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문제 정의
- Decursin(1)과 decursinol angelate(2)의 NF-kB저해활성 -분리된 물질들의 작용 기작을 알아보기 위해 iNOS 단백질의 발현에 중요한 전사인자 NF-kB의 활성화에 미치는 영향을 보았다. NF-fcB receptor construct를 이용한 assay시스템에서 여러 농도의 decursin(1)과 decursinol angelate(2)를 처리하고 reporter gene 인 SEAP(secreted alkakine phosphatase)의 활성에 미치는 두 화합물의 효과를 측정하였다.
- NO생성 및 iNOS 저해제들은 과도하게 생성된 NO 로 나타나는 여러 증상들을 저해하는 염증 및 sepsis 를 치료할 수 있는 약물로서 개발될 수 있는 가능성을 제시하고 있는 것이다. 따라서 iNOS에 대해서 더 선택적이며 활성이 강한 저해제들을 개발하는데 중점을 두어야 할 것으로 생각한다.
- 그 대표적인 것으로는 Evodia rutaecarpa로부터 evodiamine과 dehy-droevodiamine8)이, Artemisia princeps로부터 yomo-gin9)이, Ginkgo biloba로부터 EGb 76110)이, Cur-cuma longa로부터 curcumin11), Peucedanum japoni-cum의 뿌리로부터 쿠마린계 물질 등12)이 보고되어 있다. 본 연구실에서는 Polygonum cuspidatim의 뿌리 (호장근)로부터 LPS로 활성화된 RAW 264.7 세포주에서의 NO 생성 저해활성을 나타내는 2종의 쿠마린계 물질을 분리하여 이들의 구조와 NO 생성 저해 활성에 대해 보고하고자 한다.
- 4). 이 실험은 활성물질들이 iNOS mRNA가 발현되는 transcription단계를 지나서 transla-tion단계에 이르는 과정동안 활성물질들이 어느 단계를 저해해서 NO생성을 억제하는지 알아보기 위해서 실시하였다. LPS를 처리하는 시간을 0시간으로 정하고 전처리를(-)로 나타냈으며, 후처리는 LPS를 처리한 후 3시간, 6시간 그리고 18시간에 각각 시료를 처리하고 병용처리(0시간)를 기준으로 20시간이 되었을 때 활성을 측정하였다.
- 호장근 (Polygonum cuspidatum)으로부터 NO 생성 저해제로 2종의 쿠마린계 물질, decursin(l)과 decur-sinol angelate(2)를 분리하고 NO 생성 저해작용 기전을 밝히고자 하였다.
제안 방법
- 7 세포를 20시간 동안 완전히 활성화시킨 후, 새 배지로 교환하고 분리된 물질들을 처리하였다. 20시간 후에 배양액 중에 생성된 nitrite량을 Griess 반응으로 측정하여, 세포내에 존재하는 iNOS에 대한 NO 생성저해를 조사하였다(Fig. 5). 양성대조구로 L-NMMAaC50=1.
- Tris buffered saline으로 10분씩 3회, 20 분씩 2회 세척 후 secondary antibody(Goc-Rb Ig G-HRP, 1:2,000, Pierce)로 30분 동안 반응시켰다. Immunoreactive band는 ECL(Amersharm, Buckinghamshire, UK)westem blotting system으로 확인하였다.
- 7 cells incubated with LPS (1 ㎍/ml for 20 h). In separate experiment, decursin (25 ㎍/mZ) and decursinol angelate (25 ㎍/m/) were given either together with LPS (time 0 h) or at 3, 6 or 18 h after LPS. After 20 h LPS-activation, nitrite assay was performed, a Samples were co-treated with LPS.
- LPS로 활성화된 RAW 264.7에서의 iNOS 발현에 대한 물질 1의 효과 - 분리된 물질 중 decursin (1)과 LPS(1 ㎍/ml)을 병용 처리하여 20시간 후에 생성된 iNOS를 western blotting으로 확인하였다. Fig.
- 이 실험은 활성물질들이 iNOS mRNA가 발현되는 transcription단계를 지나서 transla-tion단계에 이르는 과정동안 활성물질들이 어느 단계를 저해해서 NO생성을 억제하는지 알아보기 위해서 실시하였다. LPS를 처리하는 시간을 0시간으로 정하고 전처리를(-)로 나타냈으며, 후처리는 LPS를 처리한 후 3시간, 6시간 그리고 18시간에 각각 시료를 처리하고 병용처리(0시간)를 기준으로 20시간이 되었을 때 활성을 측정하였다. 물질(1과 2)과 LPS를 병용처리시 (0시간), 92%(1)와 93%(2)로 강한 저해활성을 보였고, 또한 전처리(-2시간)의 경우에도 역시 강한 저해 활성(1: 85% 저해, 2: 77% 저해)을 나타내었다.
- LPS에 의해 유도되는 NF~kB 활성 측정15)-Murine macrophage 에 NF-KB receptor construct을 transfection 시킨 세포(이하 RAW-NFJB 세포)를 500㎍/mZ의 G418이 함유된 DMEM에 배양한 후 세포를 수확하여 96-well plate에 세포 수를 5×104 cells/m/이 되도록 DMEM(with penicillin-streptomy- cin-glutamine, 0.5% FBS and 500㎍/ml G418)로 조정하여 100 ㎍/well을 분주하였다. 3시간 동안 세포를 부착시킨 후, 각 well당 LPS(1 ㎍/mZ)와 분리된 물질이 함유된 DMEM을 100μl씨 첨가하고, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 37℃에서 배양하고, 새로운 배지 200 μl로 교환 한 다음 48시간동안 배양하였다.
- . LPS와 활성물질들을 RAW 264.7 세포에 처리하여 20시간 동안 배양한 다음, PMS/MTS 혼합용액 50 (25 μl of PMS for every 975 μl MTS)를 첨 가하여 30분 동안 37℃에서 배양 후 490nm(using a reference wavelength of 655 nm)에서 흡광도로서 세포의 독성을 측정하였다.
- 미치는 영향을 보았다. NF-fcB receptor construct를 이용한 assay시스템에서 여러 농도의 decursin(1)과 decursinol angelate(2)를 처리하고 reporter gene 인 SEAP(secreted alkakine phosphatase)의 활성에 미치는 두 화합물의 효과를 측정하였다. Fig.
- Shimadzu)을 사용하여 분리물질의 순도를 확인하였다. NMRe Varian unity 300 spectrometer, EI-MS 는 Hewlett-Packard MS Engine 5989A mass spec-trometer를 이용하여 분리된 물질의 구조을 확인하였다.
- Nitrite assay-macrophage로부터 생성된 Nitric oxide(NO)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였다14). 즉 세포배양 상등액 100μl와 Griess 시약 [0.
- LPS로 활성화 된 iNOS는 수 시간에서 수일까지 활성을 유지한다. 그러므로 LPS(1 ㎍/ml)로 RAW 264.7 세포를 20시간 동안 완전히 활성화시킨 후, 새 배지로 교환하고 분리된 물질들을 처리하였다. 20시간 후에 배양액 중에 생성된 nitrite량을 Griess 반응으로 측정하여, 세포내에 존재하는 iNOS에 대한 NO 생성저해를 조사하였다(Fig.
- 7 세포의 배양액 중에 존재하는 nitrite(NO2)의 양을 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 물질 1과 2를 처리하여 20시간 후 LPS에 의해 유도된 NO의 생성량을 조사하였으며, iNOS 저해제로 알려진 NG-Monomethyl-L-arginine, Monoacetate (L-NMMAX 양성 대조구로 사용하였다. 물질 1과 2를 LPS와 동시에 처리했을 때 농도 의존적인 저해활성이 관찰되었으며 물질 1과 2의 IC50 값은 0.
- 물질 1과 2의 LPS에 의해 유도된 NO 생성 저해 활성 -iNOS에 의한 Ng 생성은 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 존재하는 nitrite(NO2)의 양을 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 물질 1과 2를 처리하여 20시간 후 LPS에 의해 유도된 NO의 생성량을 조사하였으며, iNOS 저해제로 알려진 NG-Monomethyl-L-arginine, Monoacetate (L-NMMAX 양성 대조구로 사용하였다.
- 물질 1과 2의 iNOS 유도 후 단계에 대한 저해촬성 -NO 생성 저해 기작을 알아보기 위해 먼저 효소에 대한 분리된 물질의 영향을 알아보았다. LPS로 활성화 된 iNOS는 수 시간에서 수일까지 활성을 유지한다.
- 물질 1과 2의 시간에 따른 NO생성 저해활성 -LPS(l㎍/ml)로 활성화된 RAW 264.7 세포에 물질 1 과 2를 시간에 따라 처리하여 NO생성 저해 활성을 측정하였다(Fig. 4). 이 실험은 활성물질들이 iNOS mRNA가 발현되는 transcription단계를 지나서 transla-tion단계에 이르는 과정동안 활성물질들이 어느 단계를 저해해서 NO생성을 억제하는지 알아보기 위해서 실시하였다.
- 배양 상등액 100μl을 새로운 96 well plate에 옮겨서 65℃에서 5분간 가열을 한 후, 2배 농도의 SEAP(secreted alkaline phosphatase) buffer(2 mM diethanolamine, 1 mM MgCl2, 20 mM L-homoatrininc) 을 100μl씩 추가하여 37℃에서 10분간 배양하고, 기질인 120 mM PNPP(p-nitrophenylphosphate)을 20μl씩 추가하여 37℃에서 3시간 반응하였다. 반응액을 microplate reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하여 NF-ZrB활성을 관찰하였다43).
- 7 세포로부터 생성되는 NO 생성을 저해하는 물질을 탐색하던 중, 호장근의 MeOH 추출물이 125 ㎍의 농도에서 92%의 저해활성을 나타내었다. 용매 분획 결과 CHCl3 분획으로 활성이 이행되었으며 이 분획으로부터 실리카겔, RP-18 컬럼크로마토그래피, semiprep HPLC와 recyclic HPLC를 이용하여 2종의 쿠마린 유도체를 순수 분리하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- 사용하였다. 박증크로마토그래피는 pre-coated TLC plate silica gel 60F254(Merck, Art. 5554)와 RP-18F254s(Merck)를이용하여 실시하였고, 컬럼크로마토그래피 용 담체로는Kieselgel 60(70-230 mesh, Merck), YMC-gel(ODS- A, 60-230 mesh), Sephadex LH-20(Phamacia)을 사용하였다. 물질의 순수 분리를 위해 분취 HPLC(column; J'sphere ODS-H80, 150×20 mm, 4㎛, 80 A, SPD-10A UV detector, LC-6AD pump, Shi- madzu)와 recycling HPLC(LC-908, UV detector 310, Japan Analytical Industry)을 사용하여 분리를 하였고, 분석용 HPLC(column; J'sphere ODS-H80, 250×4.
- 실험재료, 기기 및 시약 - 본 실험에 사용한 호장근(Polygorumi cuspidatum의 뿌리, Polygonaceae)는 1998년에 대전시 소재 일신약품에서 구입하였으며 충남대학교 약초원으로 부터 제공받은 호장근과 TLC, HPLC chromatogram을 비교 · 동정하여 사용하였다. 박증크로마토그래피는 pre-coated TLC plate silica gel 60F254(Merck, Art.
- 5). 양성대조구로 L-NMMAaC50=1.0㎍/ml)19), aminoguanidine(AG, IC50=30.7 ㎍/ml)20), curcumin(IC50=2.2 ㎍/ml)21)을 사용하였다. L-NMMA 는 L-arginine과의 기질경쟁에 의해 iNOS에 대해 저해 활성을 나타내며, AG는 iNOS에 대하여 특이적인 저해 활성을 나타낸다.
이론/모형
- Cell viability test -분리된 활성물질들의 세포독성은 PMS/MTS(phenazine methosulphate/3-(4,5-dime- thylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 방법에 의해 측정되었다13). LPS와 활성물질들을 RAW 264.
- 6, 1% Noindet P-40, 150 mM NaCl, 2 mM EGIA, 1 mM Na3VO2, 10 μl/ml leupeptin and aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 용해시켰다. 이 세포 용해액을 원심분리(15,000rpm, 4℃)하여 상등액을 얻어 Bradford 방법을 사용하여 단백질을 정량한 후 8% SDS-PAGE(50㎍/lane of pro- tein)를 시행하고, 전개된 단백질을 nitrocellulose mem- brane으로 이동시켰다. 이 membrane을 5% skim milk로 1시간 동안 blocking하고 Tris buffered saline (10 mM Tris-HCl, pH 7.
성능/효과
- 따라서 LPS에 의한 iNOS 유도단계에 영향을 미치는 저해제들은 전처리나 병용처리가 후처리보다 더 강한 저해활성을 나타낸다. Fig. 4의 실험결과에서 보여주듯이 분리된 활성물질들은 iNOS 유도단계를 억제하는 저해제들과 동일한 저해활성 경향을 나타내는 것으로 볼 때, 분리된 활성물질들은 LPS에의해 세포가 활성화될 때 iNOS 유도단계를 억제한다는 것으로 추정할 수 있었다.
- 6에서 보듯이 decursin(l)은 25 ㎍/ml에서 iNOS 발현을 억제하고 있음을 보여주었다. 그 결과, decursin의 NO 생성 저해활성은 iNOS 유도를 억제하여 나타남을 확인할 수 있었다.
- 그러나 두 물질은 50ng/mZ의 농도에서 약간의 세포독성을 보였다. 그결과 화합물 1, 2는 iNOS 전사 단계의 NF-kB를 저해함으로써 NO 생성저해활성이 나타남을 확인할 수 있었다.
- 5에서 보여주듯이 활성물질들 모두가 iNOS의유도가 완료된 후에는 NO생성 저해효과를 나타내지 않았다. 그러나 동일하게 처리한 양성대조구들, L-NMMA, AG, curcumine iNOS의 유도가 완료된 후에도 저해활성을 나타내었는데, AGe 307 ㎍/ml에서 62%, L-NMMA는 10㎍/ml에서 36%, curcumine 22㎍/m/에서 20%의 활성을 나타내었다. 그리고 이 실험에서는 뚜렷한 저해활성을 보기 위해서 IG50의 농도보다 높게 대조구들을 처리하였으며, 실제로 AG의 경우를 제외하고는 모두 50% 이하의 저해활성을 보였다.
- 80% MeOH)를 행하여 활성부분을 분리하였다. 그러나 활성부분을 분석용 HPLC(column;J'sphere ODS-H80, 4 ㎛, 80 A, 250×4.6mm, flow rate; 1 ml/min, 용매; 70% MeOH, SPD-M10A Diode array detector)로 확인한 결과 2종의 물질이 혼합되어 있었다. 따라서 recyclic HPLC(column; J'sphere ODS-H80, 4㎛ 80 A, 150×20mm, flow rate; 5 ml/min, 용매; 80% MeOH, 254run)를 실시하여 2종의 물질 decursin (1), decursinol angelate (2)를 각각 2.
- 그러나 동일하게 처리한 양성대조구들, L-NMMA, AG, curcumine iNOS의 유도가 완료된 후에도 저해활성을 나타내었는데, AGe 307 ㎍/ml에서 62%, L-NMMA는 10㎍/ml에서 36%, curcumine 22㎍/m/에서 20%의 활성을 나타내었다. 그리고 이 실험에서는 뚜렷한 저해활성을 보기 위해서 IG50의 농도보다 높게 대조구들을 처리하였으며, 실제로 AG의 경우를 제외하고는 모두 50% 이하의 저해활성을 보였다. 따라서 호장근으로부터 분리된 물질들은 iNOS 유도 후 단계에서 세포내에서 완전히 활성화된 iNOS 에 의한 NO생성을 저해하지 않고 iNOS 유도 억제에 기인된다는 것을 짐작할 수 있었다.
- 6mm, flow rate; 1 ml/min, 용매; 70% MeOH, SPD-M10A Diode array detector)로 확인한 결과 2종의 물질이 혼합되어 있었다. 따라서 recyclic HPLC(column; J'sphere ODS-H80, 4㎛ 80 A, 150×20mm, flow rate; 5 ml/min, 용매; 80% MeOH, 254run)를 실시하여 2종의 물질 decursin (1), decursinol angelate (2)를 각각 2.8 mg, 2mg으로 순수 분리 할 수 있었다.
- 그리고 이 실험에서는 뚜렷한 저해활성을 보기 위해서 IG50의 농도보다 높게 대조구들을 처리하였으며, 실제로 AG의 경우를 제외하고는 모두 50% 이하의 저해활성을 보였다. 따라서 호장근으로부터 분리된 물질들은 iNOS 유도 후 단계에서 세포내에서 완전히 활성화된 iNOS 에 의한 NO생성을 저해하지 않고 iNOS 유도 억제에 기인된다는 것을 짐작할 수 있었다. 이 결과는 시간에 따른 NO생성 저해활성 실험결과와 일치하였다.
- 수 있었다. 또한 iNOS를 완전히 유도시킨 후 NO 생성 저해활성을 측정해 본 결과, NO 생성 저해활성이 없는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들로부터 이물질들은 iNOS mRNA 전사단계에서 iNOS 유도를 억제하여 NO생성을 저해할 것이며, 특히 iNOS mRNA의 전사를 개시시키는 NF-kB의 활성을 억제하여 NO생성을 저해할 것으로 추측된다.
- 볼 수 있었다. 또한 iNOS를 완전히 유도시킨 후 NO생성 저해활성을 측정해 본 결과, 저해활성이 없는것을 확인할 수 있었다. 또한, iNOS 전사 단계의 NF-kB를 저해함으로써 NO 생성저해활성이 나타남을 확인할 수 있었다.
- 또한 iNOS를 완전히 유도시킨 후 NO생성 저해활성을 측정해 본 결과, 저해활성이 없는것을 확인할 수 있었다. 또한, iNOS 전사 단계의 NF-kB를 저해함으로써 NO 생성저해활성이 나타남을 확인할 수 있었다.
- 2). 또한이들은 대조구에 비해 세포의 생존율에 큰 차이를 보이지 않았으며 물질 2의 경우 25㎍/ml의 농도에서세포의 생존율이 증가함을 볼 수 있었다(Fig. 3). 이물질들은 세포의 생존에는 영향을 미치지 않고 NO 생성을 저해하였다.
- LPS를 처리하는 시간을 0시간으로 정하고 전처리를(-)로 나타냈으며, 후처리는 LPS를 처리한 후 3시간, 6시간 그리고 18시간에 각각 시료를 처리하고 병용처리(0시간)를 기준으로 20시간이 되었을 때 활성을 측정하였다. 물질(1과 2)과 LPS를 병용처리시 (0시간), 92%(1)와 93%(2)로 강한 저해활성을 보였고, 또한 전처리(-2시간)의 경우에도 역시 강한 저해 활성(1: 85% 저해, 2: 77% 저해)을 나타내었다. 그러나 LPS로 세포를 활성화시킨 후 물질 1과 2를 처리하였을 때 저해활성이 급격히 감소되어 6시간 후처리 시 32%(1)와 23%(2), 18시간 후 처리 시 9%(1)와 14%(2)의 저해활성을 나타냈다.
- 본 실험에서 시간에 따른 NO생성 저해활성을 측정해 본 결과, LPS와 병용처리 시에 활성이 높았고, LPS를 처리한 후 시간이 경과되어 물질을 처리하면그 저해활성이 시간이 경과될수록 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다. 또한 iNOS를 완전히 유도시킨 후 NO생성 저해활성을 측정해 본 결과, 저해활성이 없는것을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서는 decursin(l)과 decursinl angelate(2)에 대한 시간에 따른 NO생성 저해활성을 측정해 본 결과, LPS와 병용처리 시에 활성이 높았으며, LPS를처리한 후 시간이 경과되어 분리된 물질을 처리하면그 활성이 시간이 경과될수록 현저히 감소하는 것을볼 수 있었다. 또한 iNOS를 완전히 유도시킨 후 NO 생성 저해활성을 측정해 본 결과, NO 생성 저해활성이 없는 것을 확인할 수 있었다.
- 생약자원으로부터 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 생성되는 NO 생성을 저해하는 물질을 탐색하던 중, 호장근의 MeOH 추출물이 125 ㎍의 농도에서 92%의 저해활성을 나타내었다. 용매 분획 결과 CHCl3 분획으로 활성이 이행되었으며 이 분획으로부터 실리카겔, RP-18 컬럼크로마토그래피, semiprep HPLC와 recyclic HPLC를 이용하여 2종의 쿠마린 유도체를 순수 분리하였다(Fig.
- 또한 iNOS를 완전히 유도시킨 후 NO 생성 저해활성을 측정해 본 결과, NO 생성 저해활성이 없는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들로부터 이물질들은 iNOS mRNA 전사단계에서 iNOS 유도를 억제하여 NO생성을 저해할 것이며, 특히 iNOS mRNA의 전사를 개시시키는 NF-kB의 활성을 억제하여 NO생성을 저해할 것으로 추측된다.
- 혈관벽에서 iNOS의 발현은 혈관확장을 일으키며, 혈관수축 인자에 대한 반응성을 현저히 감소시킨다. 이들 효과는 cGMP에 의해 조절되며 L-NMMA나 iNOS 저해제들에 의해 감소되었고, 과민성 쇼크(anaphylactic shock)를 보이는 마우스에서 iNOS 발현을 저해한 결과 치사율이 감소되었다.25)
- 이상의 결과들로부터 분리한 2종의 coumarin계 물질인 decursin과 decursinol angelate의 NO 생성저해는 iNOS의 직접적인 저해작용이 아니라 iNOS mRNA 전사단계에서 iNOS 유도를 억제하여 NO 생성을 저해하고 있으며, 특히 iNOS mRNA의 전사를 개시시키는 NF-kB의 활성을 억제하여 NO생성을 저해할 것으로 생각된다.
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