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문제 정의
- , GR) 및 당귀 (roots of Angelica acutiloba Kitagawa, AR)의 10종의 천연물로 부터 구성되고 있다(Table 1). 따라서 Hong 등a, 이 보고한 십전대보탕의 장관면역 활성이 주로 어느 천연물로 부터 유래하고 있는가를 검토하기 위하여 10종의 구성 천연물의 열수추출물을 조제하고 그 추출물의 활성을 비교하였다. Table 1에 나타난 바와 같이 낮은 수율을 보인 PR(8.
- 활성을 검토하였다. 또한 Hong 등은(15) 최근 십전대보탕의 열수추출물이 Peyer's patch의 T세포를 활성화하며 T세포로부터 유래되는 hematopoietic growth factor의 분비를 촉진시킨다고 보고하였는데, 이러한 장관면역 활성을 갖은 십전대보탕의 어떤 천연물이 장관면역 활성에 중요하게 관여하는지를 구성생약들의 열수추출물을 이용하여 측정하고, 최대 활성 천연물의 열수추출물을 분획함으로써, 향후 이를 기능성 식품소재로 사용하기 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
- 본 실험은 전통 한약재가 구강을 통해 복용되기 때문에 장관면역을 자극할 수 있다는 충분한 가능성 하에, 일반적으로수술 후 회 복 중이거 나 만성 질환으로 부터 고통을 호소하는환자들의 신체조절을 위하여 복용되며 항암제 치료 중 야기되는 골수세포의 증식억제를 완화시키는 것으로 알려진 전통 한약처방인 십전대보탕의 구성 천연물을 대상으로 장관면역 활성을 검토하였다. 또한 Hong 등은(15) 최근 십전대보탕의 열수추출물이 Peyer's patch의 T세포를 활성화하며 T세포로부터 유래되는 hematopoietic growth factor의 분비를 촉진시킨다고 보고하였는데, 이러한 장관면역 활성을 갖은 십전대보탕의 어떤 천연물이 장관면역 활성에 중요하게 관여하는지를 구성생약들의 열수추출물을 이용하여 측정하고, 최대 활성 천연물의 열수추출물을 분획함으로써, 향후 이를 기능성 식품소재로 사용하기 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- Atractylodes lancea DC. rhizome(창줄, ALR, Lot No. 250496) 500g을 증류수 10 L로 3회에 걸쳐 열수추출하고 원심분리하여 상등액을 회수한 후 투석 및 동결건조을 거쳐 A. lancea의 열수추출물(ALR-0, 수율; 40.5%)로 조제하였다. ALR-0은 다시 5 L의 메탄올로 1시간씩 5회에 걸쳐 환류를 거친 후 원심분리하여 메탄올-가용성 획분(ALR-1, 수율; 1.
- 검색을 통해 높은 활성을 갖으면서도 산지나 수확시기에따라 활성에 큰 차이를 보이지 않은 창출 중에서도 저농도에서도 높은 활성을 갖는 Tochimoto-Tenkaido사의 Lot No. 250496의 열수추출물(ALR-0)을 Scheme 1과 같이 용매별 분획을 실시하여 장관면역 활성획분을 조제하였다. 즉, ALR-0 획분을 용매별로 분획하여 메탄올-가용성 획분(ALR-1), 메탄올-불용성이며 에탄올-가용성 획분(ALR-2) 및 조다당획분 (ALR-3)을 얻었다.
- 동일종 마우스의 대퇴부 뼈를 이용하여 골수세포를 회수하는데, 즉 주사기를 이용하여 뼈 속으로 HBSS를 주입하여 골수세포를 시험관에 받은 후 상기와 같이 여과, 세척하여 2.5X105 cells/mL RPMI 1640-FBS로 세포농도를 조정하고 96- well plate에 100μL씩 분주하였다. 다음으로 위에서 얻은 골수세포 증식활성 측정용 상등액과 RPMI 1640-FBS을 각각 50 μL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양하였다.
- 잔사에는 다시 동량의 증류수를 첨가한 후 2회 반복 추출하고, 7,000rpm에서 30분간의 원심분리를 통해 불용성 침전물을제거하고 투석을 거친 후 동결건조하여 각각 천연물의 열수추출물로 하였다. 또한 10종의 천연물 열수추출물 중 활성이높았던 창출(ALR), 인삼(PG)과 황귀 (ASR)는 생약의 산지와수확시기에 따라 활성의 차이가 있을 수 있기에 이를 검토하기 위해 재배조건에 따른 다양한 종류의 생약을 여러 회사로부터 구입하여 동일방법으로 열수추출물을 조제한 후 장관면역 활성을 비교 검토하였다.
- 5%) 과 비가용성 획분으로 분리되었다. 메탄올-비가용성 획분은증류수에 재용해시킨 후 4배의 에탄올을 첨가하고 12시간 교반, 원심분리하여 메탄올-불용성/에탄올-가용성 획분(ALR-2, 수율; 0.2%)을 분리하고 침전물은 증류수에 재용해시키고, 투석 후 원심분리, 농축, 동결건조를 거쳐 조다당 획분(ALR-3, 수율; 5.3%)으로 조제하였다.
- 9) 20mL을 첨가하고 37℃에서 48시간 소화시켰다. 반응은 0.1 N HCl로 중지시키고 투석, 동결건조하여 ALR- 3의 단백질 분해물(pronase-digested ALR-3, 수율; 79.3%)로조제하였다.
- 100)를 patch 위에 올려놓은 다음, 주사기 고무마개로 눌러 조직을 파괴하여 Peyer's patch로부터 세포를 방출시켰다. 세포현탁액을 금속체 (No. 200)로 여과한 후 RPMI 1640-FBS(5% FBS 함유된 RPMI- 1640)로 세척하고 2x106 cells/mL RPMI 1640-FBS로 세포 농도를 조정한 후 96-well plate에 180μL씩 분주하고 활성을 측정하고자 하는 시료를 적당한 농도로 희석하여 2OμL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후 상등액을 회수하여 골수세포 증식활성 측정용으로 사용하였다.
- 첨가하였다. 이 혼합액을 70℃에서 색깔이 변할 때까지 반응시킨 후 3M NaOH로 중화시키고 투석, 동결건조하여 ALR-3의 NaClO2 처리물(chlorite-treated ALR-3, 수율; 50.7%)로 조제하였다.
- 50)를 이용하여 상등액과 잔사로 분리하였다. 잔사에는 다시 동량의 증류수를 첨가한 후 2회 반복 추출하고, 7,000rpm에서 30분간의 원심분리를 통해 불용성 침전물을제거하고 투석을 거친 후 동결건조하여 각각 천연물의 열수추출물로 하였다. 또한 10종의 천연물 열수추출물 중 활성이높았던 창출(ALR), 인삼(PG)과 황귀 (ASR)는 생약의 산지와수확시기에 따라 활성의 차이가 있을 수 있기에 이를 검토하기 위해 재배조건에 따른 다양한 종류의 생약을 여러 회사로부터 구입하여 동일방법으로 열수추출물을 조제한 후 장관면역 활성을 비교 검토하였다.
- 5) 40mL을 첨가하고 암실, 4℃에서 96시간 교반하였다. 잔여 periodate를 제거하기 위해 ethylene glycol을 첨가하고 투석을 행하여 얻은 비투석액에 NaBIL를 첨가하여 환원시키고 초산으로 중화 후 투석, 동결건조하여 ALR-3의 NaIO4 산화물(periodate-oxidized ALR-3, 수율; 62.2%)을 조제하였다.
- 장관면역 활성검색을 위한 각종 천연물의 열수추출물 조제 십전대보탕의 10종의 구성 천연물 20 g에 각각, 증류수 400mL을 첨가하고 증류수가 반으로 감소될 때까지 추출한 후금속체(No. 50)를 이용하여 상등액과 잔사로 분리하였다. 잔사에는 다시 동량의 증류수를 첨가한 후 2회 반복 추출하고, 7,000rpm에서 30분간의 원심분리를 통해 불용성 침전물을제거하고 투석을 거친 후 동결건조하여 각각 천연물의 열수추출물로 하였다.
- 장관면역 활성도 측정: 장관면역의 활성도는 시료와 Peyer's patch 세포와의 반응 후 회수한 상등액을 골수세포와 반응 시켜 골수세포가 증식되는 정도로서 나타내는데, 증식도 측정은 Alamar BIuem의 형광시약이 살아 있는 골수세포의 전자전달계에서 방출되는 전자에 의해 환원되어 발색되는 측정법을 사용하였다(18). 즉, 골수세포와 위의 배양 상등액과의 배양종료 12시간 전에 Alamar Blue™ 20μL를 첨가한 다음 형광 도를 SPECTRAHuor Plus(TECAN Co.
- 따라 측정하였다. 즉 C3H/HeJ 마우스 (5-7주, 암컷)의 소장벽 상에 존재하는 Peyer's patch를 조심스럽게 잘라내어 Hank's balanced salt solution(HBSS)이 담겨진 petri dish에 옮기고 금속체(No. 100)를 patch 위에 올려놓은 다음, 주사기 고무마개로 눌러 조직을 파괴하여 Peyer's patch로부터 세포를 방출시켰다. 세포현탁액을 금속체 (No.
- 250496의 열수추출물(ALR-0)을 Scheme 1과 같이 용매별 분획을 실시하여 장관면역 활성획분을 조제하였다. 즉, ALR-0 획분을 용매별로 분획하여 메탄올-가용성 획분(ALR-1), 메탄올-불용성이며 에탄올-가용성 획분(ALR-2) 및 조다당획분 (ALR-3)을 얻었다. 이러한 획분들에 대하여 장관면역 활성을 측정한 결과(Fig.
- . 즉, 골수세포와 위의 배양 상등액과의 배양종료 12시간 전에 Alamar Blue™ 20μL를 첨가한 다음 형광 도를 SPECTRAHuor Plus(TECAN Co. Ltd., Austria)을이용하여 excitation 544 nm와 emission 590nm에서 즉정하여,생리식염수를 시료 대신 사용한 대조구와 골수세포의 증식도를 비교하여 정량화하였다.
- 창출의 열수추출물로부터 에탄올 침전에 의해 조제된 조다당 획분(ALR-3)의 활성물질을 검토하기 위하여 ALR-3을 NaIO4 산화, NaClO2 처리 및 단백질 분해효소인 pronase에의해 소화시킨 후 그 반응산물들에 대하여 활성을 비교 검토하였다. Fig.
- 1). 한편, 천연물의 경우에는 채취시기나 재배지에 따라 생리활성에 큰 차이를 보일 수 있기 때문에 본 실험에서도 활성이 높은 ALR, PG 및 ASR에 관하여 그 수확시기나 산지가다른 여러 종류의 생약에 관하여 육종조건에 따른 활성과의관계를 비교 검토하였다.
대상 데이터
- Ltd.(Osaka, Japan)로 부터 구입하여 사용하였으며 (Table 2), 시료로 사용한 모든 생약의 표본은 고려대 생명공학원 식품가공학연구실에 보관하였다. 한편, 활성측정에 사용된 RPMI-1640 medium과 Hank's balanced salt solution(HBSS)은 Gibco사(Grand Island, NY) 로부터 구입하였고 fetal bovine serum(FBS)는 Cell Culture Lab.
- 한편, 활성측정에 사용된 RPMI-1640 medium과 Hank's balanced salt solution(HBSS)은 Gibco사(Grand Island, NY) 로부터 구입하였고 fetal bovine serum(FBS)는 Cell Culture Lab. 사(Cleveland, OH), penicillin, streptomycin 과 amphotericin B는 Flow Lab/Rlrvine, Scotland)로부터 구입하여 사용하였다. 또한 골수세포 증식을 측정하는 형광시약인 Alamar Blue™은 Alamar Bio-Sciences Inc.
데이터처리
- 실험결과들은 평균치 ± S.D.(standard deviation)로 나타내었고 student t-test를 이용, 통계처리하여 p<0.05 혹은 p<0.01수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- : Yamada 등의 방법(16)에 의거하여 측정하였는데 , 즉 조다당 획분(ALR-3) 50 mg에 25 mM NalQ가 함유된 50 mM acetate buffer(pH 4.5) 40mL을 첨가하고 암실, 4℃에서 96시간 교반하였다. 잔여 periodate를 제거하기 위해 ethylene glycol을 첨가하고 투석을 행하여 얻은 비투석액에 NaBIL를 첨가하여 환원시키고 초산으로 중화 후 투석, 동결건조하여 ALR-3의 NaIO4 산화물(periodate-oxidized ALR-3, 수율; 62.
- 시료와 Peyer's patch 세포와의 반응: 장관면역 활성은 Hong 등의 방법에(15) 따라 측정하였다. 즉 C3H/HeJ 마우스 (5-7주, 암컷)의 소장벽 상에 존재하는 Peyer's patch를 조심스럽게 잘라내어 Hank's balanced salt solution(HBSS)이 담겨진 petri dish에 옮기고 금속체(No.
성능/효과
- 한편이러한 활성을 가진 생약(ALR, PG와 ASR) 중에서도 특히 ALR만이 종류, 생산지 및 육종조건에 관계없이 항상 일정하게 높은 활성을 보여주어 창출의 열수추출물 획분(ALR-0)이십전대보탕의 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 시료로 선정되었다. ALR-0 획분은 다시 용매별로 분획되어 메탄올-가용성 획분(ALR-1), 메탄올-불용성/에탄올-가용성 획분(ALR- 2) 및 조다당 획분(ALR-3)으로 조제되었으며 이들의 활성을측정한 결과, 단지 ALR-3 획분만이 Peyer's patch를 통한 골수세포의 증식을 활성화시키는 장관면역 활성을 시료농도에의존적으로 나타내었으며 그 외의 획분에는 활성이 거의 없었다. 한편 ALR-3 획분을 NaIO4, NaCl2 및 pronase로 처리한 후 활성을 측정한 결과, 모든 처리군에서 활성이 감소되었으며 특히 periodate 산화에 의해 심한 활성감소를 보였다.
- Fig. 6에서 보이는 것처럼 모든 처리군에서 ALR- 3의 활성이 감소하였는데 특히 periodate 산화가 가장 많은감소를 보였다. Periodate는 당의 구조에서 인접한 hydroxyl 기를 갖는 탄소와 탄소사이를 산화시키는 특성을 갖고 있으므로(23)활성에 중요하게 관여하는 물질이 당류일 가능성을높게 해주고 있으며, 결과적으로 다당류의 당 구조가 파괴되어 활성이 감소한 것으로 생각된다.
- 3). 그러나 ASR과 PG7} 이런 경향을 보이는 것과는 달리 ALRe 시료에 관계없이 높은 활성을 보여주었으며(Fig. 3), 특히 Tochimoto-Tenkaido사의 Lot No. 250496의 창출은 시료농도 100㎍/mL에서 뿐만 아니라 50㎍/mL의 농도에서도 높은 활성을 갖음을 알 수 있었다. 한편, 십전대보탕의 구성생약 중 장관면역 활성이 가장 우수한 것으로 선정된 이와 같은 창출은 digestive medicine이나 tonic으로 사용되고 있는 한약의 구성생약으로, 한방에서는 건조한 성질을 가지고있어서 위장을 보호하는 역할을 하고 설사를 멎게하며 바람과 습기로 온몸이 저리고 배가 더부룩해지는 것을 치료하는것으로 알려진 생약이다.
- 4), 25 ㎍/mL의 낮은 농도에서 ALR-3의 획분만이 십전대보탕의 열수추출물이나 ALR-0 획분 보다 높은 활성을 보였고 그 외 획분들에서는 활성이 거의 없었다. 또한 시료농도를 0부터 100|ig/mL까지 변화시키면서 각 획분들의 활성을 검토한 결과(Fig. 5)에서도 ALR-3 획분만이첨가되는 시료농도의 증가에 따라 활성이 증가되었으며 다른 획분에서는 활성이 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 ALR-0 획분의 장관면역 활성은 저분자 물질들이 주로 추출되는 메탄올이나 에탄올의 획분보다는 에탄올 첨가에 의해고분자류가 대부분 침전되는 조다당 획분인 ALR-3 중의 물질에 장관면역 활성이 기인하고 있는 것으로 생각된다.
- 산지의 차이에 따라 다양한 Lot No.를 갖은 창출 (ALR), 인삼(PG), 황기(ASR)의 열수추출물에 대하여 활성을 검토한 결과, 큰 활성의 차이를 보이고 있어 수확시기나 산지에 따라 활성물질의 함유량에 변화가 있음을 시사하였다.
- 십전대보탕의 10가지 구성 천연물을 열수추출하여 장관면역 활성을 비교 검토한 결과, 창출(Atracylodes lancea DC., ALR)과 인삼(Rmax ginseng C.A. Meyer, PG)에서는 높은 활성을 나타내었으나 약한 활성을 갖는 황기 (AsfragMs mem- branacues, ASR)와 당귀(Angelica aculiloba Kitagawa, AR)를제외하고는 어떤 생약에서도 거의 활성을 갖지 않았다. 한편이러한 활성을 가진 생약(ALR, PG와 ASR) 중에서도 특히 ALR만이 종류, 생산지 및 육종조건에 관계없이 항상 일정하게 높은 활성을 보여주어 창출의 열수추출물 획분(ALR-0)이십전대보탕의 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 시료로 선정되었다.
- 5)에서도 ALR-3 획분만이첨가되는 시료농도의 증가에 따라 활성이 증가되었으며 다른 획분에서는 활성이 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 ALR-0 획분의 장관면역 활성은 저분자 물질들이 주로 추출되는 메탄올이나 에탄올의 획분보다는 에탄올 첨가에 의해고분자류가 대부분 침전되는 조다당 획분인 ALR-3 중의 물질에 장관면역 활성이 기인하고 있는 것으로 생각된다. 또한 지금까지 창출로부터는 sesquiterpenoids, triterpenoids와 acetylene 유도체 같은 저분자 물질들이 Na+, KFTPase의 저해 활성, anti-gastric ulcer 활성 및 neuromuscle connection의 저해활성을 갖는 것으로 보고되어(19~21) 있는 반면에, 생리활성을 갖는 고분자 물질은 Tominaga 등의(끄) 창출 고분자획분이 MMC-induced myelosuppression에 대하여 예방적인 효과가있다는 보고 이외에는 거의 없는 실정으로 고분자 물질의 생리활성을 밝힌다는 점에서 본 실험의 또 다른 의의가 있다고 하겠다.
- 한편 ALR-3 획분을 NaIO4, NaCl2 및 pronase로 처리한 후 활성을 측정한 결과, 모든 처리군에서 활성이 감소되었으며 특히 periodate 산화에 의해 심한 활성감소를 보였다. 이러한 결과를 토대로 십전대보탕의 장관면역 활성은 10종의 생약 중에서도 특히 창출이 중요하게 활성에 관여하는 것으로 보이며 다양한 용매별 분획을 통해 저분자보다는 에탄올에 침전된 고분자가 주요 함유물질인 조다당 획분이 장관면역 활성에 관여하는 것으로 추정되었다. 또한 periodate 산화에 의해 활성이 크게 감소되는 것으로 보아 주로 다당류가 창출의 장관면역에 중요한 활성물질인 것으로 생각된다.
- 즉, ALR-0 획분을 용매별로 분획하여 메탄올-가용성 획분(ALR-1), 메탄올-불용성이며 에탄올-가용성 획분(ALR-2) 및 조다당획분 (ALR-3)을 얻었다. 이러한 획분들에 대하여 장관면역 활성을 측정한 결과(Fig. 4), 25 ㎍/mL의 낮은 농도에서 ALR-3의 획분만이 십전대보탕의 열수추출물이나 ALR-0 획분 보다 높은 활성을 보였고 그 외 획분들에서는 활성이 거의 없었다. 또한 시료농도를 0부터 100|ig/mL까지 변화시키면서 각 획분들의 활성을 검토한 결과(Fig.
- ALR-0 획분은 다시 용매별로 분획되어 메탄올-가용성 획분(ALR-1), 메탄올-불용성/에탄올-가용성 획분(ALR- 2) 및 조다당 획분(ALR-3)으로 조제되었으며 이들의 활성을측정한 결과, 단지 ALR-3 획분만이 Peyer's patch를 통한 골수세포의 증식을 활성화시키는 장관면역 활성을 시료농도에의존적으로 나타내었으며 그 외의 획분에는 활성이 거의 없었다. 한편 ALR-3 획분을 NaIO4, NaCl2 및 pronase로 처리한 후 활성을 측정한 결과, 모든 처리군에서 활성이 감소되었으며 특히 periodate 산화에 의해 심한 활성감소를 보였다. 이러한 결과를 토대로 십전대보탕의 장관면역 활성은 10종의 생약 중에서도 특히 창출이 중요하게 활성에 관여하는 것으로 보이며 다양한 용매별 분획을 통해 저분자보다는 에탄올에 침전된 고분자가 주요 함유물질인 조다당 획분이 장관면역 활성에 관여하는 것으로 추정되었다.
- 6%)을 나타내었다. 한편, 열수추출물의 활성을 측정한 결과, ALR과 PG의 경우에 시료농도 100㎍/mL에서 비교적 높은 활성이 나타날 뿐만 아니라 10㎍/mL의 낮은 농도에서도 대조군이나 다른 생약보다높은 활성을 갖음을 알 수 있었으며, ASIF AR에서도 약하지만 장관면역 활성이 대조군보다 높음을 보여주었다(Fig. 1). 그러나 그 외의 생약에서는 거의 활성을 보이지 않았으며 PC, CC와 RR 등에서는 오히려 대조군보다도 월등히 낮은골수세포의 증식상태를 보여주고 있는데 이는 열수추출물에세포독성을 갖는 물질이 함유되어 있는 것으로 추정된다(Fig.
후속연구
- 한편 pronase 처리에 의해서는 활성의 변화가 거의 일어나지 않았다. 이러한 결과로 미루어 ALR-3에 포함된 여러 물질 중 창출의 열수추출물의 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 고분자 획분의 활성물질은 단백질보다는 다당일 것으로 추정되며 이러한 활성물질을 밝히기 위하여 향후 조다당 획분의분획에 따른 정제와 구조분석이 필요하다고 생각된다.
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