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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 이처럼 높은 부가가치를 가진 제품의 원료이면서 과즙음료 제조공정 등에서 발생하는 폐자원의 활용이라는 산업적인 관점에서(22) 전신면역력의 조절에 큰 영향을 미치는 장관면역체계, 특히 Peyer's patch를 매개로 귤피로부터 골수세포의 증식 에 기여하는 물질을 분리, 정제하고 그 특성을 살펴, 이러한 소재를 활용한 기능성 식품의 개발에 보다 적극적인 연구와 기술개발의 필요성이 더욱 증대되도록 하고자 한다. 또한 지금까지 귤피로부터 생리 활성을 갖는 성 분으로 보고된 물질들은 대부분 저분자로서 그 함량이 극히 적 으나 귤피 의 상당량을 차지 하는 펙 틴등의 고분자 물질에 관하여는 거의 보고된 바 없는 실정으로 고분자 물질의 생리활성을 밝힌다는 점에서 본 실험의 또 다른 의의가 있다고 하겠다.
- 63)가 함유되어져 있었다(Table 1). 또한 이러한 구성당의 분석을 통하여 얻은 활성 획분인 CUI-3-Ub-3-2는 galacturonic acid간의 결합 및 galacturonic acid와 rhamnose간의 교호적인 결합으로 이루어진 주쇄(32)에 다양한 종류의 중성 당이 측쇄로 결합되어 있는, 특히 arabinose가 다량 함유된 펙틴계통의 다당류(33)일 것으로 추정되나, 보다 확실한 활성획분의 구조를 밝히기위해서는 효소 또는 화학적인 활성물질의 수식을 통한 활성본체의 구조분석(34)이 이루어져야만 하기 때문에 구조분석을 통하여 활성 본체를 구체적으로 밝히기 위한 연구를 진행하고 있다.
가설 설정
- 4) Values in parenthesis represent yield of each extract calculated from raw materials.
제안 방법
- 7%)로 조제하였다. CUIV-0은 다시 물에 용해한 후, EtOH을 첨가하여 교반하고 상등액 (CUIV-2, 수율; 1.0%)과 침전으로 분리한 후, 침전물은 증류수에 재용해하고 동결 건조하여 열수추출물의 조다당 획분(CUIV-3, 수율; 3.4%)으로 조제하였다. 한편, CUI-0은 MeOH로 1시간씩 3회 환류하고 원심 분리 하여 MeOH-가용성 획분(CUI-1, 수율; 9.
- 64)등으로 다당류가 구성되어있는 것으로 판명되었다(Table 1).DEAE-Sepharose FF의 0.2 M NaCl 용출액을 통하여 얻은 활성 획분인 CUI-3IIb에 대하여 Sepharose CL-6B column chromatography를 이용하여 gel filtratiori을 실시하여 3개의 획분(CUI-3HbT, 3IIb-2와 3Ub-3)을 얻었다(Fig. 5 A). 이들 획분에 대하여 장관면역 활성을 비교한 결과, CUI-3IIb-2(시료농도 100 ㎍/mL, 대조군의 1.
- Sepharose CL-6B를 통하여 얻은 활성 획분인 CUI-3IIb-2와- 3IIb-3 중에서 저농도에서 높은 활성(시료농도 10 ㎍/ mL, 대조군의 1.85배)(Fig. 4B)과 수율(원료의 1.02%)을 나타낸 ClH~3IIb-3에 대하여 Sephacryl S-200 column chro-matography를 시행하여 또 다른 3개의 획분(CUl-3IIb-3-l, 3IIb-3-2 및 3IIb-3-3)을 얻었으며(Fig 5B), 이들 획분에 대하여 장관며역 활성을 Peyer s patch를 매개로 하는 기작을 이용하는 지를 동시에 확인할 수 있는 활성방법을 통하여 비교하였다. 그 결과, CUI-3Ub-3-2에서 Peyer's patch-f- 매개로한 기작을 통하여 가장 높은 활성 (시료농도 100㎍/mL, 대조군의 1.
- 45배), 치자(L55배)가 각각의 용매 추출획분에서 최대 활성을 나타내었다. 각 용매별 선정 시료에 있어서 높은 활성을 지닌 시료들을 대상으로 다시 활성을 비교하여, 재현성이 우수하고 높은 수율(35.5%)과 최대 활성을 지닌 귤피를 최적시료로 선정하였으며 이에 대해 냉수, hexane, butanol, ethylacetate, EtOH, MeOH 및 열수 등 의용 매별 추출을 실시하여 각 획분에 대하여 활성을 비교한 결과, 수율(각각 36.1%, 1.0%, 3.1%, 1.1%, 4.3%, 5.2% 및 27.0%)과 활성 모두에서 귤피의 냉수추출물(시료농도 100㎍/mL, 대조군의 1.65배; 10 ㎍/mL, 1.48배 )이 가장 우수하였으므로 이를 원료로 장관면역 활성성분의 분리, 정제를 진행하였다(Fig. 2).
- 검색을 통해 높은 수율과 장관면역 활성을 가지고 있는 것으로 판명된 건조된 귤피를 대상으로 용매별 분획을 실시하여 장관면역 활성 획분을 조제하였다. 즉, 냉수추출물인 CUI-0와 열수추출물인 CUIV-0를 용매별로 분획하여 MeOH-가용성 획분(CUI-l), EtOH-가용성 획분(CUI-2 및 CUIV-2) 및 조다당 획분 (CUI-3과CUIV-3)를 얻었다.
- 1 M TFA로 100℃에서 1시간동안 가수분해시킨후 NaBd를 이용하여 중성 당의 경우와 유사한 조건으로 alditol acetate 유도체로 전환시켜 GLC를 실시하였다(27). 구성당 분석을 위한 GLC의 온도조건은 injector 250℃, detector 250℃이었고 columne 60℃에서 1분이 경과하면 30℃/분의 속도로 220℃ 까지 상승시킨후 12분간 유지하고 다시 8℃/분의 속도로 250℃까지 상승시켜 15분을 유지하는 조건이었으며, 표준당류의 retention time과 비교하여 시료 중의 구성당을 분석하였고 구성당의 mol%는 각 peak들의 면적비와 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산한후 molar ratio로 표기하였다.
- 귤피 냉수추출물의 조다당 획분인 CUI-3(1 g)을 증류수에 녹여 증류수로 평형화시킨 DEAE-Sepharose FF column(CP form, 4.0X30 cm)에 흡착시킨후 증류수, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 2.0 M NaCl 용액으로 차례로 용출시켜 각 획분을 투석, 농축 및 동결건조하여 4개의 획분, 즉 증류수용출획분(CUI-3I, 수율; 0.3%), 0.1 M NaCl 용출획분(CUI-3IIa, 수율; 0.5%), 0.2 M NaCl 용출획분(CUI-3IIb, 수율; 2.4%)과 0.3 M NaCl 용출획분(CUI-3IIc, 수율; 0.4%)을 얻었다. 이러한 획분들 중 가장 활성이 높은 CUI-3IIb에 대하여 0.
- 귤피의 냉수추출물로부터 획분의 조제시 장관면역 활성이 가장 높았던 조다당 획분, CUI-3에 대해 DEAE-Sephar-ose FF(C1- form) 를 이용한 ion exchange column chroma-tography를 실시하여 1 개의 비흡착 획분(CUI-3D과 3개의 흡착 획분(0.1 M NaCl 용출 획분; CUI-3IIa, 0.2 M NaCl 용출 획분; 3IIb와 0.3 M NaCl 용출 획분; 311c)으로 분리 하였고(data not shown), 이러한 획분에 대하여 장관면역 활성을 측정하였다. 그 결과(Fig.
- 동결건조한 각각의 전통차 및 죽류용 식물에 대하여 ho-mogenizer(Ultra-turrax T-50, Janke & Kunkel GmbH & Co., KG-IKA-Labortechnik, Staufen, Germany)로 5,000 rpm에서 5분, 6,000 rpm에서 5분, 7, 000 rpm에서 20분간 분쇄하고 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리한 후 그 상등액을 냉수추출물로 하였다. 침전물은 동결건조 후 다양한 용매의 극성도 순서에 따라 hexane, MeOH과 열수로 2시간씩 환류추출한 후 상등액을 동결건조하여 각각 hexane 추출물, MeOH추줄물 및 열수추줄물로 조제하였다.
- d×30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas-liquid chromatography (HP-6890 II GLC, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)로 구성당을 분석하였다. 또한 산성 당의 경우에 있어서는 0.1 M TFA로 100℃에서 1시간동안 가수분해시킨후 NaBd를 이용하여 중성 당의 경우와 유사한 조건으로 alditol acetate 유도체로 전환시켜 GLC를 실시하였다(27). 구성당 분석을 위한 GLC의 온도조건은 injector 250℃, detector 250℃이었고 columne 60℃에서 1분이 경과하면 30℃/분의 속도로 220℃ 까지 상승시킨후 12분간 유지하고 다시 8℃/분의 속도로 250℃까지 상승시켜 15분을 유지하는 조건이었으며, 표준당류의 retention time과 비교하여 시료 중의 구성당을 분석하였고 구성당의 mol%는 각 peak들의 면적비와 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산한후 molar ratio로 표기하였다.
- 침전물은 동결건조 후 다양한 용매의 극성도 순서에 따라 hexane, MeOH과 열수로 2시간씩 환류추출한 후 상등액을 동결건조하여 각각 hexane 추출물, MeOH추줄물 및 열수추줄물로 조제하였다. 또한 장관면역 활성 검색결과, 높은 활성을 보인 동결건조후 분쇄한 귤피에 대해서는 hexane, butanol, ethylacetate, EtOH, MeOH 및 증류수(냉수와 열수)등 극성도가 각각 0.0, 3.9, 4.3, 5.2, 6.6, 9.0인 다양한 용매에의해 2시간씩 환류추출하고, 상등액과 침전으로 분리한 후 상등액을 동결건조하여 각각의 용매 추출물로 제조하였다.
- 사료는 실험동물용 사료를(삼양사료, 인천), 물은 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며 환경은 항온, 항습조건(온도 22±0.5℃, 상대습도 55±5%) 및 인공 조명에서 명암교대 1일 12시 간씩 (오전 9시~오후 9시 )을 유지 하였다.
- 상등액은 냉수추출물(CUI-0, 수율; 33.8%)로 조제하기 위하여 동결 건조하였으며 , 잔사에 대해서는 동결건조 후 decoction 처리를 실시하고, 원심분리 및 여과하여 얻은 상등액을 투석, 감압농축 및 동결건조하여 열수추출물(CUIV-0, 수율; 15.7%)로 조제하였다. CUIV-0은 다시 물에 용해한 후, EtOH을 첨가하여 교반하고 상등액 (CUIV-2, 수율; 1.
- 즉, C3H/He 마우스의 소장벽 상에 존재하는 Peyer's patch를 조심스럽게 잘라내어 Hank's balanced salt solution(HBSS)이 담겨진 petri dish에 옮기고 조직을 파괴하여 Peyer's patch로부터 세포를 방출시킨다. 세포현탁액을 금속체 (No. 200)로 여과한후 RPMI 1640-FBS(5% FBS 함유된 RPMIT640)로 세척하고 2×106 cells/mL RPMI 1640-FBS로 세포농도를 조정한후 96-well plate에 180μL씩 분주하고 활성을 측정하고자하는 시료를 적당한 농도로 희석하여 20μL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한후 상등액을 회수하여 골수세포 증식활성 측정용으로 사용하였다. 골수세포는 동일종 마우스의 대퇴부 뼈를 이용하여 회수하였는데, 즉 주사기를 이용하여 뼈속으로 HBSS를 주입하여 골수세포를 시험관에 받은후 상기와 같이 여과, 세척하여 2.
- 4% 감소). 이러한 결과로 미루어 CUI-3에 포함된 여러 물질 중 귤피의 냉수추출물의 장관면역 활성에 중요하게 관여하는 고분자 획분의 활성 물질은 단백질보다는 다당일 것으로 추정되며 이러한 활성물질을 밝히기 위하여 조다당 획분의 정제를 진행하였다.
- 5) 50 mL를 첨가하고 암실, 4℃에서 96시간 교반하였다. 잔여 periodate를 제거하기 위해 ethylene glycol을 첨가하고 투석을 행하여 얻은 비투석액에 NaBJL를 첨가하여 환원시키고 초산으로 중화후 투석, 동결건조하여 CUI-3의 NalCh 산화물(periodate-ox-idized CUI-3, 수율; 64.9%)을 조제하였다.
- 장관면역 활성 다당류인 CUI-3IIb-3과 3IIb-3-2에 대하여 Shodex OHpak SB-805 column을 이용하여 HPLC를 시행하였다. CUI-3IIb-3에서는 4개의 peak로 이루어져 있음을 알 수 있었으나, Fig.
- 전통 차 및 죽류용 식물의 다양한 종류로부터 장관면역 활성 검색을 통해 최적의 시료로 선정된 귤피 1 kg에 대해 20배 부피의 증류수를 첨가하고 분쇄 , 교반한 후 7,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상등액과 잔사로 분리 하였다. 상등액은 냉수추출물(CUI-0, 수율; 33.
- 12%)를 얻었으며 장관면역 활성측정결과, CUI-3IIb-3-2가 가장 활성이 높았다. 정제된 활성 획분 CUI-3IIb-3-2의 순도를 확인하기 위하여 Shodex OHpak SB-805(8x300 mm, Showa Denko K. K., Tokyo, Japan) column이 장착된 Waters 2690 HPLC(Wa-ters, Milford, MA)를 0.2 M NaNO3 용액으로 용출시키면서 (0.5 mL/min) RKrefractive index) detector를 이용하여 행하였으며, 정제 다당의 분자량 측정을 위해 표준물질로 dex-tran T-2000(2X106), T-500, T-70 및 포도당을 사용하여 구한 표준곡선과 Kav값을 비교하여 측정하였다.
- 장관면역 활성도는 시료와 Peyer's patch 세포와의 반응후 회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 골수세포가 증식되는 정도로서 나타내는데, 증식도 측정은 Alamar BlueTM의 형광시약이 살아있는 골수 세포의 전자 전달계에서 방출되는 전자에 의해 환원되어 발색되는 측정법을 사용하였다(30). 즉, 골수세포와 위에서 얻은 배양 상등액과의 배양종료 12시간전에 Alamar BlueTM 20μL를 첨가한 다음 형광도를 SpectroFluor Plus(Tecan, Durham, NC)를 이용하여 excitation 544 nm와 emission 590 nm에서 측정하여, 생리식 염수를 시료대신 사용한 대조구와 골수 세포의 증식도를 비교하여 정량화하였다.
- 장관면역 활성 획분을 조제하였다. 즉, 냉수추출물인 CUI-0와 열수추출물인 CUIV-0를 용매별로 분획하여 MeOH-가용성 획분(CUI-l), EtOH-가용성 획분(CUI-2 및 CUIV-2) 및 조다당 획분 (CUI-3과CUIV-3)를 얻었다. 이러한 획분들에 대하여 장관면역 활성을 측정한 결과(Fig.
- , KG-IKA-Labortechnik, Staufen, Germany)로 5,000 rpm에서 5분, 6,000 rpm에서 5분, 7, 000 rpm에서 20분간 분쇄하고 원심분리하여 상등액과 침전물로 분리한 후 그 상등액을 냉수추출물로 하였다. 침전물은 동결건조 후 다양한 용매의 극성도 순서에 따라 hexane, MeOH과 열수로 2시간씩 환류추출한 후 상등액을 동결건조하여 각각 hexane 추출물, MeOH추줄물 및 열수추줄물로 조제하였다. 또한 장관면역 활성 검색결과, 높은 활성을 보인 동결건조후 분쇄한 귤피에 대해서는 hexane, butanol, ethylacetate, EtOH, MeOH 및 증류수(냉수와 열수)등 극성도가 각각 0.
- 4%)으로 조제하였다. 한편, CUI-0은 MeOH로 1시간씩 3회 환류하고 원심 분리 하여 MeOH-가용성 획분(CUI-1, 수율; 9.1%)과 비가용성 획분으로 분리한 후, 비가용성 획분은 다시 증류수에 녹이고 4배 부피의 EtOH을 가하여 다시 상등액 (CUI-2, 수율; 1.0%)과 침전으로 나누었고, 침전물에 대하여 투석, 농축 및 동결건조 과정을 거쳐 냉수추출물 조다당 획분(CUI-3, 수율; 4.9%)을.조제하였다 (Fig.
- 한편, 귤피의 냉수추출물로부터 EtOH 침전에 의해 조제된 조다당 획분(CUI-3)의 활성물질을 검토하기 위하여 CUI-3를 periodate(NaIO4)산화 및 단백질 분해효소인 pronase에 의해 소화시킨후 그 반응산물들에 대하여 활성을 비교 검토하였다. Table 2에서 보이는 것처럼 모든 처리군에서 CUI-3 의 활성이 감소하였는데, 특히 periodate 산화가 가장 많은 감소를 보였다(시료농도 100 ㎍/mL, CUI-3 활성의 46.
- , Tokyo, Japan)를 가하여 37℃에서 48시간 가수분해시켰다. 효소반응은 0.1 N HCl 로 중지시키고 투석 후 동결건조하여 CUI-3의 단백질 분해물(pronase-digested CUI-3, 수율; 78.4%)로 조제하였다(28).
대상 데이터
- DEAE-Sepharose FF, Sepharose CL-6B, Sephacryl S-200은 Pharmacia Biotech.(Uppsala, Sweden) 회사로부터 구입하여 사용하였으며 , 활성 측정 에 사용된 RPMI-1640 medium과 Hank's balanced salt solution(HBSS), fetal bovine se-rum(FBS) 등은 Gibco(Grand Island, NY, USA)의 제품을 사용하였다. 또한 penicillin-streptomycin5^ amphotericin B는 Flow Lab.
- 본 실험에 사용된 90여종의 전통차 및 죽류용 식물은 경동시장에서 구입하였거나 농협대학으로부터 공급받아 사용하였다. 한편, 장관면역 활성이 가장 높은 식물로서 성분 분리에 이용된 귤피는 제주산 온주밀감의 껍질로서, (주)한국신 과학기술센터(제주, 남제주군)에서 공급받아 사용하였다.
- 생후 5주령의 건강상태가 양호한 C3H/He의 암컷 마우스를 (주)대한실험동물센터(충북, 음성군)로부터 구입하여 사용하였다. 사료는 실험동물용 사료를(삼양사료, 인천), 물은 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였으며 환경은 항온, 항습조건(온도 22±0.
- 한편, 장관면역 활성이 가장 높은 식물로서 성분 분리에 이용된 귤피는 제주산 온주밀감의 껍질로서, (주)한국신 과학기술센터(제주, 남제주군)에서 공급받아 사용하였다. DEAE-Sepharose FF, Sepharose CL-6B, Sephacryl S-200은 Pharmacia Biotech.
데이터처리
- 실험 결과들은 평균치 ±SD(standard deviation)로 나타내었고 Student t-test를 이용, 통계처리 하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 1) The proliferation of bone marrow cells was measured by a fluorometric method, using the Alamar Blue™ reduction assay.
- 2) The proliferation of bone marrow cells was measured by a fluorometric method, using the Alamar Blue™ reduction assay.
- NaIO4 산화 : Yamada 등(28)의 방법에 의거하여 측정하였는데, 즉 조다당 획분(CUI-3) 50mg에 25 mM NalQ가 함유된 50 mM acetate buffer(pH 4.5) 50 mL를 첨가하고 암실, 4℃에서 96시간 교반하였다. 잔여 periodate를 제거하기 위해 ethylene glycol을 첨가하고 투석을 행하여 얻은 비투석액에 NaBJL를 첨가하여 환원시키고 초산으로 중화후 투석, 동결건조하여 CUI-3의 NalCh 산화물(periodate-ox-idized CUI-3, 수율; 64.
- 다음으로 위에서 얻은 골수세포 증식활성 측정용 상등액과 RPMI 1640-FBS를 각각 50μL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양한다. 장관면역 활성도는 시료와 Peyer's patch 세포와의 반응후 회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 골수세포가 증식되는 정도로서 나타내는데, 증식도 측정은 Alamar BlueTM의 형광시약이 살아있는 골수 세포의 전자 전달계에서 방출되는 전자에 의해 환원되어 발색되는 측정법을 사용하였다(30). 즉, 골수세포와 위에서 얻은 배양 상등액과의 배양종료 12시간전에 Alamar BlueTM 20μL를 첨가한 다음 형광도를 SpectroFluor Plus(Tecan, Durham, NC)를 이용하여 excitation 544 nm와 emission 590 nm에서 측정하여, 생리식 염수를 시료대신 사용한 대조구와 골수 세포의 증식도를 비교하여 정량화하였다.
- 장관면역 활성은 Hong 등(29)의 방법에 의거하여 측정 하였다. 즉, C3H/He 마우스의 소장벽 상에 존재하는 Peyer's patch를 조심스럽게 잘라내어 Hank's balanced salt solution(HBSS)이 담겨진 petri dish에 옮기고 조직을 파괴하여 Peyer's patch로부터 세포를 방출시킨다.
- 총당, 산성당 및 단백질 함량은 각각 galactose, galac-turonic acid 및 bovine serum albumin(BSA)을 표준 물질로하여 phenol-sulfuric acid법(23), m-hydroxybiphenyl(24)과 Lowry법 (25)으로 각각 정량하였다. 한편, 각각의 분리 및 정제단계에서 얻은 시료에 대하여 중성 당의 경우 Jones와 Albersheim(26)의 방법으로 2.
- Lowry법 (25)으로 각각 정량하였다. 한편, 각각의 분리 및 정제단계에서 얻은 시료에 대하여 중성 당의 경우 Jones와 Albersheim(26)의 방법으로 2.0 M TFA(trifluoroacetic acid)로 121℃에서 1.5시간 동안 시료를 가수분해시 킨 후 NaBH4를 이용하여 중성당을 alditol로 환원시키고, (CH3CO)2O를 이용하여 alditol acetate 유도체로 전환시 켜 SP-2380 col-umn(0.2 ㎛ film, 0.25 mm i.d×30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas-liquid chromatography (HP-6890 II GLC, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA)로 구성당을 분석하였다. 또한 산성 당의 경우에 있어서는 0.
성능/효과
- 90여종의 전통차 및 죽류용 식물재료로부터 조제된 각 식물의 냉수, hexane, MeOH 및 열수추출물의 약 320여종 획분을 대상으로 장관면역 활성을 검색한 결과, 냉수 추출물에서는 상대적인 활성에 있어서 귤피 (peels from C. unshiu),다시마(L.japonica), 둥글레 (P.japonicum), 탱자(P. trifoliata)등이 각각 대조구에 비하여 1.65, 1.76, 1.43과 1.52배(시료 농도 100 ㎍/mL)의 높은 활성을 보였으며 , 수율 또한 32.4%, 25.8%, 37.7%, 34.5%로 대체적으로 높은 편이었다. 또한 열수주줄물에 있어서는 구기자(L.
- 시행하였다. CUI-3IIb-3에서는 4개의 peak로 이루어져 있음을 알 수 있었으나, Fig. 6에서 보이는 것처럼 Sephacryl S-200 column chromatography를 통하여 얻은 활성 획분인 CUI~3IIb-3-2에서는 단일 peak로서의 homogeneous한 양상을 보여주어, 냉수추출물로부터 장관면역 활성 획분이 다양한 분획단계를 거치면서 정제되어 최종적으로 얻은 활성획분인 CUI-3IIb-3-2는 단일물질로 구성되어져 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 획분의 분자량은 dextran의 표준 물질을 기준으로 추정할때 약 18,000 Da의 다당류임을 알 수 있었다.
- Table 2에서 보이는 것처럼 모든 처리군에서 CUI-3 의 활성이 감소하였는데, 특히 periodate 산화가 가장 많은 감소를 보였다(시료농도 100 ㎍/mL, CUI-3 활성의 46.4%감소), Periodate는 당의 구조에서 인접한 hydroxyl기를 갖는 탄소와 탄소사이를 산화시키는 특성을 갖고 있으므로(31) 활성에 중요하게 관여하는 물질이 당류일 가능성을 높게 해주고 있으며, 결과적으로 다당류의 당구조가 파괴되어 활성이 감소된 것으로 생각된다. 한편, pronase 처리에 의해서는 활성 감소의 변화가 periodate 산화와 비교하여 상대적으로 크지 않았다(시 료농도 100 ㎍/mL, CUI-3 활성의 15.
- 3 M NaCl 용출 획분; 311c)으로 분리 하였고(data not shown), 이러한 획분에 대하여 장관면역 활성을 측정하였다. 그 결과(Fig. 4A), CUITIIb에서 가장 높은 활성(시료농도 100 ㎍/mL, 대조군의 1.79배)을 나타내었고 수율또한 가장 높았으며(원료의 2.4%), 이외의 획분들에서는 활성 이 그다지 높지 않았다. 활성 획분인 CUI-3IIb는 총당 60.
- 02%)을 나타낸 ClH~3IIb-3에 대하여 Sephacryl S-200 column chro-matography를 시행하여 또 다른 3개의 획분(CUl-3IIb-3-l, 3IIb-3-2 및 3IIb-3-3)을 얻었으며(Fig 5B), 이들 획분에 대하여 장관며역 활성을 Peyer s patch를 매개로 하는 기작을 이용하는 지를 동시에 확인할 수 있는 활성방법을 통하여 비교하였다. 그 결과, CUI-3Ub-3-2에서 Peyer's patch-f- 매개로한 기작을 통하여 가장 높은 활성 (시료농도 100㎍/mL, 대조군의 1.95배)을 나타내었으며, 이러한 결과는 장관 면역의 활성기작이 직접적으로 활성획분이 골수세포의 증식에 영향을 미치는 것이 아니고(시료농도 100 ㎍/mL, 대조군의 1.13배 ) Peyer's patch의 세포를 활성 성분이 자극한후 이러한 활성화된 세포에서 생산된 cytokine 및 lymphokine 류가 골수세포증식에 영향을 끼치는 것으로 추정할 수 있다(Table 3). 또한 CUI-3Hb-3-2는 CUI-3IIb-3에 비해 산성당 함량이 높게 나타나 총당 70.
- 13배 ) Peyer's patch의 세포를 활성 성분이 자극한후 이러한 활성화된 세포에서 생산된 cytokine 및 lymphokine 류가 골수세포증식에 영향을 끼치는 것으로 추정할 수 있다(Table 3). 또한 CUI-3Hb-3-2는 CUI-3IIb-3에 비해 산성당 함량이 높게 나타나 총당 70.1%와 산성당 60.6%로 이루어져있고, 단백질함량은 매우 낮았으며 (3.2%), 주구성 당으로서는 중성 당으로 arabinose, galactose, rhamnose를, 산성당으로서는 galacturonic acid와 glucoronic acid(molar ratio; L00:0.54:0.28:L45:0.63)가 함유되어져 있었다(Table 1). 또한 이러한 구성당의 분석을 통하여 얻은 활성 획분인 CUI-3-Ub-3-2는 galacturonic acid간의 결합 및 galacturonic acid와 rhamnose간의 교호적인 결합으로 이루어진 주쇄(32)에 다양한 종류의 중성 당이 측쇄로 결합되어 있는, 특히 arabinose가 다량 함유된 펙틴계통의 다당류(33)일 것으로 추정되나, 보다 확실한 활성획분의 구조를 밝히기위해서는 효소 또는 화학적인 활성물질의 수식을 통한 활성본체의 구조분석(34)이 이루어져야만 하기 때문에 구조분석을 통하여 활성 본체를 구체적으로 밝히기 위한 연구를 진행하고 있다.
- 6에서 보이는 것처럼 Sephacryl S-200 column chromatography를 통하여 얻은 활성 획분인 CUI~3IIb-3-2에서는 단일 peak로서의 homogeneous한 양상을 보여주어, 냉수추출물로부터 장관면역 활성 획분이 다양한 분획단계를 거치면서 정제되어 최종적으로 얻은 활성획분인 CUI-3IIb-3-2는 단일물질로 구성되어져 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 획분의 분자량은 dextran의 표준 물질을 기준으로 추정할때 약 18,000 Da의 다당류임을 알 수 있었다.
- 5 A). 이들 획분에 대하여 장관면역 활성을 비교한 결과, CUI-3IIb-2(시료농도 100 ㎍/mL, 대조군의 1.78배)와 3IIb-3(시료농도 100 ㎍/mL, L92배 )이 높은 활성을 나타내었다(Fig 4B). 이들 활성 획분은 각각 총당 65.
- 69배)을 보였고 그 외 획분들에서는 낮은 활성을 보여주었다. 이러한 결과는 CUI-0 획분의 장관면역 활성은 저분자 물질들이 주로 추출되는 MeOH이나 EtOH 획분보다는 EtOH 첨가에 의해 고분자류가 대부분 침전되는 조다당 획분인 CUI-3 중의 물질에 장관면역 활성이 기 인되고 있는 것으로 볼 수 있으며, 이러한 추정은 총당 45.6%, 산성당 40.7% 및 단백질 9.4%의 화학적 조성 및 주 구성 당이 arabinose, galacturonic acid, galactose, glucose, glucuronic acid 및 rhamnose(molar ratio; L00:0.53:0.45:0.28:0.28:0, 19)로 이루어져 있다는 분석 결과(Table 1)를 통하여 사실에 근접하고 있음을 보여주었다.
- 75)< 구성당으로 함유하고 있었다(Table 1). 이러한 결과로 미루어 CUI-3IIb-2는 중성당이 주 구성 물질인데 비하여 CUI-3IIb-3은 산성당이 활성 에 관여하는 물질로서 함유되어진 획분인 것으로 추정되었다.
- 한편 CUI- 3IIb-3-2는 Peyer's patch 를 경유하였을 때만 골수세포 증식활성을 나타내었으며 활성 물질 자체가 직접 골수세포 증식활성에 관여하지는 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 귤피의 장관면역 활성은 측쇄에 arabinose와 galactose 등의 중성당이 결합된 polygalacturonan 구조를 갖는 펙틴계통의 다당류에 기인하고 있음을 보여주었다.
- 4%)을 얻었다. 이러한 획분들 중 가장 활성이 높은 CUI-3IIb에 대하여 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sepharose CL-6B column(2.5×94 cm)에서 gel filtration chromatography를 실행하여 3개의 획분을 얻었으며 (CUI-3IIb-l, 0.17%; CUI-3IIb-2, 0.51%; CUI-3nb-3, 1.02%), CUI-3IIb-2와 3IIb-3에서 유의적인 활성을 나타내었으나 수율과 저농도에서 활성이 우세하였던 CUI-3IIb-3에 대하여 다시 0.2 M NaCl 용액으로 평형화된 Sephacryl S-200(1.7×82 cm)에서 gel filtration chromatog-rphay를 행하여 3개의 획분(CUI-3IIb-3-l, 0.13%; CUI-3IIb-3-2, 0.17%; CUI-3IIb~3-3, 0.12%)를 얻었으며 장관면역 활성측정결과, CUI-3IIb-3-2가 가장 활성이 높았다. 정제된 활성 획분 CUI-3IIb-3-2의 순도를 확인하기 위하여 Shodex OHpak SB-805(8x300 mm, Showa Denko K.
- 즉, 냉수추출물인 CUI-0와 열수추출물인 CUIV-0를 용매별로 분획하여 MeOH-가용성 획분(CUI-l), EtOH-가용성 획분(CUI-2 및 CUIV-2) 및 조다당 획분 (CUI-3과CUIV-3)를 얻었다. 이러한 획분들에 대하여 장관면역 활성을 측정한 결과(Fig. 3), 10㎍/mL 의 낮은 농도에서도 CUI-3의 획분만이 CUI-0 획분보다 높은 활성 (대조군의 1.69배)을 보였고 그 외 획분들에서는 낮은 활성을 보여주었다. 이러한 결과는 CUI-0 획분의 장관면역 활성은 저분자 물질들이 주로 추출되는 MeOH이나 EtOH 획분보다는 EtOH 첨가에 의해 고분자류가 대부분 침전되는 조다당 획분인 CUI-3 중의 물질에 장관면역 활성이 기 인되고 있는 것으로 볼 수 있으며, 이러한 추정은 총당 45.
- CUI-0는 MeOH-가용성 획분(CUIT), MeOH-불가용성이면서 EtOH-가용성 획분(CUI-2)과 조다당 획분(CUI-3)으로 분획되었다. 이러한 획분들중 CUI-3은 Peyer's patch 세포를 매개로 하는 골수세포 증식의 자극활성이 가장 높았으며 arabinose, galacturonic acid, galactose, glucose, glucuronic acid와 rhmanose(molar ratio; 1.00:0.53:0.45:0.28:0.28: 0.19) 등을 주요 구성당으로 함유하고 있었으며 소량의 단백질(9.4%)도 구성물질로 포함된 활성 획분임 이 밝혀졌다. CUI-3의 장관면 역활성은 pronase 및 periodate 처리에 의해 감소되 었으며 특히 periodate 산화는 CUI-3의 활성에 심각한 영향을 끼치는 것을 알 수 있었다.
- 2%)이 함유되어진 물질로 구성되어 있었다. 한편 CUI- 3IIb-3-2는 Peyer's patch 를 경유하였을 때만 골수세포 증식활성을 나타내었으며 활성 물질 자체가 직접 골수세포 증식활성에 관여하지는 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 귤피의 장관면역 활성은 측쇄에 arabinose와 galactose 등의 중성당이 결합된 polygalacturonan 구조를 갖는 펙틴계통의 다당류에 기인하고 있음을 보여주었다.
- 한편, 활성이 높았던 획 분들에 대해 각기 용매 별로 재추출하여 활성을 분석한 결과, 냉수추출물에서는 귤피와 탱자가 100 ㎍/mL(대조군의 1.65 배와 1.56배)과 10㎍/mL(1.52 배와 1.44배) 모두에서 높았으며 , 열수추출물에서는 둥글레(시료농도 100 ㎍/mL, 1.45배), 치자(L55배)가 각각의 용매 추출획분에서 최대 활성을 나타내었다. 각 용매별 선정 시료에 있어서 높은 활성을 지닌 시료들을 대상으로 다시 활성을 비교하여, 재현성이 우수하고 높은 수율(35.
- CUI-3의 장관면 역활성은 pronase 및 periodate 처리에 의해 감소되 었으며 특히 periodate 산화는 CUI-3의 활성에 심각한 영향을 끼치는 것을 알 수 있었다. 활성 획분으로서 당함량이 높은 CUI-3IIb-3-2는 DEAE~Sepharose FF, Sepharose CL-6B 및 Sephacryl S-200에 의해 귤피 냉수추출물의 조다당획분으로부터 정제되었으며 HPLC에 의해 분자량 약 18,000 Da의 단일 peak임을 확인하였다. CUI-3Hb-3-2는 주로 arabinose, galactose, rhamnose, galacturonic acid와 glucuronic acid(molar ratio; 1.
- 4%), 이외의 획분들에서는 활성 이 그다지 높지 않았다. 활성 획분인 CUI-3IIb는 총당 60.7 %, 산성 당 30.0% 및 단백질 14.3%로 구성된 다당류가 주성분인 물질로서, 주로 중성 당인 arabinose와 산성 당인 galac-turonic acid와 glucuronic acid(molar ratio; 1.00-1.39:0.64)등으로 다당류가 구성되어있는 것으로 판명되었다(Table 1).DEAE-Sepharose FF의 0.
후속연구
- 이러한 결과를 토대로 귤피의 냉수추출물로부터 장관면역 활성 성 분으로서 분리 , 정제된 다당류는 분자량 18,000 Da의 펙틴류임을 알 수 있었으며 향후 감귤산업의 부산물 이용이라는 측면에서 폐기되는 귤피를 이용하여 전신 면역계를 활성화할 수 있는 장관면역 활성 또는 항암제 치료시의 부작용으로 나타나는 골수세포의 증식 억제를 완화시 킬 수 있는 기능성 소재로서 식품 등에 이용가치가 클 것으로 예상되며 이를 위해 향후 활성본체의 규명 및 산업적인 적용에 필요한 다양한 문제점 등을 밝혀내는 것이 필요하리라고 생각된다.
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