌 및 이동원염색체가 선량에 따라 직선적으로 증가되는 것을 확인하였다. 또한 상호전좌:이동원염색체의 비는 5cGy의 저선량에서는 1:3 이었으나 선량이 증가될수록 그 비가 1:2에 근접되는데 본 실험에서 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌된 염색체를 지닌 세포를 쌍으로 하여 하나로 측정한다면 상호전좌와 이동원염색체는 거의 같은 빈도로 나타난다는 것을 알 수 있었다.
본 연구결과 50 cGy 이하의 저선량의 방사선조사에 의해 상호전좌 및 이동원염색체가 선량에 따라 직선적으로 증가되는 것을 확인하였다. 또한 상호전좌:이동원염색체의 비는 5cGy의 저선량에서는 1:3 이었으나 선량이 증가될수록 그 비가 1:2에 근접되는데 본 실험에서 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌된 염색체를 지닌 세포를 쌍으로 하여 하나로 측정한다면 상호전좌와 이동원염색체는 거의 같은 빈도로 나타난다는 것을 알 수 있었다.
본 연구결과 알카리 조건하에서 단세포전기영동법에 의해 저선량 방사선에 의해 DNA 상해가 선량에 따라 증가되는 결과를 얻었다.
본 연구에서는 Tucker 등(1995a)에 의해 제안된 명명법인 PAINT(Protocol Aberration Identification and Nomenclature Terminology) system에 근거하여 염색체 이상을 분류하였으며[13], 염색체 이상 빈도는 painting된 특정 염색체에서만 나타나기 때문에 이 염색체가 전체 genome 상에서 차지하는 비율을 계산하여[1, 14], 보정하여 전체 genome에서의 염색체 이상 빈도를 계산하였다[3-4]. 본 연구에서 사용한 염색체 1, 2, 4번의 경우 전체 genome 상에서 차지하는 DNA의 비율이 22.4%, 전체교환형중 34.4%가 관찰되는 것으로 나타났다.
또한 color junction의 빈도도 선량에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다. 상호전좌 빈도와 이동원염색체 빈도의 비(t/dic)는 5cGy에서 3, 10cGy에서 2.33, 30cGy에서 2.50, 그리고 50cGy에서는 2.00로서 상호전좌의 빈도가 이동원 염색체의 빈도보다 상대적으로 높게 나타났다. 즉 본 연구에서는 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌가 나타난 각각의 염색체 이상을 측정한 것을 고려하더라도 상호전좌의 빈도가 이동원염색체의 빈도보다 높게 나타난 것을 알 수 있었다.
즉 각 선량별로 60개의 세포를 대상으로 tail의 길이를 측정한 결과 선량이 증가할수록 tail 길이 가 증가되어 DNA 상해를 보여주는 세포가 더 많이 존재함을 알 수 있다(표 2, 그림 3).
5 cGy에서 50 cGy의 저선량 방사선에 의한 이동원염색체 및 상호전좌 등의 염색체이상빈도는 선량에 따라 직선적으로 증가하였다. 즉 관찰된 상호전좌의 빈도는 1, 2, 4번 염색체가 전체 genome상에서 차지하는 비율을 감안하여, 전체 세포수로 환산했을 때 cell equivalent당 0.0375, 0.0407, 0.0727 및 0.0814로 나타나 직선적 관계(Y=0.0244+0.0013X, r2=0.885, X: 선량(Gy), Y: cell equivalent당 상호전좌의 빈도)를 보여주고 0.02291 및 0.0407로 나타나 같은 양상(Y=0.00613+ 0.000723X, r2=0.933, X: 선량(Gy), Y: cell equivalait당 이동원염색체의 빈도)을 보여주었다. 또한 color junction의 빈도도 선량에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다.
00로서 상호전좌의 빈도가 이동원 염색체의 빈도보다 상대적으로 높게 나타났다. 즉 본 연구에서는 PAINT 분류체계를 따랐기 때문에 상호전좌가 나타난 각각의 염색체 이상을 측정한 것을 고려하더라도 상호전좌의 빈도가 이동원염색체의 빈도보다 높게 나타난 것을 알 수 있었다. 또한 상호전좌와 이동원염색체중 t(Ab)와 t(Ba), dic(BA)와 dic(BB)가 주로 관찰되었으며, 삽입(ins), 무동원염색체(ace) 및 환상염색체(r)도 관찰되었다.
후속연구
또한 기저수준의 DNA 손상을 감소시키는 방법을 사용하였기 때문에 민감하게 측정할 수 있었다고 보고하고 있지만, 후속연구가 없어서, 그 타당성 여부를 단정적으로 판단하기에는 논란이 있다. 그러나 1cGy 이하 저선량의 영향을 측정하기 위한 생물학적 선량계가 현재까지는 개발되지 않았기 때문에 이 측정법에 대한 더 많은 연구가 필요하다.
또한 5 ~ 50cGy의 저선량 방사선 조사 후 단세포전기영동법을 통해 DNA 상해 정도를 살펴본 결과 선량이 증가할수록 DNA 상해가 증가하는 결과를 얻었다. 따라서 FISH 기법은 저선량 방사선 피폭 시 염색체 이상을 보다 정확하고 쉽게 관찰할 수 있으며, 단세포전기영동법은 DNA 손상을 민감하게 감지할 수 있어 저선량 방사선 피폭 시 유용한 생물학적 선량계로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
따라서 저선량 방사선에 생물학적 선량계로서 FISH기법 및 단세포전기영동법에 민감도 및 타당성 평가에 대한 연구가 더욱 필요하다고 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.